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1、 操作方法1： 1. 催芽，播种于含灭菌土的育苗盘中，待4-5叶期为合适苗龄。 2. 将含有pTV00（带目的基因）和pBINTR6的农杆菌从-70℃冰箱取出，在含有Kan50 mg/L、Rif100 mg/L和Tet 5mg/L的LB/YEB固体培养基上划线培养，28℃，48h。挑取单一菌落在含有Kan50 mg/L、Rif100 mg/L 和Tet5mg/L 的LB/YEB液体培养基中转速250 r/min，温度28℃，培养OD值约0.6-0.8。（大于24h？） 3. 取含有pTV00和pBINTR6的农杆菌GV3101 1：1混合，6000 r·min-1离心10m
2、in，弃去培养基，加入等体积MMA缓冲液，再将菌液室温下放置3h。 4. 拔出幼苗，剪去根尖，用菌液浸泡根5min。定植。用不带针头的注射器，将步骤3中准备好的混合菌液从嫩叶背面注射进叶片（约5ml/株）。剩余菌液灌根。 将注射后的植株放置在温度16℃的培养箱内，黑暗培养，50%RH，24h。 放置在温度低于24℃的培养箱内（20～22℃），光照16/8，50%RH。 5. 结果观察，14d后正对照（PDS基因沉默）植株新叶会出现光漂白现象，负对照无任何现象发生。 6. 14天后，接种南方根结线虫200条/株。（30天） 7. 接种30天后，观察统计卵块根结数量。 5月23日
3、 处理数：黄瓜、番茄各7个。5个带目的基因的pTV00载体菌株，1个正对照连接PDS基因的pTV00载体菌株，1个负对照空的pTV00载体菌株。 苗数：280株。每个处理20株，每个处理共140株。 处理液：每个处理500ml，其中浸根150ml/30株，注射5ml×30株，误差200ml。其中，目的基因菌液/MMA各250ml。 则，含目的基因的农杆菌GV3101菌液量共250ml×7；含有pBINTR6的农杆菌GV3101菌液量1750ml （250ml×7个处理）。 培养基质：草炭过筛，与蛭石、珍珠岩1：1：1混和。 MMA缓冲液 （10mmol/L MgCl
4、2；150μmol/L 已酰丁香酮；1mmol/L 2-N-吗啉基乙磺酸MES） 储存液配制 500mmol/L MgCl2·6H2O（50×）：10.1g MgCl2·6H2O固体溶于100mL蒸馏水中。 100mmol/L MES（10×）：1.952gMES固体溶于100mL蒸馏水中。 74mmol/L 已酰丁香酮（AS）（500×）：145mg已酰丁香酮溶于10mL无水乙醇。 工作液配制（100mL） 500mmol/L MgCl2·6H2O（50×）2mL 100mmol/L MES（10×）10mL 加入蒸馏水至100mL，过滤灭菌存于4℃冰
5、箱，用之前加入74mmol/L已酰丁香酮（AS）（500×）0.2mL（或直接加AS 29mg/L工作液） pTV00 Key to sequence annotation; www.ayeaye.tsl.ac.uk Green plasmid backbone sequence Blue sequence inserted to the pTV00 or pGR107 vectors Red CaMV 35S promo
6、ter sequence UPPER-CASE tobravirus cDNA sequence Violet Nopaline synthase terminator sequence UPPER-CASE AND BOLD Arabidopsis NIA1-intron 3 sequence Lower-case and bold CaMV35S terminator sequence Dark green
7、 Tobacco rattle virus genes for coat protein（CP） nptI 1 TTTTTATCCC CGGAAGCCTG TGGATAGAGG GTAGTTATCC ACGTGAAACC GCTAATGCCC 61 CGCAAAGCCT TGATTCACGG GGCTTTCCGG CCCGCTCCAA AAACTATCCA CGTGAAATCG 121 CTAATCAGGG TACGTGAAAT CGCTAATCGG AGTACGT
8、GAA ATCGCTAATA AGGTCACGTG 181 AAATCGCTAA TCAAAAAGGC ACGTGAGAAC GCTAATAGCC CTTTCAGATC AACAGCTTGC 241 AAACACCCCT CGCTCCGGCA AGTAGTTACA GCAAGTAGTA TGTTCAATTA GCTTTTCAAT 301 TATGAATATA TATATCAATT ATTGGTCGCC CTTGGCTTGT GGACAATGCG CTACGCGCAC 361 CGGCTCCGCC CGTGGACAAC CGCAAGCGGT TGCCCACCGT
9、CGAGCGCCAG CGCCTTTGCC 421 CACAACCCGG CGGCCGGCCG CAACAGATCG TTTTATAAAT TTTTTTTTTT GAAAAAGAAA 481 AAGCCCGAAA GGCGGCAACC TCTCGGGCTT CTGGATTTCC GATCCCCGGA ATTAGATCTC 541 AAACAAACAC ATACAGCGAC TTAGTTTACC CGCCAATATA TCCTGTCAAG GCCTTCATGT 601 TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACC
10、GCCTTT GAGTGAGCTG 661 ATACCGCTCG CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG 721 AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC 781 ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC 841 TCACTCATTA GGCACCCCAG GCTTTACACT TTATGCTTCC GGCTCGTA
11、TG TTGTGTGGAA 901 TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATGATTAC GCCAAGCTCG 961 GAATTAACCC TCACTAAAGG GAACAAAAGC TGGAGCTCCA CCGCGGTGGA GCTCCACCGG 1021 GGAAACCTCC TCGGATTCCA TTGCCCAGCT ATCTGTCACT TTATTGAGAA GATAGTGGAA 1081 AAGGAAGGTG GCTCCTACAA ATGCCATCAT TGCGATAAAG GAAAGGCCAT C
12、GTTGAAGAT 1141 GCCTCTGCCG ACAGTGGTCC CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAGCAT CGTGGAAAAA 1201 GAAGACGTTC CAACCACGTC TTCAAAGCAA GTGGATTGAT GTGATATCTC CACTGACGTA 1261 AGGGATGACG CACAATCCCA CTATCCTTCG CAAGACCCTT CCTCTATATA AGGAAGTTCA 1321 TTTCATTTGG AGAGGCTAGA TAAAACATTG CACCTATGGT GTTGCCCTGG CTGGG
13、GTATG 1381 TCAGTGATCG CAGTAGAATG TACTAATTGA CAAGTTGGAG AATACGGTAG AACGTCCTTA 1441 TCCAACACAG CCTTTATCCC TCTCCCTGAC GAGGTTTTTG TCAGTGTAAT ATTTCTTTTT 1501 GAACTATCCA GCTTAGTACC GTACGGGAAA GTGACTGGTG TGCTTATCTT TGAAATGTTA 1561 CTTTGGGTTT CGGTTCTTTA GGTTAGTAAG AAAGCACTTG TCTTCTCATA CAAAGGAAA
14、A 1621 CCTGAGACGT ATCGCTTACG AAAGTAGCAA TGAAAGAAAG GTGGTGGTTT TAATCGCTAC 1681 CGCAAAAACG ATGGGGTCGT TTTAATTAAC TTCTCCTACG CAAGCGTCTA AACGGACGTT 1741 GGGGTTTTGC TAGTTTCTTT AGAGAAAACT AGCTAAGTCT TTAATGTTAT CATTAGAGAT 1801 GGCATAAATA TAATACTTGT GTCTGCTGAT AAGATCATTT TAATTTGGAC GATTAGACTT 1
15、861 GTTGAACTAC AGGTTACTGA ATCACTTGCG CTAATCAACA TGGGAGATAT GTACGATGAA 1921 TCATTTGACA AGTCGGGCGG TCCTGCTGAC TTGATGGACG ATTCTTGGGT GGAATCAGTT 1981 TCGTGGAAAG ATTTGTTGAA GAAGTTACAC AGCATAAAAT TTGCACTACA GTCTGGTAGA 2041 GATGAGATCA CTGGGTTACT AGCGGCACTG AATAGACAGT GTCCTTATTC ACCATATGAG 2101
16、 CAGTTTCCAG ATAAGAAGGT GTATTTCCTT TTAGACTCAC GGGCTAACAG TGCTCTTGGT 2161 GTGATTCAGA ACGCTTCAGC GTTCAAGAGA CGAGCTGATG AGAAGAATGC AGTGGCGGGT 2221 GTTACAAATA TTCCTGCGAA TCCAAACACA ACGGTTACGA CGAACCAAGG GAGTACTACT 2281 ACTACCAAGG CGAACACTGG CTCGACTTTG GAAGAAGACT TGTACACTTA TTACAAATTC 2341 GA
17、TGATGCCT CTACAGCTTT CCACAAATCT CTAACTTCGT TAGAGAACAT GGAGTTGAAG 2401 AGTTATTACC GAAGGAACTT TGAGAAAGTA TTCGGGATTA AGTTTGGTGG AGCAGCTGCT 2461 AGTTCATCTG CACCGCCTCC AGCGAGTGGA GGTCCGATAC GTCCTAATCC CTAGGGATTT 2521 AAGGACGTGA ACTCTGTTGA GATCCTAGAA CTAGTGGATC CCCCGGGCTG CAGGAATTCG 2581 ATATCA
18、AGCT TATCGATACC GTCGACCTCG AGGGGGGGCC CGGTACCCAA TTCGCCCTAT 2641 AGTGAGTCGT ATTACGCGCG CTCACTGGCC GTCGTTTTAC AACGTCGTGA CTGGGAAAAC 2701 CCTGGCGTTA CCCAACTTAA TCGCCTTGCA GCACATCCCC CTTTCGCCAG CTGGCGTAAT 2761 AGCGAAGAGG CCCGCACCGA TCGCCCTTCC CAACAGTTGC TAAACTACGG TTCTTTAAGT 2821 AGATCCGTGC
19、 CTGAAGTTTT AGGTTCAATT TAAACCTACG AGATTGACAT TCTCGACTGA 2881 TCTTGATTGA TCGGTAAGTC TTTTGTAATT TAATTTTCTT TTTGATTTTA TTTTAAATTG 2941 TTATCTGTTT CTGTGTATAG ACTGTTTGAG ATCGGCGTTT GGCCGACTCA TTGTCTTACC 3001 ATAGGGGAAC GGACTTTGTT TGTGTTGTTA TTTTATTTGT ATTTTATTAA AATTCTCAAC 3061 GATCTGAAAA AGC
20、CTCGCGG CTAAGAGATT GTTGGGGGGT GAGTAAGTAC TTTTAAAGTG 3121 ATGATGGTTA CAAAGGCAAA AGGGGTAAAA CCCCTCGCCT ACGTAAGCGT TATTACGCCC 3181 TCGAGTATCG AATTCCTGCA GGCATGCAAG CGATCCCCGA TCGTTCAAAC ATTTGGCAAT 3241 AAAGTTTCTT AAGATTGAAT CCTGTTGCCG GTCTTGCGAT GATTATCATA TAATTTCTGT 3301 TGAATTACGT TAAGCAT
21、GTA ATAATTAACA TGTAATGCAT GACGTTATTT ATGAGATGGG 3361 TTTTTATGAT TAGAGTCCCG CAATTATACA TTTAATACGC GATAGAAAAC AAAATATAGC 3421 GCGCAAACTA GGATAAATTA TCGCGCGCGG TGTCATCTAT GTTACTAGAT CGGGAATTGC 3481 CAAGCTGCTT GGCACTGGCC GTCGTTTTAC AACGTCGTGA CTGGAAAACC CTGGCGTTAC 3541 CCAACTTAAT CGCCTTGCAG
22、CACATCCCCC TTTCGCCAGC TGGCGTAATA GCGAAGAGGC 3601 CCGCACCGAT CGCCCTTCCC AACAGTTGCG CAGCCTGAAT GGCGAATGGC GCGAAATTGT 3661 AAACGTTAAT GTTAACGTTA CACCACAATA TATCCTGCCA AGATCTCATG TGAGCAAAAG 3721 GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC 3781 GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAA
23、ATCGAC GCTCAAGTCA GAGGTGGCGA AACCCGACAG 3841 GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA 3901 CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC 3961 ATAGCTCACG CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG 4021 TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCG
24、CT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT 4081 CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA 4141 GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA 4201 CTAGAAGGAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG 4261 TTGGTAGCTC TTGATCCGGC AAACAAACCA C
25、CGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA 4321 AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG 4381 GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT TTTGGTCATG GTTACAACCA 4441 ATTAACCAAT TCTGATTAGA AAAACTCATC GAGCATCAAA TGAAACTGCA ATTTATTCAT 4501 ATCAGGATTA TCAATACCAT ATTTTTGAAA AAGCC
26、GTTTC TGTAATGAAG GAGAAAACTC 4561 ACCGAGGCAG TTCCATAGGA TGGCAAGATC CTGGTATCGG TCTGCGATTC CGACTCGTCC 4621 AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC GTCAAAAATA AGGTTATCAA GTGAGAAATC 4681 ACCATGAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA TGGCAAAAGT TTATGCATTT CTTTCCAGAC 4741 TTGTTCAACA GGCCAGCCAT TACGCTCGTC ATCAAAATC
27、A CTCGCATCAA CCAAACCGTT 4801 ATTCATTCGT GATTGCGCCT GAGCGAGACG AAATACGCGA TCGCTGTTAA AAGGACAATT 4861 ACAAACAGGA ATCGAATGCA ACCGGCGCAG GAACACTGCC AGCGCATCAA CAATATTTTC 4921 ACCTGAATCA GGATATTCTT CTAATACCTG GAATGCTGTT TTCCCTGGGA TCGCAGTGGT 4981 GAGTAACCAT GCATCATCAG GAGTACGGAT AAAATGCTTG AT
28、GGTCGGAA GAGGCATAAA 5041 TTCCGTCAGC CAGTTTAGTC TGACCATCTC ATCTGTAACA TCATTGGCAA CGCTACCTTT 5101 GCCATGTTTC AGAAACAACT CTGGCGCATC GGGCTTCCCA TACAATCCAT AGATTGTCGC 5161 ACCTGATTGC CCGACATTAT CGCGAGCCCA TTTATACCCA TATAAATCAG CATCCATGTT 5221 GGAATTTAAT CGCGGCCTGG AGCAAGACGT TTCCCGTTGA ATATGG
29、CTCA TAACACCCCT 5281 TGTATTACTG TTTATGTAAG CAGACAGTTT TATTGTTCAT GATGATATAT TTTTATCTTG 5341 TGCAATGTAA CATCAGAGAT TTTGAGACAC AACGTGGCTT TGTTGAATAA ATCGAACTTT 5401 TGCTGAGTTG AAGGATCAGA TCACGCATCT TCCCGACAAC GCAGACCGTT CCGTGGCAAA 5461 GCAAAAGTTC AAAATCACCA ACTGGTCCAC CTACAACAAA GCTCTCATCA
30、 ACCGTGCTCC 5521 CTCACTTTCT GGCTGGATGA TGGGGCGATT CAGGCGATCC CCATCCAACA GCCCGCCGTC 5581 GAGCGGGCT PTV00里的35s启动子序列与PBI121里的35s启动子序列不完全一致？ (5' to 3') SpeI, BamHI, SmaI, XmaI, HindIII, BspDI, ClaI, AccI, ApaI and KpnI. 内切酶图谱分析： List by Site Order 42 PmaCI
31、 1005 BstXI 2564 SmaI 3248 AflII 42 Eco72I 1011 EcoICRI 2572 PstI 3339 NsiI 94 BstD102I 1011 Ecl136II 2574 EcoRI 3419 BssHII 111 Eco72I 1013 SstI 2582 EcoRV 3443 BssHII 111 PmaCI
32、 1013 SacI 2586 HindIII 3579 PvuII 177 Eco72I 1179 BsiI 2593 ClaI 3610 XorII 177 PmaCI 1205 XmnI 2601 SalI 3610 PvuI 202 Eco72I 1208 BbvII 2607 XhoI 3629 MstI 202 PmaCI
33、 1208 Bsc91I 2609 SciI 3639 BglI 431 EagI 1211 Bsc91I 2620 ApaI 3663 AclI 431 Eco52I 1211 BbvII 2622 Acc65I 3673 HpaI 431 XmaIII 1245 EcoRV 2622 Asp718I 3675 AclI 433 Eco56I
34、1490 SspI 2626 KpnI 3701 BglII 435 XmaIII 1520 SunI 2656 BssHII 3814 DrdI 435 NaeI 1520 SplI 2750 PvuII 3879 BsiI 435 EagI 1593 Bsc91I 2781 XorII 4020 Alw44I 435 Eco52I 1
35、593 BbvII 2781 PvuI 4020 ApaLI 436 RleAI 1706 PacI 2851 AhaIII 4122 AlwNI 437 FseI 2078 Tth111I 2851 DraI 4254 Eco57I 489 BglI 2094 NdeI 2852 Eco57I 4579 PflMI 534 BglII
36、2159 Eco57I 2934 AhaIII 4638 VspI 591 StuI 2211 BsmI 2934 DraI 4727 NsiI 666 BstD102I 2229 SspI 2990 Eam1105I 4841 XorII 712 SapI 2274 ScaI 3108 ScaI 4841 PvuI 767 VspI 232
37、1 Bsc91I 3114 AhaIII 4880 BsmI 775 PvuII 2321 BbvII 3114 DraI 4914 SspI 826 VspI 2321 Bsp1407I 3162 SnaBI 4926 EcoNI 907 BstD102I 2428 XmnI 3180 XhoI 4957 BsmI 995 EcoICRI 2455
38、 PvuII 3182 SciI 4993 NsiI 995 Ecl136II 2485 PflMI 3190 EcoRI 5182 NruI 997 SstI 2510 AvrII 3200 PstI 5182 SpoI 997 SacI 2550 SpeI 3206 SphI 5317 BspHI 1002 Mlu113I 2556 B
39、amHI 3221 PvuI 5373 DraIII 1004 SacII 2562 XmaI 3221 XorII 5583 BstD102I 1004 SstII Restriction analysis on DNAMAN1 BamHI 1 G/GATCC 2556 SalI 1 G/TCGAC 2601 Fragments generated by digestion (bp): Circular DNA: Cut by BamHI : 5589 Cut by SalI : 5589 Double digestion: 45, 5544 Linear DNA: Cut by BamHI : 2556, 3033 Cut by SalI : 2601, 2988 Double digestion: 45, 2556, 2988
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