实验三细菌的革兰氏染色及显微镜油镜的使用.doc

实验三 细菌的革兰氏染色及显微镜油镜的使用

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。
显微镜各接物镜的放大率可由其外形辨认，镜头长度越大，镜片直径越小，放大倍数大；反之，放大倍数小。油镜头长低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线或白线，并刻有100×等字样。细菌体积微小，在细菌的形态学研究中，经常需要借助显微镜油镜，才能比较清楚地进行观察。

实验目的：掌握革兰氏染色的方法与油镜的使用方法
染色原理: 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物。
G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞，番红复染后呈红色。

油镜的使用原理：油镜的透镜很小，光线通过玻片与油镜头之间的空气时，因介质密度不同，发生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象显现不清。若在油镜与载玻片之间加入和玻璃折射率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515），则使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，使物象明亮清晰。

实验器材：大肠杆菌、枯草杆菌、染液、香柏油、二甲苯、显微镜等
染色步骤
1、涂片：
2、干燥：自然
3、固定：首先玻片要洗干净，然后在中间滴一滴菌液，涂匀，自然晾干，注意不要用火烤（变形）。干后方法是，快速在酒精灯上过3，4次固定，要使有菌的一面向上。
　　4、结晶盖涂面染1分钟。
　　5、水洗。
　　6、加碘液覆盖涂面媒染约1分钟。
　　7、水洗。
　　8、滴加95%酒精进行脱色，20秒，马上水洗。
9、番红染液覆盖涂面1分钟。
10、水冲。
11、干燥，油镜观察。
注意事项：
1、涂片不能过厚，以便于观察；
2、菌龄要适宜，枯草杆菌培养约18h,大肠杆菌24h。（对数期）
3、严格掌握脱色程度，关系本实验成败的关键步骤。

（二）油镜的使用
1、 取镜
2、对光
3、低倍镜、高倍镜找视野；
4、油镜观察：
（1）将油镜转至正下方、滴油；
（2）侧面看镜头下降至最低；
（3）左眼观察，右手调焦 （上升镜筒）；
（4）观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸擦油，用擦镜纸蘸二甲苯擦油，再用擦镜纸擦干净二甲苯；
（5）放好显微镜。

实验结果：革兰氏阳性细菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。