细胞培养工艺介绍.pptx

提纲提纲l为什么要培养细胞为什么要培养细胞l培养什么样的细胞培养什么样的细胞l如何培养细胞及培养过程的如何培养细胞及培养过程的注意事项注意事项为什么要培养细胞为什么要培养细胞生命科学的基本研究方法生命科学的基本研究方法l科学研究需要科学研究需要细胞是生物体的最小单位细胞是生物体的最小单位l工业生产的需要工业生产的需要细胞培养可以获得我们需细胞培养可以获得我们需要的药物、原料等要的药物、原料等单克隆抗体单克隆抗体 l市场快速增长市场快速增长l08年销售达年销售达167亿美元亿美元l已有近已有近20个产品个产品l超过超过150个在临床试验阶段个在临床试验阶段l主要是主要是CHO表达的，超过表达的，超过50现状现状l高需求量：数千公斤高需求量：数千公斤l国外水平：国外水平：1-10g/Ll国内水平：国内水平：1g/L培养何种细胞培养何种细胞l表达我们目的蛋白的细胞表达我们目的蛋白的细胞处理过处理过CHO细胞细胞基本概念基本概念lDNA染色体染色体遗传物质遗传物质l基因基因DNA片断片断l转录：转录：DNARNAl翻译：翻译：RNA蛋白质蛋白质构建表达特定产物的细胞株构建表达特定产物的细胞株l将特定产物的基因引入细胞中将特定产物的基因引入细胞中l长期稳定表达长期稳定表达l挑选克隆挑选克隆CHO阳性克隆阳性克隆将外源基因到入细胞内将外源基因到入细胞内l可选的细胞可选的细胞l构建的表达载体构建的表达载体l转染的方法转染的方法l克隆的挑选克隆的挑选l表达产物的检测表达产物的检测常用的表达细胞常用的表达细胞lCHOlNSOlSP2/0lHybridoma常用的表达体系常用的表达体系lGS表达系统lDHFR表达系统表达载体的作用表达载体的作用让细胞产生抗性让细胞产生抗性同时表达目的蛋白同时表达目的蛋白谷氨酰胺合成酶基因表达载体（谷氨酰胺合成酶基因表达载体（GS）l谷氨酰胺是细胞生命必需物质谷氨酰胺是细胞生命必需物质l部分细胞不能合成谷氨酰胺，或合成不部分细胞不能合成谷氨酰胺，或合成不足足l载体中含有谷氨酰胺合成酶的基因载体中含有谷氨酰胺合成酶的基因l在不含谷氨酰胺的培养基中，只有整合在不含谷氨酰胺的培养基中，只有整合了谷氨酰胺合成酶基因的细胞存活了谷氨酰胺合成酶基因的细胞存活l加入筛选剂加入筛选剂MSX，增加其表达量，增加其表达量二氢叶酸还原酶表达系统（二氢叶酸还原酶表达系统（DHFR）lDHFR是合成是合成dATP和和dGTP的关键酶的关键酶 l常用常用DHFR-的的CHO细胞不能合成四氢叶酸细胞不能合成四氢叶酸 l含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培养基含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培养基l在氨甲酰喋呤（在氨甲酰喋呤（methotrexate,MTX）存在下，）存在下，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白的表达水平，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白的表达水平，使外源基因高效表达使外源基因高效表达 转染方法转染方法l脂质体：融合细胞膜脂质体：融合细胞膜l磷酸钙：形成沉淀，细胞内吞磷酸钙：形成沉淀，细胞内吞l电穿孔：膜上打孔，自由出入电穿孔：膜上打孔，自由出入为什么要挑选克隆为什么要挑选克隆l稳定的种子稳定的种子l高效的种子高效的种子l经过验证的种子经过验证的种子克隆就是从一个细胞增克隆就是从一个细胞增殖形成的细胞群殖形成的细胞群细胞筛选方法获得单克隆细胞筛选方法获得单克隆l贴壁培养的克隆形成贴壁培养的克隆形成克隆环克隆环ClonePix FLCell Xpressl有限稀释法单克隆形成有限稀释法单克隆形成l流式细胞术筛选细胞流式细胞术筛选细胞Re-clonesubclone检测手段检测手段ldot-blotlELISAlSDS-PAGElWesternlFlow Cytometry Analysisdot-blotl上清l酶连抗体（1步或2步）l显色剂酶联免疫吸附试验（ELISA）l夹心法夹心法l包被抗体包被抗体l加上清加上清l酶联抗体酶联抗体l显色显色l读数读数SDS-PAGEl分子量与泳动距离分子量与泳动距离lSDS带电，与蛋白结合带电，与蛋白结合l染色：溴酚蓝、银染等染色：溴酚蓝、银染等l定性及定量检测定性及定量检测Westernl基于电泳基于电泳l转膜转膜l抗体及酶（同抗体及酶（同ELISA）l染色或发光染色或发光Flow Cytometry Analysisl抗体与细胞结合抗体与细胞结合l荧光物质连接抗体荧光物质连接抗体l激光诱发荧光激光诱发荧光l可检测上清或细胞可检测上清或细胞高表达克隆的确定高表达克隆的确定l构建表达载体构建表达载体l转染细胞转染细胞l单克隆单克隆l上述筛选上述筛选l重复克隆及筛选重复克隆及筛选l保留保留35个克隆个克隆如何培养细胞如何培养细胞无血清、悬浮培养无血清、悬浮培养培养细胞的方法培养细胞的方法l含血清培养含血清培养l无血清培养无血清培养价格便宜价格便宜品质稳定品质稳定生物污染少生物污染少减轻下游纯化负担减轻下游纯化负担贴壁变悬浮贴壁变悬浮贴壁贴壁 悬浮悬浮平面平面 立体立体血清替代血清替代l氨基酸氨基酸l维生素维生素l生长因子生长因子l微量元素微量元素l脂类成分脂类成分无血清培养基的分类无血清培养基的分类l无血清培养基无血清培养基l无蛋白培养基无蛋白培养基l化学成分限定型培养基化学成分限定型培养基l无血清、无蛋白、化学成分限定型培养基无血清、无蛋白、化学成分限定型培养基无动物源性成分无动物源性成分优化培养优化培养如何优化？l细胞株的选择细胞株的选择l培养条件优化培养条件优化l工艺调整工艺调整为什么要优化？为什么要优化？细胞株的选择细胞株的选择细胞株的选择细胞株的选择培养条件优化培养条件优化l主要是培养基的优化主要是培养基的优化l培养基的成分培养基的成分l培养基的使用方法培养基的使用方法优化考察指标优化考察指标生长状态生长状态优化考察指标优化考察指标生长曲线 表达水平优化效果优化效果工艺控制工艺控制l细胞状态的观察细胞状态的观察l工艺参数的设定工艺参数的设定l液体补充的控制液体补充的控制发酵模式发酵模式l批次培养批次培养l补料批次培养补料批次培养l连续灌注培养连续灌注培养培养放大培养放大l方瓶l摇瓶l小罐l大罐l优化空间优化空间培养控制培养控制l搅拌l通气l营养补充培养监控培养监控lpO2l温度温度l生化参数生化参数l营养消耗营养消耗l表达监控表达监控搅拌搅拌通气通气pH密度密度活率活率