单核细胞增生李斯特氏菌内化素InlJ对噬菌体敏感性及生物被膜形成的影响.pdf

198 2023,Vol.44,No.16 食品科学 生物工程单核细胞增生李斯特氏菌内化素InlJ对噬菌体敏感性及生物被膜形成的影响刘半红1,2，胡梁斌1，陆 睿2,3，吴立婷2，包红朵2，周 艳2，王 冉2，张 辉2,*（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，江苏 南京 210014；3.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）摘 要：为深入探索单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，Lm）inlJ基因在噬菌体敏感性和生物被膜中的作用及功能，本研究通过同源重组构建inlJ基因缺失株Lm NJ05-inlJ，鉴定其生长、黏附及侵袭特性，解析其对噬菌体敏感性和生物被膜形成中的作用机制。结果表明：与野生型Lm NJ05相比，构建的缺失株Lm NJ05-inlJ对RAW264.7细胞的黏附率和侵袭率分别为20.05%和4.42%，黏附和侵袭能力显著减弱；Lm NJ05-inlJ对李斯特菌噬菌体vB-LmoM-NJ05的成斑率提高至2.72 倍；体外裂解分析表明噬菌体vB-LmoM-NJ05对缺失株Lm NJ05-inlJ裂解效果更强；噬菌体效价分别在105 PFU/mL和108 PFU/mL能够完全抑制和清除Lm NJ05-inlJ生物被膜；生物被膜形成相关基因的转录分析表明，噬菌体作用缺失株Lm NJ05-inlJ后，degU、agrA、agrD、luxS、yneA、recA和hpt基因的转录均下调（表达水平趋向于0）。由此可见，inlJ基因的缺失能够增强Lm对噬菌体敏感性，下调Lm对细胞侵袭力和生物被膜形成能力。因此，内化素基因inlJ不仅具有调控Lm自身的作用，还能够调节其对噬菌体的相互作用，为噬菌体的生物防控技术开发和应用奠定基础。关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；内化素InlJ；噬菌体敏感性；细胞黏附和侵袭；生物被膜Effect of Internalin InlJ of Listeria monocytogenes on Phage Sensitivity and Biofilm FormationLIU Banhong1,2,HU Liangbin1,LU Rui2,3,WU Liting2,BAO Hongduo2,ZHOU Yan2,WANG Ran2,ZHANG Hui2,*(1.School of Food and Biological Engineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xian 710021,China;2.Jiangsu Key Laboratory for Food Quality and Safety-State Key Laboratory Cultivation Base of Ministry of Science and Technology,Institute of Food Safe and Nutrition,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China;3.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)Abstract:In order to explore the role and function of the inlJ gene of Listeria monocytogenes(Lm)in phage sensitivity and biofilm,the inlJ gene-deficient strain Lm NJ05-inlJ was constructed by homologous recombination.The growth,adhesion and invasion characteristics of the defective strain were identified.The results showed that compared with the wide-type strain Lm NJ05,the adhesion and invasion of RAW264.7 cells by Lm NJ05-inlJ were significantly reduced to 20.05%and 4.42%,respectively.The efficiency of plaque formation was enhanced by 2.72 folds and phage vB-LmoM-NJ05 had a stronger lytic activity on Lm NJ05-inlJ.Phage vB-LmoM-NJ05 at titers of 105 and 108 PFU/mL could completely inhibit and remove the biofilm of Lm NJ05-inlJ,respectively.Transcriptional analysis of biofilm formation-related genes showed that the transcriptional levels of the degU,agrA,agrD,luxS,yneA,recA and hpt genes were significantly decreased to nearly zero in the defective strain after interacting with phage vB-LmoM-NJ05.In conclusion,deletion of the inlJ gene can enhance the phage sensitivity of Lm,and down-regulate the ability of cell invasion and biofilm formation.Therefore,the inlJ gene not 收稿日期：2022-09-22基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2018YFE0101900）；江苏省农业科技自主创新资金项目（cx（21）1004）；江苏省重点研发计划项目（BE2022361）第一作者简介：刘半红（1998）（ORCID:0000-0003-1611-3571），女，硕士研究生，研究方向为食源性致病菌致病机制。E-mail:*通信作者简介：张辉（1978）（ORCID:0000-0002-6389-2988），女，研究员，博士，研究方向为致病微生物监测及生物防控技术开发。E-mail:H生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.16 199only regulate Lm but also affect its interaction with phage,which lays a foundation for the development and application of phage biocontrol.Keywords:Listeria monocytogenes;internalin InlJ;phage sensitivity;cell adhesion and invasion;biofilmDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220922-219中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）16-0198-07引文格式：刘半红,胡梁斌,陆睿,等.单核细胞增生李斯特氏菌内化素InlJ对噬菌体敏感性及生物被膜形成的影响J.食品科学,2023,44(16):198-204.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220922-219.http:/LIU Banhong,HU Liangbin,LU Rui,et al.Effect of internalin InlJ of Listeria monocytogenes on phage sensitivity and biofilm formationJ.Food Science,2023,44(16):198-204.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220922-219.http:/李斯特菌属（Listeria spp.）是一类能够引起动物和人李斯特菌病的革兰氏阳性细菌（G），其中单核细胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes，Lm）是最重要的食源性人兽共患病原菌，感染者主要表现为肠胃炎、流产、脑炎及脑膜炎等，住院率可达91%，死亡率20%30%，在新生儿中死亡率高达50%1。Lm在自然界中广泛分布，常存在于人和蠕虫类动物的肠道、土壤、水以及新鲜蔬菜中2，据美国FoodNet数据显示，20172020年间，Lm在全美共引发食品中毒事件553 起，病死率高达16.25%3。作为一种胞内寄生菌，Lm在感染过程中，侵入细胞的主要毒力因子是其表面的内化素引发的，通过内化素进入、生存并在吞噬和非吞噬细胞内呈指数增殖4。此外，Lm为了在环境中生存，通过形成丰富的生物被膜黏附于生物或非生物表面5，由于生物被膜具有特殊的多层立体结构，可作为细菌的保护机制，帮助细菌逃避机体免疫系统的清除和药物的杀灭6。已有研究表明，约80%细菌感染与生物被膜形成有关，60%食源性食物中毒暴发事件均是由食源性致病菌生物被膜引起7。内化素InlA是最早鉴定出与宿主细胞特异性受体结合介导Lm进入非吞噬细胞的毒力 因子8，比较基因组学发现内化素InlJ与内化素InlA结构相同9，C-末端包含Leu-ProX-Thr-Gly（LPXTG）基序元件，N-末端为LRR，通过分选酶Sort A识别共价结合到细胞壁肽聚糖上10。但有关InlJ功能的研究报道相对较少，目前仅有研究表明inlJ基因缺失可导致其毒力降低9，因而明确InlJ功能将有助于揭示拥有LPXTG及LRR结构域蛋白的新功能。Capestany等11发现牙龈卟啉单胞菌inlJ基因的缺失减少了生物被膜的形成，表明inlJ基因对生物被膜形成具有重要作用。噬菌体被视为细菌克星之一，能够有效裂解宿主菌并抑制生物被膜形成。研究表明，噬菌体能够很好地抑制和清除铜绿假单胞菌12、沙门氏菌13和大肠杆菌等生物被膜的形成，并在生物被膜相关的尿路感染、骨科感染和口腔感染14等得到很好地应用。肽聚糖是在革兰氏阳性细菌的细胞壁上发现的最丰富的糖聚合物，其介导噬菌体的相互作用15。InlJ是Lm细胞壁表面蛋白家庭成员，能够共价结合到细胞壁肽聚糖上，从而可能参与噬菌体与宿主的相互作用。为了进一步解析inlJ基因功能，本研究利用同源重组方法构建inlj基因缺失菌株，并对缺失株的生物学特性、噬菌体敏感性以及生物被膜形成进行研究，以期更有效地揭示inlJ基因在噬菌体与Lm相互作用中的调节功能。1 材料与方法1.1 材料与试剂Lm NJ05（1/2a血清型）和噬菌体vB-LmoM-NJ05均由江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地保存和鉴定分离鉴定并保存；pKSV7温度敏感型穿梭载体由扬州大学朱国强教授惠赠。琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒、细菌总RNA提取试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶 美国Thermo Fisher公司；DNA Marker、细菌基因组DNA提取试剂盒 北京擎科生物科技股份有限公司；氯霉素 上海源叶生物公司；牛脑心浸出液（brian heart infusion，BHI）养基 海博生物技术公司；逆转录试剂盒 南京诺唯赞生物科技有限公司。1.2 仪器与设备SM830立式压力蒸汽灭菌器 日本Yamato公司；SW-CJ-1F超净台 苏州真田洁净设备有限公司；Ultrospec-10-pro细胞密度计 美国Amersham Biosciences公司；PowerPac HC电泳仪、MicroPulserTM电穿孔仪、Universal Hood II凝胶成像系统、C1000Touch梯度聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；多功能酶标仪 美国Thermo公司；5810R高速离心机 德国Eppendorf公司。1.3 方法1.3.1 DNA的提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取Lm NJ05基因组DNA。200 2023,Vol.44,No.16 食品科学 生物工程1.3.2 引物设计参考GenBank中标准菌株EDG-e基因组序列（NC_003210.1），并比对同源性及分析最大开放阅读框后，利用Primer 6.0软件设计引物和分子鉴定引物（表1），引物P1和P2用于扩增inlJ基因片段确定上下游同源臂，分别于引物P3和P4的5端及3端加BamHI和KpnI酶切位点和保护性碱基。实验引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。表 1 引物序列Table l Primer sequences designed in this study引物序列（5-3）酶切位点扩增产物大小/bpP1CAAGTGAGATTTCCGACG3 318P2TACTTGGTGTGGCAGATGP3cagtcgacgggcccgggatccAATGAGACACTCGATTCACTCCTTCBamHI461P4agtgaattcgagctcggtaccGATATTCAGCTAGGAGAAGTTGGGAKpnIP5TCGTGAAAATTAATCGCTACCAT332/2 888P6GGAATGGAAGCTTTGCCGAT1.3.3 重组穿梭质粒pKSV7-inlJ的构建以Lm NJ05 DNA为模板，通过引物P1和P2扩增，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序鉴定。经Overlap PCR扩增上、下游同源臂纯化产物，将融合产物与pUC57载体，命名为pUC57-inlJ，通过大肠杆菌DH5感受态细胞转化后测序；以引物P3和P4扩增阳性克隆并测序鉴定。将穿梭质粒pKSV7和inlJ目的条带分别用BamHI和KpnI于37 酶切，然后用T4 DNA连接酶16 连接过夜，将连接产物用热激转化法（42），转化至DH5感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素（50 g/mL）的LB平板，37 过夜培养。随机挑取疑似阳性转化子，经PCR鉴定阳性菌，并送公司测序进一步验证以获得构建成功的重组质粒pKSV7-inlJ。1.3.4 Lm NJ05-inlJ缺失株的构建、筛选和鉴定根据Parsons等16方法制备Lm NJ05感受态细胞。取1 g pKSV7-inlJ加入100 L Lm NJ05感受态细胞中并混匀，随后电击转化（2.5 kV/cm、4.8 ms），涂布到含有氯霉素（10 g/mL）的BHI固体平板上，30 恒温静置培养48 h，随机挑取单菌落接种到含氯霉素（10 g/mL）的BHI液体培养基中，在氯霉素和温度（42）双重压力下进行同源重组，并以P3和P4为引物，PCR扩增（反应条件同上）筛选阳性转化子。在30 无氯霉素压力条件下传代培养约10 代完成质粒pKSV7消杀过程，将末代菌液涂布BHI平板，挑取单菌落再次进行PCR及测序鉴定，最终获得无氯霉素抗性的Lm NJ05-inlJ缺失株。1.3.5 Lm NJ05-inlJ缺失株生长特性将Lm NJ05、Lm NJ05-inlJ划线于BHI固体平板，37 倒置过夜培养。次日，挑取单菌落到BHI液体培养基，37、200 r/min振荡培养至对数期（OD600 nm约为0.6），再按体积比为1 100接入到新鲜BHI液体培养基中，置于37 培养箱中静置培养，每隔30 min取出测定OD600 nm，用OriginPro 8.5软件绘制生长曲线。1.3.6 Lm NJ05-inlJ缺失株对细胞的黏附和侵袭性将培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7经胰蛋白酶消化后移至48 孔细胞培养板中，于37、5%CO2条件下培养至细胞密度约为5.0105 Cell/mL。弃去培养液，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）将细胞漂洗3 遍，加入无抗改良Eagle培养基（Dulbeccos modification of Eagles medium Dulbecco，DMEM）。每孔加入Lm NJ05-inlJ缺失株培养液0.5 mL（5107 CFU/mL）培养1 h，PBS洗涤细胞3 次，加入300 L 0.2%Triton X-100和胰蛋白酶作用15 min，吸取各孔悬液，稀释后涂板计数测定黏附细菌的数量。每孔中细胞用PBS洗涤2 次，并重新悬浮在含有庆大霉素（100 g/mL）的1 mL DMEM培养基中，以测定侵袭细菌的数量。每个实验重复3 次。1.3.7 Lm NJ05-inlJ缺失株噬菌体成斑率（efficiency of plaquing，EOP）分析取过夜培养Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ菌液，调整各菌液OD600 nm值为1.0（108 CFU/mL），分别与相同浓度的vB-LmoM-NJ05噬菌体进行双层平板EOP实验，记录噬菌斑数量，计算Lm NJ05-inlJ突变体的EOP，判断噬菌体与突变体的反应敏感性。计算公式如下：EOPBA式中：A为测试菌株（Lm NJ05-inlJ）噬菌斑形 成量/（PFU/mL）；B为标准菌株（Lm NJ05）噬菌斑形成量/（PFU/mL）。1.3.8 噬菌体对Lm NJ05-inlJ缺失株裂解活性分别调整Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ菌液至OD600 nm=1.0，取500 L菌液加入48 孔板中，以最佳感染复数为1加入500 L噬菌体，并设置相应菌株对照组，每隔30 min通过酶标仪测定OD600 nm值，直至10 h。1.3.9 噬菌体对生物被膜抑制和清除能力测定噬菌体vB-LmoM-NJ05对Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ生物被膜的抑制和清除能力实验方法如下：BHI琼脂平板划线复苏菌株，分别挑取单菌落至5 mL BHI肉汤，37 振荡过夜培养16 h，调整到OD600 nm至0.1，加入100 L菌液到96 孔板中，分成两组：A组抑制生物被膜实验，加入100 L不同浓度的噬菌体vB-LmoM-NJ05（105、106、107、108 PFU/mL），37 静置培养48 h，之后结晶紫染色；B组清除生物被膜实验，菌液培养48 h后，除去各孔的浮游菌，并用PBS洗涤3 次，加入100 L不同滴度的噬菌体vB-LmoM-NJ05（104、105、106、107、108 PFU/mL）与生物被膜在37 孵育12 h，然后结晶紫染色，酶标仪测定OD590 nm。生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.16 2011.3.10 RNA提取、cDNA合成及逆转录实时PCR（reverse transcription real-time PCR，RT-real-time PCR）为了阐明内化素InlJ在生物被膜形成及其在噬菌体敏感性中的作用，利用RT-real-time PCR分析生物被膜相关基因（hpt、agrD、yneA、agrA、degU、luxS、flaA和recA）转录表达水平，引物信息建表2。简而言之，将1 mL Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ（108 CFU/mL）分别与1 mL噬菌体vB-LmoM-NJ05（108 PFU/mL）37 静置2 h，将混合物10 000g离心5 min，将Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ作为对照组。根据产品说明提取总RNA，逆转录试剂盒进行cDNA合成。real-time PCR体系17：2 L cDNA、0.5 L上下游引物、10 L SYBR Green qPCR Supermix和7.5 L RNase-free H2O进行real-time PCR，反应终体积为20 L。real-time PCR的循环参数如下：95 预变性30 s、95 变性10 s、56 退火30 s、72 延伸60 s，40 个循环。表 2 RT-real-time PCR引物Table 2 RT-real-time PCR primers 基因引物序列（5-3）hpthpt-FATGTCATTATTCAGTTTAAAAAGhpt-RTTATAGATGTAAAACTTTTGCagrDagrD-FATGAAAAATATGAATAAATCAGTTGagrD-RTTATTTATTTTCGTTTTTTTCTTGCyneAyneA-FTGACTTTAAAATTAATTTGGGATyneA-RTTACTGATTTGCTAGTTGAATTGagrAagrA-FATGCTACCGGTTTTTATTTGagrA-RTTATAAACTCAAGCTTTTAATTdegUdegU-FATGGCACTCAAAATCATGATTGdegU-RTTAGCGAATGTATACCCAGCluxSluxS-FATGGCAGAAAAAATGAATGTAGluxS-RTTATTCACCAAACACATTTTTCCflaAflaA-FATGAAAGTAAATACTAATATCAflaA-RTTAGCTGTTAATTAATTGAGTTrecArecA-FGTGAATGATCGTCAAGCGGrecA-RTTATTCATCATCTAGTAAACTTA1.4 数据处理与统计分析运用SPSS20.0软件进行单因素方差分析，组间差异采用t检验。采用OriginPro 8.5和GraphPad Prism 9.0.0软件进行绘图。2 结果与分析2.1 重组穿梭质粒pKSV7-inlJ的鉴定对穿梭载体pKSV7和基因片段inlJ酶切，T4 DNA连接酶连接，转化至DH5，挑选阳性克隆，测序结果表明，inlJ缺失序列分别由上游222 bp和下游239 bp组成，全长共461 bp。电泳结果和预期大小相符，测序结果比对一致，表明重组穿梭质粒pKSV7-inlJ构建成功（图1）。M15 000 bp8 000 bp5 000 bp3 000 bp2 000 bp1 500 bp1 000 bp750 bp500 bp100 bp250 bp12345M.DNA分子质量标准，下同；1、2.pKSV7-inlJ重组质粒；3、4.缺失片段inlJ；5.pUC57-inlJ为模板PCR扩增的inlJ缺失片段。图 1 重组质粒pKSV7-inlJ鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pKSV7-inlJ2.2 Lm NJ05-inlJ构建、筛选与鉴定如图2所示，pKSV7-inlJ质粒和inlJ基因缺失株扩增产物均为332 bp，未扩增出inlJ序列；而Lm NJ05野生株扩增产物为2 888 bp的inlJ基因序列（图2），表明inlJ基因完全缺失，成功构建稳定的inlJ基因缺失株，命名为Lm NJ05-inlJ。15 000 bp8 000 bp5 000 bp3 000 bp2 000 bp1 500 bp1 000 bp750 bp500 bp100 bp250 bpM12341.pKSV7-inlJ质粒；2.Lm NJ05；3、4.Lm NJ05-inlJ。图 2 缺失株Lm NJ05-inlJ鉴定Fig.2 Identification of Lm NJ05-inlJ2.3 Lm NJ05-inlJ生长曲线测定将Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ在37 条件下培养10 h，通过酶标仪检测其OD600 nm值，根据结果绘制生长曲线见图3，显示缺失株Lm NJ05-inlJ与野生株Lm NJ05在03 h时间段内均处于适应期，37 h时间段内处于对数期，生长趋势无显著差异，由此可见，inlJ基因的缺失对其生长特性无显著影响。0.00.20.40.60.801235684101.0OD600 nm?/hNJ05NJ05-inlJ图 3 Lm NJ05-inlJ缺失株生长曲线Fig.3 Growth curve of Lm NJ05-inlJ202 2023,Vol.44,No.16 食品科学 生物工程2.4 黏附性与侵袭性通过RAW264.7细胞分析缺失株Lm NJ05-inlJ对细胞黏附和侵袭活性的变化，由图4可知，Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ对RAW264.7细胞的黏附率分别为33.5%和20.05%（图4），Lm NJ05-inlJ的黏附能力显著降低（P0.05）。对RAW264.7细胞的侵袭性结果表明，Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ对RAW264.7细胞的侵袭力分别为8.25%和4.42%（图5），缺失株侵袭力显著下 降（P0.01）。综上所述，inlJ基因缺失对细胞的黏附和侵袭性均减弱。*NJ05NJ05-inlJ02010504030?/%?*.P0.05，下同。图 4 Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ对细胞的黏附能力Fig.4 Cell adhesion of Lm NJ05 and Lm NJ05-inlJ*NJ05NJ05-inlJ0421086?/%?*.P0.01，下同。图 5 Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ对细胞的侵袭能力Fig.5 Cell invasion of Lm NJ05 and Lm NJ05-inlJ2.5 Lm NJ05-inlJ对噬菌体vB-LmoM-NJ05敏感性通过EOP分析Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ对噬菌体的敏感性。结果表明，Lm NJ05-inlJ EOP较Lm NJ05高至2.72 倍（表3），表明inlJ基因缺失会影响噬菌体和宿主菌株之间的敏感性，成斑效果增强。此外，与野生株Lm NJ05相比，缺失株Lm NJ05-inlJ形成的噬菌体斑更加清晰透明（图6），进一步表明缺失inlJ基因能够增强其与噬菌体的敏感性。表 3 噬菌体vB-LmoM-NJ05的EOPTable 3 EOP of phage vB-LmoM-NJ05菌株效价/（109 PFU/mL）EOPLm NJ051.00.0181.0Lm NJ05-inlJ2.720.012.72AB图 6 Lm NJ05（A）和Lm NJ05-inlJ（B）EOP分析Fig.6 EOP analysis of Lm NJ05(A)and Lm NJ05-inlJ(B)2.6 Lm NJ05-inlJ对噬菌体vB-LmoM-NJ05裂解活性由图7可知，噬菌体vB-LmoM-NJ05对Lm NJ05-inlJ抑制效果更显著。在作用2 h内，噬菌体对Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ作用效果相似，但在2 h后至10 h，噬菌体对Lm NJ05-inlJ的敏感性明显增强，与Lm NJ05相比呈显著差异。由此可见，inlJ基因缺失能够增强其对噬菌体vB-LmoM-NJ05裂解活性。0.150.200.250.300.3501235684100.40OD600 nm?/hNJ05NJ05-inlJ图 7 噬菌体对Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ体外裂解活性Fig.7 Lytic activity of phage on Lm NJ05 and Lm NJ05-inlJ 2.7 噬菌体对Lm生物被膜抑制及清除效果由图8可知，inlJ基因缺失之后，Lm NJ05-inlJ生物被膜形成能力显著降低（P0.01），当噬菌体vB-LmoM-NJ05以105 PFU/mL作用Lm，能够有效抑制生物被膜的形成，且对Lm NJ05-inlJ抑制能力更强（P0.05），同样以106108 PFU/mL噬菌体作用后，能够完全抑制生物被膜形成。利用噬菌体清除生物被膜的结果表明，当以108 PFU/mL噬菌体作用时，能够完全清除Lm NJ05-inlJ形成的生物被膜，与Lm NJ05呈显著差异（图9，P0.001）。由此可见，inlJ基因的缺失，使其生物被膜的形成能力减弱，从而使噬菌体对其清除力更为显著。00105106107108C214*3OD590 nm?/?PFU/mL?NJ05NJ05-inlJ*nsnsnsns.无显著差异；C.空白对照。下同。图 8 噬菌体对Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ生物被膜抑制能力Fig.8 Biofilm inhibitory effect of phage against Lm NJ05 and Lm NJ05-inlJ 生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.16 20300105104106107108C214*3OD590 nm?/?PFU/mL?NJ05NJ05-inlJ*nsns*ns*.P0.001。图 9 噬菌体对Lm NJ05和Lm NJ05-inlJ生物被膜清除能力Fig.9 Biofilm removal capacity of phage against Lm NJ05 and Lm NJ05-inlJ2.8 生物被膜形成相关基因的转录分析flaA、degU、agrA、agrD和luxS等基因参与早期生物被膜形成，而yneA、recA和hpt等基因作用于生物被膜成熟阶段18。RT-real-time PCR的结果表明，与Lm NJ05相比，Lm NJ05-inlJ编码生物被膜相关基因degU、agrA、agrD、luxS、yneA、recA和hpt的转录水平均下降（图10）。当噬菌体vB-LmoM-NJ05作用缺失株后，生物被膜相关基因转录水平下降极为明显，均呈下调趋势。由此可见，inlJ基因缺失负调控生物被膜形成相关基因的表达，降低生物被膜的形成能力。此外，当噬菌体作用后，生物被膜形成相关基因转录下调极为显著，从而缺失株生物被膜形成能力减弱，噬菌体对其更具清除能力。0.00.61.61.41.21.00.80.40.2?hptagrDyneAagrA degUluxSflaANJ05NJ05-inlJNJ05?NJ05-inlJ?recA图 10 生物被膜形成相关基因的表达分析Fig.10 Relative expression levels of biofilm formation-related genes3 讨 论Lm表面蛋白是细菌代谢、群体感应、生物被膜形成和毒力基因表达调控的重要调节因子，与细菌致病性密切相关。由于表面蛋白的存在使Lm能够在低温环境中19复制增殖，并且侵染多种真核细胞20。迄今为止，在Lm基因组中发现了41 个编码LPXTG蛋白的基因21，inlA是最早被发现的介导Lm入侵宿主细胞的LPXTG表面蛋白基因，其主要作用机制是与宿主细胞上的特异性受体结合，诱导非吞噬细胞将菌体内吞进入细胞内部寄生，许多研究表明inlA在穿透肠道屏障的过程中发挥重要 作用22。inlJ是编码LPXTG蛋白的基因之一，任静静等23发现，inlJ缺失株对小鼠的感染能力和毒力均降低。本研究中，Lm NJ05-inlJ对RAW264.7细胞侵袭和黏附均显著降低，由此表明，inlJ参与了Lm的毒力作用机制。噬菌体作为天然生物抑菌剂已在食品及医药领域受到越来越多的关注24，由于其在去除致病菌污染25和消除生物被膜26的形成的优势，已被尝试用于水果、即食食品27、奶酪和牛奶28等食品的保鲜抑菌和人类疾病的临床治疗中29。细菌可以通过多种方式避免被噬菌体感染30，例如吸附阻断和阻碍噬菌体DNA的进入。在本研究中，重点分析了食源性Lm NJ05中inlJ基因作用特性，结果表明inlJ基因缺失使其对噬菌体vB-LmoM-NJ05的敏感性增强。缺失株Lm NJ05-inlJ对噬菌体的EOP增加到2.72 倍，噬菌斑更清晰透明，且噬菌体对Lm NJ05-inlJ抑制活性更强。由此可见inlJ基因参与Lm与噬菌体的相互作用。生物被膜能够保护微生物在不利环境中持续生长，使环境各介质之间反复交叉污染31。王少辉等32研究表明，inlK基因的缺失会导致Lm生物被膜形成能力显著降低。本研究中inlJ基因的缺失降低了Lm生物被膜的形成，这可能是InlJ与InlK一样同属于Lm表面蛋白，与细菌胞外蛋白或组织表面的物质发生相互作用，有利于Lm黏附在物体表面促进生物被膜的形成。此外，本研究发现噬菌体vB-LmoM-NJ05也能够很好地抑制和清除Lm生物被膜，特别是对于Lm NJ05-inlJ缺失株，抑制效果更为明显，这可能与InlJ表面蛋白的缺失导致生物被膜的形成能力降低，噬菌体vB-LmoM-NJ05对Lm NJ05-inlJ敏感性增强相关。Lm生物被膜的形成与很多因素相关，例如鞭毛糖蛋白相关因子FlaA、DegU，群体感应系统相关因子Agr、LuxS和胞外基质相关因子yneA、Hpt等33-36。本研究发现inlJ基因的缺失导致参与生物被膜形成的相关基因表达降低，并且在Lm NJ05-inlJ与噬菌体vB-LmoM-NJ05相互作用后，使这些基因几乎无应答。由此表明，inlJ基因缺失影响生物被膜基因表达，降低Lm生物被膜的形成能力，与噬菌体作用之后，生物被膜形成相关基因表达持续降低，以此抑制和清除生物被膜。综上所述，LPXTG蛋白会参与噬菌体与Lm间的识别及互作，目前暂未见相关报道，但其为LPXTG蛋白在噬菌体敏感性中的功能揭示将为噬菌体对抗菌和治疗中提供重要的理论支撑。4 结 论通过同源重组技术成功构建了缺失株Lm NJ05-inlJ，inlJ基因缺失对细胞的黏附和侵袭性下降，减弱了生物被膜形成能力，但对噬菌体的敏感性显著增强，进204 2023,Vol.44,No.16 食品科学 生物工程而使噬菌体对缺失株Lm NJ05-inlJ生物被膜的抑制和清除能力得到了显著提高，生物被膜形成相关基因的表达呈下调趋势。由此可见，作为LPXTG蛋白成员的InlJ参与噬菌体与Lm间的识别及相互作用，这为LPXTG蛋白新功能的揭示奠定了重要依据，为噬菌体的生物防治提供了新的理论依据。参考文献：1 FENG Y,WU S,VARMA J K,et al.Systematic review of human listeriosis in China,1964-2010J.Tropical Medicine&International Health,2013,18(10):1248-1256.DOI:10.1111/tmi.12173.2 KLJUJEV I,RAICEVIC V,JOVICIC-PETROVIC J,et al.Listeria monocytogenes-danger for health safety vegetable productionJ.Microb Pathogenesis,2018,120:23-31.DOI:10.1016/j.micpath.2018.04.034.3 RAY L C,COLLINS J P,GRIFFIN P M,et al.Decreased incidence of infections caused by pathogens transmitted commonly through food during the COVID-19 pandemic-foodborne diseases active surveillance network,10 U.S.Sites,2017-2020J.Morbidity and Mortality Weekly Report,2021,70(38):1332-1336.DOI:10.15585