大熊猫源奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 6 期2023 年 6 月Vol.45，No.6Jun.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202211013大熊猫源奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用刘圣1,2覮，郑维超4覮，黄虹秀3，刘颂蕊1，杨梅1，燕霞1，李运莉1，岳婵娟1，侯蓉1，张东升1，范雪阳1，张洪文1，李林1，曹立亭2*，苏小艳1*(1.西南大学 动物医学院，重庆 荣昌 402460；2.成都大熊猫繁育研究基地 四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，四川 成都 610081；3.大熊猫国家公园广元管理分局，四川 广元 628000；4.四川大熊猫科学研究院，四川 成都 610081)摘要：为建立一种快速鉴别检测大熊猫3种病原菌的多重PCR方法，本研究根据NCBI登录的奇异变形杆菌(PM)基因、肺炎克雷伯菌(KPN)基因、大肠杆菌()基因，设计3对引物，并对各反应条件优化，初步建立检测大熊猫源PM、KPN和的多重PCR方法。特异性结果显示，本研究建立的多重PCR方法对PM、KPN和能够分别扩增到308 bp、456 bp和666 bp的目的条带，而对大熊猫常见的其它20种病原菌均无扩增；敏感性试验结果显示，该方法对PM、KPN和DNA的检测限分别为2.8伊107拷贝/滋L()、3伊107拷贝/滋L()、6伊107拷贝/滋L()。利用本研究建立的多重PCR方法对100份大熊猫临床样品检测，结果显示：PM、KPN和的检出率分别为30%(30/100)、90%(90/100)和100%(100/100)，均与研究报道的单一PCR检出率相同，对PM和KPN的检出率均高于传统病原分离方法(25%、83%)。本研究建立的大熊猫源PM、KPN、多重PCR检测方法特异性较强、敏感性较高，且可以同时检测3种病原，为大熊猫细菌性疾病的诊断提供了新的检测手段，极大缩短了检测时间，对临床防控相应细菌性疾病具有重要意义。关键词：大熊猫；奇异变形杆菌；肺炎克雷伯菌；大肠杆菌；多重PCR中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)06-0598-06Establishment and application of multiplex PCR detectionmethod for,andfrom giant pandaLIU Sheng1,2覮,ZHENG Wei-chao4覮,HUANG Hong-xiu3,LIU Song-rui1,YANG Mei1,YAN Xia1,LI Yun-li1,YUE Chan-juan1,HOU Rong1,ZHANG Dong-sheng1,FAN Xue-yang1,ZHANG Hong-wen1,LI Lin1,CAO Li-ting2*,SU Xiao-yan1*(1.College of Veterinary Medicine,Southwest University,Rongchang 402460,China;2.Chengdu Research Base of Giant Panda Breeding,Sichuan Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Wildlife,Chengdu 610081,China;3.Guangyuan Administration Branch ofGiant Panda National Park,Guangyuan 628000,China;4 Sichuan Academy of Giant Panda,Chengdu 610081,China)收稿日期：2022-11-08基金项目：成都大熊猫繁育研究基金会(CPF2014-03)；成都大熊猫繁育研究基地自立课题(2021CPB-B15、2020CPB-B23)；国家林业和草原局和四川省财政厅资金(圈养及野外大熊猫重大疾病防控研究)覮 共同第一作者：刘圣(1997-)，男，重庆荣昌人，硕士研究生，主要从事大熊猫等野生动物疾病防控研究；郑维超(1986-)，男，四川彭州人，本科生，主要从事以大熊猫为代表的生物多样性研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding author;覮Equal contributorsAbstract:In this study,our objective was to establish a multiplex PCR method for the rapid identification and detection ofthree pathogens in giant pandas.To achieve this,we designed three pairs of primers targeting specific genes:thegene of(PM),thegene of(KPN),and thegene of,which wereregistered by NCBI.These primers were carefully optimized,and the reaction conditions were fine-tuned for maximum efficiency.The resulting multiplex PCR method demonstrated its capability to successfully amplify 308bp,456bp,and 666bp bandscorresponding to PM,KPN,and,respectively.Importantly,this method showed no amplification for 20 other commonpathogens found in giant pandas,highlighting its specificity.Sensitivity tests were conducted,and the detection limits for PM,KPN,andDNA were determined as 2.8伊107copies/滋L(),3伊107copies/滋L(),and 6伊107copies/滋L(),respectively.These results showcased the high sensitivity of our multiplex PCR method.To further validate its effectiveness,theestablished multi-PCR detection method was applied to analyze 100 clinical samples from giant pandas.The results revealeddetection rates of 30%(30/100)for PM,90%(90/100)for KPN,and 100%(100/100)for.These detection rates wereconsistent with those achieved through single PCR detection methods reported in other studies.Additionally,the detection rates ofPM and KPN were higher than those achieved through traditional pathogen isolation(25%and 83%,respectively).Our multi-PCRmethod for PM,KPN,andof giant panda origin demonstrated strong specificity and high sensitivity,enabling thesimultaneous detection of three pathogens.This innovative approach provides a new and efficient detection method for diagnosingbacterial diseases in giant pandas,significantly shortening the detection time.As a result,it holds great significance for the clinicalprevention and control of corresponding bacterial diseases.Key words:giant panda;multiplex PCR大熊猫()是我国特有的珍稀野生动物，是世界生物多样性保护旗舰种。随着近年来保护工作的不断加强，大熊猫种群数量和生活环境得到极大改善。第四次全国大熊猫调查报告显示，野生大熊猫种群数量达1 864只1；截止到2019年11月，全球圈养大熊猫种群数量达600只2。大熊猫细菌性病原是引起大熊猫发病的重要因素之一，其中奇异变形杆菌(，PM)、肺炎克雷伯杆菌(，KPN)和大肠埃希氏菌(简称大肠杆菌，)均是临床中引起大熊猫发病的常见病原菌，3种菌感染均可引发大熊猫血尿腹泻、粪便带黏液或血液、败血症等临床症状，据资料记载O152血清型曾导致近20只大熊猫发生出血性肠炎而死亡(http:/ PCR)具有检测量大、准确和快速等优点，在食品和家畜病原菌的检测中得到广泛应用14-15。谢玉杰等建立了一种针对牛源金黄色葡萄球菌基因、无乳链球菌基因、绿脓杆菌基因、停乳链球菌、大肠杆菌基因和支原体基因的6重PCR检测方法，可用于致奶牛乳房炎的病原菌检测16。胡金强等通过金黄色葡萄球菌基因、副溶血性弧菌基因、单核细胞增生李斯特菌基因、阪崎克罗诺杆菌基因、鼠伤寒沙门氏菌基因和O157:H7基因建立了6重PCR检测方法，用于食物中致病菌的快速检测17。由此表明，多重PCR检测病原菌技术已被广泛应用。因此，本研究拟建立针对大熊猫源PM基因、KPN基因和基因的多重PCR检测方法，为大熊猫临床病原菌的检测提供及时、可靠的技术手段。1材料与方法1.1主要实验材料PMATCC12453、KPNATCC700603刘圣，等.大熊猫源奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌多重 PCR 检测方法的建立及应用第 6 期599和ATCC25922标准菌株均购自北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心；坚韧肠球菌、非解乳球糖链球菌、乳明串珠菌、弗氏柠檬酸杆菌、鲍曼不动杆菌、盲肠肠球菌、粪肠球菌、巴氏链球菌、摩氏摩根菌、松鼠葡萄球菌、格氏乳杆菌、小牛葡萄球菌、吉氏库特氏菌、蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌、彭氏变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌均由四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室鉴定并保存；100份大熊猫的新鲜粪便样品于2022年3月2022 年 4 月 从 成 都 大 熊 猫 繁 育 研 究 基 地 采 集。DL1000DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；2伊PCR Master Mix购自 Thermo Scientific；细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。1.2引物合成与设计根据GenBank登录的PM(JOVJ01000004.1)、KPN(FO834906.1)和基因序列(LR883050.1)，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物由生工生物工程(成都)有限公司合成(表1)。1.3各细菌单一PCR检测方法的建立及反应条件优化采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取PMATCC12453、KPN ATCC700603和ATCC25922的DNA作为模板，利用相应引物经单一PCR分别扩增、基因片段，同时采用方阵法优化退火温度(55、56、57、58、59、60 )和 引 物 终 浓 度(0.2 滋mol/L、0.4 滋mol/L、0.6 滋mol/L、0.8 滋mol/L、1.0 滋mol/L)。反应体系25 滋L，其中2伊PCR Master Mix 12.5 滋L、上下游引物各1 滋L(10 滋mol/L)、DNA模板2 滋L、ddH2O8.5 滋L。反应条件为：95 5 min；95 30 s、60 30 s、72 40 s，共 25个循环；72 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。1.4多重PCR方法的优化与建立将提取的3株菌的DNA稀释至100 ng/滋L后各取10 滋L 混合后作为模板。反应体系25 滋L：其中2伊PCR Master Mix12.5 滋L，PM、KPN、上下游引物各1 滋L，基因组混合模板2 滋L，ddH2O 4.5 滋L。反应条件为：95 5 min；95 30 s、60 30 s、72 40 s，共25个循环；72 10 min；4 10 min。同时，利用3株菌的单一DNA模板采用上述反应体系和条件分别进行扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。在上述条件基础上，采用方阵法对退火温度(55 60)、引物浓度(0.2 滋mol/L1.0 滋mol/L)优化。1.5多重PCR特异性试验利用细菌DNA提取试剂盒提取熊猫源坚韧肠球菌、非解乳球糖链球菌、乳明串珠菌、弗氏柠檬酸杆菌、鲍曼不动杆菌、蜡样芽孢杆菌、盲肠球菌、粪肠球菌、巴氏链球菌、摩氏摩根菌、松鼠葡萄球菌、格氏乳杆菌、小牛葡萄球菌、吉氏库特氏菌、藤黄微球菌、彭氏变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌的DNA，采用建立的多重PCR方法，对3株菌混合DNA及20种细菌的DNA进行检测，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，评估所建立的多重PCR方法的特异性。1.6多重PCR敏感性试验利用超微量核酸定量仪测定3株菌DNA浓度。用灭菌水将各菌株DNA 10倍倍比稀释(PM 2.8伊109拷贝/滋L2.8伊102拷贝/滋L、KPN 3伊109拷贝/滋L3伊102拷贝/滋L、6伊109拷贝/滋L6伊102拷贝/滋L)。以3株菌上述各稀释度DNA各取10 滋L混合后作为模板，利用本实验建立的多重PCR检测；同时参照文献方法对各菌株进行单一PCR的敏感性检测18-20，分析两种方法的敏感性。1.8临床样品检测对临床送检的100份大熊猫粪便样品经BHI肉汤富集后提取DNA，利用建立的多重PCR方法检测。同时采用文献报道的单一PCR方法和传统的病原分离培养鉴定方法对建立的多重PCR方法进行准确性检验18-20。2结果2.1单一PCR方法的建立单一PCR结果显示，分别 在 308 bp、456 bp、666 bp 处 扩 增 到 PM、KPN、基因的目的条带。经优化，当退火温度在60，引物终浓度为0.2 滋mol/L时，PCR反应体系扩增效率良好，且无其他非特异性条表 1多重 PCR 引物序列基因Gene序列(5-3)Sequence(5-3)F:TACTTCAGCAATGTCTACCGCR:CCCCATTCTGACATCCAACF:CGTTTCTACCGCAGAGTTGR:GTGACTATGACCAGCGTGTTF:TAATGATGATGGGCTTTGTGR:CGAAGAAGTCGGTGTTGC扩增片段长度(bp)Fragment length(bp)308666456中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年600带出现(图1)，表明3对引物的特异性较强。2.2多重PCR方法的优化与建立分别以3株菌混合DNA和单一DNA为模板，将3对引物混合后分别采用多重PCR扩增。结果显示，混合模板与单一模板扩增的PM、KPN和基因分别在308 bp、456 bp、666 bp处出现目的条带，条带大小与单一PCR结果一致。多重PCR反应条件经优化后结果显示，退火温度在60，且PM、KPN和引 物 浓 度 分 别 为 0.2 滋mol/L、0.8 滋mol/L、0.8 滋mol/L时，多重PCR扩增效果最佳(图2)。2.3多重PCR特异性试验结果多重PCR方法特异性检测结果显示，该方法只能对PM、KPN、扩增出308 bp、456 bp、666 bp的目的条带，其他20种菌株均未能扩增出相应条带(图3)，表明该方法具有良好的特异性。2.4多重PCR敏感性试验结果敏感性试验结果显示，PM、KPN和DNA模板检测限分别为：2.8 伊107拷 贝/滋L()、3 伊107拷 贝/滋L()、6伊107拷贝/滋L()(图4A)。而各单一PCR方法对PM、KPN和的检测限分别为2.8伊105拷贝/滋L、3伊106拷贝/滋L、6伊105拷贝/滋L(图4B4D)。与单一PCR相比，多重PCR方法的检测敏感性稍低，但能够达到检测的需求。2.5临床样品检测对临床送检的100份大熊猫粪便样品进行多重PCR和单一PCR检测，结果显示，两种方法对PM、KPN和检出阳性率分别为30%(30/100)、90%(90/100)和100%(100/100)，本研究所建立的多重PCR与单一PCR的阳性符合率为100%。传统的细菌分离鉴定结果显示，100份大熊猫粪便样品中PM、KPN和阳性检出率分别为25%(25/100)、83%(83/100)和100%(100/100)；多重PCR对PM和KPN的阳性检出率高于传统细菌分离鉴刘圣，等.大熊猫源奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌多重 PCR 检测方法的建立及应用第 6 期601M：DL1000 DNA Marker；13：单一模板扩增；4：混合模板扩增M:DL1000 DNA Marker;1-3:Single template amplification;4:Mixed template amplification图2各细菌的多重PCR扩增结果1000bp700bp500bp400bp300bp200bp100bpM1234M：DNA分子量标准；120：分别为坚韧肠球菌、非解乳球糖链球菌、乳明串珠菌、弗氏柠檬酸杆菌、鲍曼不动杆菌、盲肠肠球菌、粪肠球菌、巴氏链球菌、摩氏摩根菌、松鼠葡萄球菌、格氏乳杆菌、小牛葡萄球菌、吉氏库特氏菌、蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌、彭氏变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌沙门氏菌；21：阴性对照；22：PM、KPN和DNA混合物M:DL1000 DNA Marker;1-20:,;,;21:ddH2O;22:DNA mixture of PM,KPN and图3多重PCR特异性试验结果M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 19 20 21 221000bp700bp500bp400bp300bp200bp100bpM:DL1000 DNA Marker;1:gene;2:gene;3:gene图1各细菌单一PCR的扩增结果1000bp700bp500bp400bp300bp200bp100bpM123M:DL1000 DNA Marker;A:1-8:2.8伊109copies/滋L-2.8伊102copies/滋L(PM),3伊109copies/滋L-3伊102copies/滋L(KPN),6伊109copies/滋L-6伊102copies/滋L();B:1-6:2.8伊109copies/滋L-2.8伊104copies/滋L(PM);C:1-6:3伊109copies/滋L-3伊104copies/滋L(KPN);D:1-6:6伊109copies/滋L-6伊104copies/滋L();N:ddH2O图4多重PCR(A)和单一PCR(BD)敏感性试验结果M 12345678N1000bp700bp500bp400bp300bp200bp100bp1000bp700bp500bp400bp300bp200bp100bp306bp1487bp1000bp204bp1000bp2000bp750bp500bp250bp100bp700bp500bp400bp300bp200bp100bpM123456NM123456NM123456N204bpACBD12表 2临床样品的检测结果病原菌Pathogenic bacteria奇异变形杆菌(PM)肺炎克雷伯菌(KPN)大肠杆菌()样品(份)Samples number100100100阳性样品(份)Positive sample3090100检出率(%)Detection rate3090100阳性样品(份)Positive sample3090100检出率(%)Detection rate3090100阳性样品(份)Positive sample2583100检出率(%)Detection rate2583100单一 PCRSingle PCR多重 PCRMultiplex PCR细菌分离鉴定Pathogen isolation and identification定方法(表2)。表明建立的多重PCR方法可以用于大熊猫临床3种病原菌的检测。3讨论大熊猫细菌性疾病对大熊猫种群和生命健康构成了严重威胁。近年来，细菌性疾病发病率呈上升趋势，PM、KPN和均能导致大熊猫出现腹泻、肠炎、泌尿道感染等症状，是大熊猫临床常见的病原菌。致病菌的检测和鉴定不及时往往会延误疾病的治疗。传统病原菌的分离鉴定需要经过样品的富集、分离、纯化等步骤，流程繁琐且受人为因素影响较大。因此，建立一种大熊猫细菌的快速检测方法显得尤为迫切。本研究分别针对PM、KPN、基因序列的保守区域设计引物，并建立了PM、KPN和多重PCR检测方法，该方法可分别扩增到308 bp、456 bp和666 bp的目的基因片段，片段大小与测序结果预期相符。对临床分离鉴定的20种大熊猫源肠道菌进行特异性检测，均无特异性扩增，表明该方法特异性较强。林红乐等针对PM基因设计一对特异性引物建立PCR检测方法，该方法可以有效检测出样品中的PM，检测限为30 cfu/mL21；孙龙飞等建立的大熊猫源KPN PCR检测方法，可以快速、准确检测大熊猫粪便样品中的病原，检测限为10 cfu/mL13；鲁玉华等为了检测养殖场奶牛乳房炎中的感染情况，利用16s-23srRNA保守序列设计特异性引物，建立的PCR检测方法可以直接检测到牛奶中的，检测限为3.125伊102cfu/5 滋L22。本研究建立的多重PCR方法对细菌纯培养物基因组DNA检测限分别为2.8伊107拷贝/滋L()、3伊107拷贝/滋L()、6伊107拷贝/滋L()，可以有效检测样品中的上述病原菌。与单一PCR方法相比，本研究建立的多重PCR方法的敏感性有所下降，这与现有的研究报道相似，这可能是由于多重PCR体系中引物之间存在相互竞争或抑制等情况。本研究方法的检测限稍优于胡宗云等建立的嗜水气单胞菌()、迟钝爱德华氏菌()、蜡样芽孢杆菌()3种病原菌的多重PCR检测方法，其检测限分别为4.8 ng、3 ng和2.6 ng23；与张晓梅等关于牛呼吸道传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒的4重PCR检测方法的敏感性基本一致24，表明本研究建立的多重PCR方法对病原菌检测的敏感性较好。临床样品携带的病原复杂，本研究建立的多重PCR方法的检出率高于“金标准”细菌的分离鉴定。为了进一步确定多重PCR的可靠性和排除假阳性，本实验对送检的样品进行反复多次病原的分离鉴定和16S rRNA测序，最终确定在送检的100份样品 中，PM、KPN 和的 检 出 率 分 别 为 30%(30/100)、90%(90/100)和100%(100/100)，与本实验建立的多重PCR方法的检测结果一致，表明该多重PCR方法对大熊猫临床样品检测结果可靠。相比于传统的细菌分离鉴定方法和单一PCR检测方法，多重PCR方法可以同时扩增多种不同病原菌，且更加高效、快速，极大程度提高了检测效率，更能满足临床疾病防控的需求。综上所述，本研究建立的多重PCR方法具有良好特异性、敏感性和抗干扰性，检出率优于病原分离鉴定法，极大提高了检出率，为大熊猫种群这3种细菌的快速检测及流行病学调查提供技术支持。参考文献：耿国彪.1864只我国野生大熊猫保护取得新成效全国第四次大熊猫调查结果公布J.绿色中国，2015，(4)：10-12.刘圣，杨梅，燕霞，等.大熊猫细菌性疾病研究进展J.黑龙江畜牧兽医，2023，(7)：42-47.中 国 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