核酸检测实验室的规范化管理专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,核酸检测试验室规范化管理,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第1页,一、规范化设置及管理,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第2页,(一)临床基因扩增检验试验室区域设置标准,1临床基因扩增检验试验室标准上分为四个分隔开工作区域：,试剂贮存和准备区；标本制备区；,扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区。,（如使用全自动分析仪，区域可适当合并）,2各工作区域必须有明确标识，防止不一样工作区域内设备、物品混用。,3进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即：,试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应混合物配制和扩增区 扩增产物分析区。,4不一样工作区域使用不一样工作服(比如不一样颜色)。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第3页,（二）工作区域仪器设备配置标准,1试剂贮存和准备区,2-8和-15冰箱；混匀器；微量加样器(覆盖1-1000,l)；,移动紫外灯(近工作台面)；消耗品：,一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理离心管和加样器吸头(带滤芯)；,专用工作服和工作鞋；专用办公用具。,2标本制备区,1-8冰箱、-20或-80冰箱；高速台式冷冻离心机；,混匀器；水浴箱或加热模块；微量加样器(覆盖1-1000,l)；,可移动紫外灯(近工作台面)；超净工作台；消耗品;,一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理离心管和加样器吸头(带滤芯)；专用工作服和工作鞋；专用办公用具；,如需处理大分子DNA，应备有超声波水浴仪。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第4页,3.扩增反应混合物配制和扩增区,核酸扩增仪；微量加样器(覆盖1-1000l)；,可移动紫外灯(近工作台面)；消耗品（一次性手套、一次性吸水纸、,耐高压处理离心管和加样器吸头(带滤芯)；,专用工作服和工作鞋；专用办公用具.,4.扩增产物分析区,基本仪器设备以下：,微量加样器(覆盖1-1000l)；,可移动紫外灯；消耗品；,专用工作服和工作鞋；专用办公用具,。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第5页,（三）各区操作注意事项,下述操作在该区进行：,储存试剂制备、试剂分装和主反应混合液制备。,在本区试验操作过程中，必须戴手套并经常更换。,操作中使用一次性帽子也是一个有效地预防污染办法。,禁止用嘴吸收液体，加样器和吸头等必须经高压处理。,工作结束后必须马上对工作区进行清洁。,试验室及其设备使用必须有日常统计。,1.试剂贮存和准备区,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第6页,2.,标本制备区,下述操作在该区进行：,标本保留、核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA合成。,为防止样本间交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液反应管。,对含有潜在传染危险性材料，必须有明确样本处理和灭活程序。,样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效核酸提取方法。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第7页,3.扩增,区,下述操作在该区进行：DNA或RNA扩增。,在巢式PCR测定中，通常第一轮扩增后必须打开反应管，所以巢式扩增由较高危险性，第二次加样必须在本区内进行。,不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区气压以防止气溶胶从本区漏出。,为防止气溶胶所致污染，尽可能降低在本区走动。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第8页,4.扩增产物分析区,下述操作在本区内进行：扩增片段测定。,本区是最主要扩增产物污染起源，所以必须注意防止经过本区物品及工作服将扩增产物带出。,本区有可能会用到一些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，应注意试验人员安全防护。,本区如采取负压或减压情况下可降低扩增产物从本区扩散至前面区域可能性,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第9页,二、质量确保,临床基因扩增检验试验室质量确保包括到整个基因扩增检验全部阶段，即测定分析前标本采集处理、测定中核酸提取，扩增和产物分析以及测定后结果汇报等。,（一）标本采集,（二）标本稳定化处理,（三）标本运输,（四）标本贮存,（五）标本处理(核酸提取),（六）靶核酸逆转录CFIT)和扩增,（七）污染,（八）扩增产物分析,（九）质量控制,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第10页,（一）标本采集,惯用于基因扩增检测临床标本包含EDTA或构橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓采样，必须注意预防来自采样者皮屑或分泌物污染。采样时必须戴一次性手套。,玻璃器皿在使用前应高压处理。,临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测血标本提议进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以防止RNA降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第11页,（二）标本稳定化处理,用于DNA扩增检测标本，应及时送至试验室。,用于RNA测定标本应进行稳定化处理，异硫氰酸胍盐(Guanidine thiocyanate，CITC)可使DNA酶和RNA酶马上失活，所以在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1：4百分比加至含有5molL GITC试管中，从而使血清(浆)中RNA酶不可逆失活。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第12页,（,三）标本运输,标本采集后必须尽快送至试验室。,经过稳定化处理标本可在常温下邮寄运输。,用于RNA检测标本，假如未经稳定化处理，须速冻后，放在干冰中运输。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第13页,（四）标本贮存,临床体液标本如血清血浆等可于-70下长时间贮存。,用于DNA测定已纯化核酸样本可在10 mmolL Tris1mmolL EDTA缓冲液(pH7.58.0)中4保留。,用于RNA测定已纯化核酸样本应在缓冲液中-80或液氮中贮存。,用乙醇沉淀核酸样本贮存在-20即可。,用GITC处理RNA标本在室温可保留7天。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第14页,（五）标本处理(核酸提取),标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取有效性。,当靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败常见原因是标本在运输前未经充分稳定化处理及核酸提取试剂RNA酶污染。故提议使用高质量商品核酸提取试剂。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第15页,（六）靶核酸逆转录(RT)和扩增,1靶RNA逆转录,下述原因通常影响cDNA合成效率：(1)逆转录效率降低或完全缺乏。其可能原因有逆转录酶质量不高、试剂降解变质或加样错误等；(2)用于逆转录标本中存在逆转录或Taq酶抑制物(如酚、氯仿、血红素等)；(3)RNA酶存在造成RNA降解。,2核酸扩增,有各种原因可引发核酸扩增检测假阳性或假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg,2+,浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导均一性极为主要，必须定时对扩增仪温度控制和加热模块中热传导一致性进行检验，以防止假阴性结果。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第16页,（,七）污 染,在实际工作中，常见有以下几个污染类型：扩增片段污染（产物污染）、天然基因组DNA污染、试剂污染（储存液或工作液）以及标本间交叉污染（如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性标本）。临床基因扩增检验试验室中污染最主要起源是扩增产物污染。,1测定分析前污染源,2测定分析阶段污染源,3污染防止,工作区严格划分目标即是为了预防污染。为防止以,前测定中所产生扩增产物污染，可设法将其破坏掉。如在扩增,反应中用dUTP取代部分dTTP，连续长波紫外灯照射，不能用其来,替换严格试验室设置和管理，尤其是这些方法不能预防外来非扩,增天然DNA污染。,4去除污染办法:次氯酸钠、紫外线照射、高压消毒,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第17页,（,八）扩增产物分析,扩增产物测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等，但临床PCR检验项目基本上都使用探针杂交方法。,杂交检测时应严格恪守商品试剂盒确定杂交程序盒杂交条件。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第18页,（,九）质量控制,必须对DNA和RNA分析各步进行质量控制，以防止假阳性和假阴性，确保测定结果准确性和重复性。因为核酸扩增测定高敏感性，所以标本制备、逆转录、扩增本身和产物分析中每一步都要求有质控办法。,当前商品试剂盒大部分没采取内标方法质控。所以，在测定血清/血浆病原体核酸如HBV DNA、HCV RNA等时，应使用已知弱阳性血清/血浆作为质控样本，与待测临床标本等同处理提取核酸及扩增，以判断逆转录及扩增检测效果。,每一个PCR试验中都必须设有外加阴性质控（污染监测质控），为判断扩增过程中污染出现阶段，阴性质控可包含以下几个：即在样品制备整个过程中所带空白管、仅有扩增反应液但不含扩增模板反应管、阴性标本等。阴性标本能够评定PCR试验综合质量。,核酸检测实验室的规范化管理专家讲座,第19页,