胆囊癌DNA甲基化修饰与治疗研究进展.pdf

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3，廖力微1.21昆明医科大学附属延安医院中心实验室，云南昆明6 50 0 51；云南省肿瘤免疫防治研究重点实验室，云南昆明6 50 0 51；昆明医科大学，云南昆明6 50 50 0【指示性摘要】胆囊癌是一种罕见但恶性程度极高的肿瘤，早期诊断困难,预后差,多药耐药,发病机制尚不明确。关于胆囊癌的研究主要集中在早期诊断生物标志物和治疗靶点的寻找。胆囊癌被认为是一种表观遗传异常肿瘤,DNA甲基化是其中最常见的一种修饰异常,且随肿瘤进展不断增加,DNA甲基化促进胆囊癌演变及发展,可作为其潜在生物标志物。此外,由于DNA甲基化的可逆性,DNA甲基化抑制剂有望通过与其他药物的联合应用,改善患者预后及耐药性。本研究我们将从DNA甲基化对胆囊癌的调控进行讨论,希望能为胆囊癌的早期诊断、预防和治疗提供一些研究思路。【关键词】胆囊癌；表观遗传学;DNA甲基化;DNA甲基化抑制剂【中图分类号】R735.8【文章编号】16 7 2-49 9 2-（2 0 2 3)19-36 7 8-0 6【收稿日期】2022-12-20【基金项目】国家自然科学基金资助项目（编号：8 2 2 6 0 52 2）；云南省科技厅昆明医科大学应用基础研究联合专项资金（编号：2 0 2 0 0 1AY070001一168)【作者简介】彭海英（1997 一），女，云南宣威人，在读硕士研究生，主要从事多不饱和脂肪酸对胆囊癌功能及有关基因甲基化修饰影响的研究。E-mail:【通信作者】廖力微（196 5一），女，云南昆明人，主任医师，硕士生导师，主要从事呼吸内科常见及疑难疾病的诊治研究。Em a i l：8 414347 2 5 【文献标识码】A【修回日期】2 0 2 3-0 5-10D0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.19.029现代肿瘤医学2 0 2 3年10 月第31卷第19 期Research progress on DNA methylation modification and treatment of gallbladder cancerPNG Haiying,I Li,I Tantian,HU Haiyn,UO enghen,CHU Mengyua,，LIAO Liweil2Central Laboratory of Yanan Hospital Affiliated to Kunming Medical University,Yunnan Kunming 650051,China;Key Laboratory ofTumor Immunological Prevention and Treatment of Yunnan Province,Yunnan Kunming 650051,China;Kunming Medical University,Yunnan Kunming 650500,China.AbstractGallbladder cancer(GBC)is a rare but highly malignant tumor,with difficulty in early diagnosis,poorprognosis and multi-drug resistance,meanwhile,the pathogenesis of this disease has not been clarified yet.The stud-ies on GBC mainly focuses on the search for early diagnosis biomarkers and therapeutic targets.GBC is considered tobe atype of tumor with epigenetic abnormalities,in which DNA methylation is one of the most common modifying ab-normalities.DNA methylationlevel increases with tumor progression and contributes to the evolution and developmentof GBC,thus it can serve as a potential biomarker.Furthermore,due to the reversibility of DNA methylation,DNAmethylation inhibitors are expected to improve patient prognosis and drug resistance by combining with other drugs.We will discuss the regulation of DNA methylation on GBC,so as to provide someresearch ideas for early diagnosis,prevention and treatment of GBC.Key words gallbladder cancer,epigenetics,DNA methylation,DNA methylation inhibitors胆囊癌（gallbladdercancer,GBC)是一种相对罕见但侵袭性极强的恶性肿瘤，占胆道肿瘤的8 0%95%。2 0 2 2 年我国胆囊癌发病人数约为3.1万例，死亡人数约为2.5万例。胆结石、胆囊息肉（直径 1cm）、慢性胆囊炎及“保胆取石”术后是其明确危险因素2 。胆囊癌预后极差,处于局部进展期或转移期的患者对放化疗均不敏感,5年生存率不足5%。根治性切除术是目前唯一可能治愈胆囊癌的方法。但是,胆囊癌缺乏特异性标志物，即使结合影像、内镜以及肿瘤生物标志物如糖类抗原199（carbohydrate antigen199，CA199）和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）检测，也很难作出准确诊断,大多数患者确诊时已错过手术治愈时机。并且,，手术切除后，胆囊癌5年生存率也只有2 6%3。因此,胆囊癌的研究目前主要集中在早期诊断生物标志物和治疗靶点的寻找上。表观遗传学是在不改变遗传序列的情况下调控遗传表现,包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控4其易受各种体内外因素影响，发生修饰异常，改变基因表达和染色质结构，导致局部甚至全基因转录失调，引起癌变。其中,DNA甲基化在胆囊癌中研究最广泛,甲基化水平差异可能用于区分癌组织与正常组织,是肿瘤潜在特异性生物标志物。并且,与遗传改变不同,DNA甲基化是可逆的,靶向性药物干预可应用于临床治疗。所以,在本篇文章中我们将从DNA甲基化对胆囊癌的调控进行讨论,希望能为胆囊癌的早期诊断、预防和治疗提供一些研究思路。1DNA甲基化与胆囊癌的发生发展DNA甲基化发生在CpG岛(CG island,CGI),由 DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMTs）催化;去甲基化以被动形式或去甲基化酶催化引起（见图1）。甲基化形成的5甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5mC)会招募抑制基因表达的蛋白质,或抑制转录因子与DNA结合,沉默维持细胞稳态、DNA完整性或基因组稳定性相关基因及促进功能惰性异染色质形成5。低甲基化会引起染色体不稳定和激活癌基因或正常沉默基因。甲基化异常均可能引起癌变的发生发MODERN ONCOLOGY,Oct.2023,VOL.31,No.19展“。肿瘤通常呈现一种全基因组低甲基化和特异位点高甲基化模式7 。大量高甲基化沉默的抑癌基因已在肿瘤组织中被发现8 NHPassivedemethylationCytosineActiveTDGdemethylationTDGOHTET5-carboxylcytosine5-formylcytosine图1DNA甲基化及去甲基化模式图Fig.1DNA methylation and demethylation paterns目前,对胆囊癌的发病机制尚未达成共识。其中,DNA甲基化异常是胆囊癌的一个早期、积累性事件,随着肿瘤进展，甲基化频率在不断增加9。1.1DNA甲基化在胆囊化生-异型增生-癌序列中的变化胆结石伴慢性炎症是胆囊癌最常见危险因素3。7 5%90%胆囊癌患者都有胆结石病史。胆结石的存在使患胆囊癌的风险增加2.4倍（胆结石直径2.0 2.9cm）至10.1倍（直径3 cm)10。长期存在的慢性刺激可能会激活细胞内一些酶,参与抑癌基因或细胞周期相关基因的甲基化,促进胆囊癌的发生。目前,胆囊癌的致瘤模型有两种：化生异常增生癌和腺瘤癌序列,最常见的是前者。在智利人群中对比胆囊癌前病变和癌组织DNA甲基化差异发现,胆囊癌的致癌过程包括三个主要甲基化阶段：早期（胆结石和低级别异型增生）、中期（重度异型增生）和晚期（胆囊癌）。并且，甲基化的数量和频率（如Wnt通路、Hedgehog通路相关基因及抑癌基因的甲基化)逐级增加。WIF-1是Wnt信号通路 3679.Modern Oncology 2023,31(19):3678-3683DNMT3ADNMT3BDenovo methylationTET5-hydroxymethylcytosineVHNH5-methylcytosineTETNH.DNMT1Methylationmaintenance3680的一个抑制因子,可抑制细胞增殖和侵袭。多项研究发现，WIF-1高甲基化有助于胆囊瘤的癌变12 。在胆囊癌进展过程中（慢性胆囊炎至早、晚期胆囊癌），多基因（如DAPK1、DLC1、T IM P3和RAR2)甲基化水平显著增加13,许多抑癌基因（E-cadherin、C D K N2 A、REPRI M O）被高甲基化沉默，特定基因(UCHL1)甲基化水平也会下降,影响患者预后。如果上述基因的甲基化状态能够在更多的临床样本中得到验证，可能成为有用的早期生物标志物。1.2胆囊癌中的DNA甲基化修饰目前,胆囊癌DNA甲基化的研究大多基于对特定基因或全基因组甲基化分析,然后验证候选癌基因。已经发现胆囊癌基因组总甲基化水平较胆囊炎低14,低甲基化会导致癌基因激活,高甲基化沉默抑癌基因。对2 4个胆囊组织进行DNA甲基化和蛋白质组学分析,鉴定出了7 种在胆囊癌中高甲基化/表达下调（如FBN1、LPP和SOD3）和6 1种低甲基化/表达上调的基因（例如HBE1、SNRPF、T PD 52)。这些基因参与Wnt、T G F-、ECFR信号转导、炎症和凋亡等多条通路。此外,胆结石或慢性炎症会导致胆囊癌中细胞黏附、细胞周期、p53通路相关基因及一些抑癌基因高甲基化15,促进细胞增殖,包括APC、SHP1、3-O ST -2、CD H 1 和 CDH13、PT EN、CD K N2 A/p 16 及WIF-1等。胆囊癌中抑癌基因FHIT、D U T T 1、BLU 和 SEMA3B的高甲基化可作为肿瘤检测靶标16 。此外,在智利人群中Gene nameWIF-1DAPK1APCSEMA3BCDH133-0ST-2FHITBLUSHPICDKN2A/P16CDH1SOCS-1PTENRASSF1PCP9.5DUTTIMASPINTHBS1UCHL1MCMT长散在重复序列(long interspersed element-1,LINE-1)的甲基化已被证实是全基因组甲基化的替代标志物31。在一项研究中发现32 ,少量胆囊癌表现出与通常甲基化修饰相反的模式，存在微卫星不稳定性（microsatelliteinstability，MSI），但未见LINE-1mRNA高表达及常见基因（如TP53和NRAS)突变,说明其全基因组高甲基化诱导了错配修复蛋白缺损,引起MSI。研究胰腺和胆道液体中LINE-1甲基彭海英，等比较胆囊癌与慢性胆囊炎中2 4个抑癌基因的甲基化频率也发现17 ,3-OST-2在胆囊癌中甲基化频率最高。YEATS4,肺癌相关的一个癌基因，在胆囊癌样本中也显示为低甲基化。除上述差异基因外,MISHRA等人【18 提出,REPRIMO和DAPK1的启动子甲基化频率在胆囊癌中也较高。TIWARI19总结胆囊癌中最常见的异常甲基化基因有p16、APC、PT EN2 0 、CD H 1、RA SSF12 1、M G M T、M A SPIN、T H BS1、RAR2和SOCS-1（见表1）,它们参与细胞分化、生长、修复和调亡等细胞过程。在智利人群中的一项全基因组甲基化检测也发现,与胆囊炎相比,胆囊癌呈全基因组低甲基化和SSBP2、ESR1高甲基化状态,结合APC、p 16 和PCP9.52的高甲基化可明显提高鉴别出胆囊癌的敏感性及特异性2 3。SINGH等人2 4 也提出MASPIN、T H BS1和 SOCS-1高甲基化促进胆囊癌发生发展。最新研究还提出,DKK3基因在胆囊癌中高甲基化且表达降低，可作为其一个潜在抑癌基因2 7 。此外,ABC转运蛋白ABCB1和ABCG2在早期胆囊癌（I期)中明显低甲基化,并且表达显著增加,促进肿瘤发生发展2 8 。在胆囊癌中SHOX2和SEPT9高甲基化可以区分癌组织和正常组织,且SHOX2的效用强于SEPT9。但由于样本量不够,SHOX2和SEPT9甲基化差异对胆囊癌的意义还需进一步研究2 9。Desmin 蛋白在肿瘤中可能发挥抑癌作用,其在胆囊癌中高甲基化且蛋白表达显著降低，可能是胆囊癌潜在生物标志物30 。表1胆囊癌中常见DNA甲基化修饰汇总表Tab.1 Summary table of common DNA methylation modifications in gallbladder carcinomaFunctionA tumor suppressor gene,inhibits Wnt proteins and reduces cell proliferation.A tumor suppressor candidate,is a positive mediator of-interferon induced programmed cell death.The encoded protein acts as an antagonist of the Wnt signaling pathway.The encoded protein can induce cancerous cells apoptosis.Often be down-regulated in cancerous cells,associated with poorer prognosis.Its silencing can result in abnormal modification of HSPGs and abnormal signal transduction.A tumor suppressor gene,the loss of activity results in replication stressand DNA damage.A tumor suppressor gene,is often mutated,deleted,or hypermethylated and silenced in cancer cells.Curbs cancerdevelopment and progressionby attenuating cell proliferationsurvivalmigationandinvasionThe encoded protein can increase cancer proliferation,invasion,and/or metastasis.Encodes a member of the STAT-induced STAT inhibitor(SSI),are negative regulators of cyokine signaling.A tumor suppressor gene,negatively regulates AKT/PKB signaling pathway.A tumor suppressor gene,inhibits the accumulation of cyclin DI and induce cell cycle arest.A serine protease inhibitor,inhibites cl motility,invasion and metastasis.Is frequently lost during oncogenesis and is corelated with poor prognosis.A member of the UCH family,be reported as a carcinogen or tumor suppressor.胆囊癌DNA甲基化修饰与治疗研究进展Methylation frequency72%27%96%92%44%72%40%66%26%80%A tumor suppressor gene,inhibites cell growth.14.8%72.5%27%65%6%30%22.7%36.4%Be over-expressed in various human cancers.27.2%Encodes a tumor suppressors factor.22%70%52%70%(bile)The encoded protein is a DNA repair protein.49%化与 CCI高甲基化还发现2 5,与非癌性疾病相比,胰胆癌中LINE-1甲基化水平降低,并且UCHL1和RUNX3高甲基化有助于诊断胰胆癌。此外,IncRNA PVT1可招募DNMT1诱导抑癌因子miR-18b-5p甲基化,促进胆囊癌细胞增殖332胆囊癌DNA甲基化生物标志物研究胆囊从发育不良进展为晚期癌需约15年。在癌症发生References121315,17 16171717171717,21 17,21 1920 21222324242526现代肿瘤医学2 0 2 3年10 月第31卷第19 期早期检测其前体病变及进展的标志，有助于胆囊癌的早期诊断,改善预后。前文已经总结了胆囊癌中常见甲基化基因，有望单独或组合作为胆囊癌诊断标志物。并且，利用癌与边缘正常组织的甲基化差异，可能作为定位手术切缘的标志34。但是,基于不同群体的胆囊癌的甲基化差异基因并没有统一结论，样本量小的结果也还需进一步验证。目前，大多数研究是利用组织样本检测DNA甲基化。液体活检也能检测释放进人循环中或坏死肿瘤细胞来源的DNA,如循环游离 DNA(circulating free DNA,cfDNA)35。但是，在胆囊癌中，cfDNA表观遗传标记仍处于实验挖掘阶段，尚无临床应用有效数据。KUMARI等人36 检测胆囊癌和正常对照组cfDNA甲基化并未发现明显差异。cfDNA可来源于任何器官，很难依据血液阳性定位到肿瘤部位。因此，肿瘤衍生DNA中器官特异基因的甲基化差异可能是液体活检的首选。此外,尿液甲基化检测与胆囊癌诊断的研究尚未见报道。总结发现，很多潜在标志物都与胆囊癌进展相关，但仅有少数具有临床转化潜能,样本差异及准确可靠检测方法的欠缺可能也是其原因。最新提出了高灵敏特异的DNA生物传感器技术37 ,但缺乏对临床样品的应用,可行性还待评估。3DNA甲基化与胆囊癌的生存预后DNA甲基化积累与胆囊癌不良预后密切相关。半胱氨酸双加氧酶1（cysteine dioxygenase type1,CDO1）高甲基化与预后呈负相关,可能是期高危患者预后及辅助治疗的生物标志物38 。BNIP3是Bcl-2家族促凋亡蛋白成员，从胆结石到胆囊癌晚期,其甲基化水平升高且基因表达下调,与淋巴结转移、低总生存率显著相关39。目前仅有的一项胆管癌和胆囊癌共同DNA 甲基化特征与预后关系的研究40 ,确定了12 个与总生存期显著相关的甲基化预后模型,可能作为针对不同亚型胆囊癌进行特异治疗的依据。并且，低频甲基化与较少拷贝数变化、较少突变负荷和较长总生存期显著相关,高频甲基化改变是预后差的独立因素。在甲基化差异最小的胆管癌组织中观察到较多CD8+T淋巴细胞浸润和PD-L1表达。此外,WIF-1高甲基化可促进胆囊炎恶变为胆囊癌,是胆囊癌5年总生存期的独立预后因素和早期诊断、预后监测的候选标志物。DLC1编码蛋白具有抑癌作用。在胆囊癌组织中,DLC1高甲基化显著降低了患者平均生存率41。此外,在胆囊癌中,MGMT基因甲基化与较好生存率相关2 6 抑癌基因高甲基化是胆囊癌最常见的一种表观遗传修饰。MASPIN已被证明在多种肿瘤中具有抑瘤活性。然而，胆囊癌中MASPIN甲基化较胆结石显著降低,并且与淋巴结转移、肿瘤分期晚和分化低显著相关。在期胆囊癌中,MASPIN169.56pg/mg的患者术后总生存期显著缩短42 。虽然目前尚未提出胆囊瘤的确切甲基化生物标志物，但将潜在标志物与临床特征结合，可能识别更多需要进行积极治疗和监测的患者，改善其预后。4胆囊癌的DNA甲基化治疗表观遗传学变化会影响肿瘤对治疗药物的反应性，针对不同反应机制可对肿瘤进行特异性预防和治疗43。DNA 甲基化的可逆性为肿瘤治疗提出了一种新思路。并且,根据甲基化水平、基因组突变、免疫相关特征,还可将胆囊癌划分为不同亚型进行个性化治疗。MODERN ONCOLOGY,Oct.2023,VOL.31,No.19化,重新激活抑癌基因;诱导转座子（如人内源性逆转录病毒）表达,增加双链RNA，诱导I型干扰素反应和癌细胞凋亡4;上调PD-L1 表达,增强免疫治疗敏感性45 等。抑制剂分为核苷酸类和非核苷酸类,前者需要整合入DNA,与DNMTs形成共价复合物并抑制其作用,如地西他滨和氮杂胞苷；后者不掺人DNA,直接与DNMTs结合后发挥作用46 。但是,大量DNA甲基化抑制剂用于实体瘤治疗的研究还处于临床I/I期试验阶段47 ,且很多因为严重药物毒性、骨髓抑制和低/无反应率等已被迫暂停，在胆囊癌中的研究也尚处于临床前实验阶段。4.1DNA甲基化抑制剂治疗进展DNA甲基化抑制剂如5氮杂胞苷（5azacytidine，AZA)和5氮杂2-脱氧胞苷地西他滨（decitabine，DAC)已被 FDA 批准用于血液肿瘤治疗48 ,并在晚期肺癌患者中也表现出阳性反应。DAC处理胆囊癌细胞后,增加了细胞中多种抑癌基因的表达2 5。然而,2 0 0 7 年DAC与顺铂用于胆囊癌治疗的I期临床试验出现了严重骨髓抑制。此外，基于DNA甲基化对肿瘤免疫环境的影响，去甲基化药物联合免疫治疗可能也是一种治疗选择。在实体肿瘤细胞系中，AZA可诱导抗原提呈和干扰素反应相关基因及PD-L1表达,并减少肿瘤微环境中的免疫抑制细胞4。但是,去甲基化药物与其他抗癌药物联合使用在用于临床之前还有许多障碍需要克服。4.2去甲基化药物与化疗耐药治疗进展基于吉西他滨+顺铂化疗一直是局部晚期或转移性胆囊癌的一线治疗。近年来，免疫检查点抑制剂（卡瑞利珠单抗或纳武单抗)也写入了胆囊癌治疗指南；一些靶向抑制剂（如厄洛替尼)联合治疗也明显提高了患者的生存时间2 。但是，胆囊癌的临床预后仍不理想，主要原因是多药耐药。胆囊癌患者耐药的机制之一是：吉西他滨会损坏延长器复合体完整性和稳定性,影响p53积累，减少癌细胞调亡。延伸乙酰转移酶复合物亚基5（elongatoracetyltransferasecomplexsubunit5,ELP5）可改善吉西他滨的上述现象，诱导细胞毒性作用。所以,ELP5低表达的胆囊癌患者会出现吉西他滨耐药50 。并且,在胆囊瘤中,ELP5 转录抑制与启动子高甲基化高度相关，去甲基化药物DAC可重新激活ELP5表达，恢复延长器复合体U34tRNA的催化功能51。此外,DAC和AZA与传统化疗药物联合应用也表现出了协同作用52 。所以,DAC和吉西他滨序贯联合治疗可能克服胆囊癌患者对吉西他滨的耐药性。免疫疗法为肿瘤治疗带来了前所未有的益处,抗PD1联合靶向治疗或化疗比单独免疫治疗对胆囊癌更有效53-5。有研究发现,用地西他滨治疗白血病会导致 PD-1、PD-L1 和 PD-L2、C T LA -4 表达上调,并且一些表观遗传学药物与免疫检查点抑制剂联合治疗血液肿瘤的临床试验正在进行中56 。DNA甲基化抑制剂的应用为肿瘤治疗提供了一个新的方向，但是非选择性的修饰可能导致全基因组甲基化变化，从而造成复杂的生物反应或恶性反应。总体上,DNA甲基化抑制剂和抗肿瘤药物的联合治疗疗效比单独使用抗肿瘤药物更高。3681DNA甲基化抑制剂的抗癌作用机制主要有：逆转甲基:36825总结DNA甲基化在胆囊癌发生发展中起着重要作用,在探寻胆囊癌早期诊断标志物、预防和治疗方法中前景广阔。然而,基于不同群体的研究并没有寻找到普遍的表观遗传生物标志物。此外,胆囊癌的生物样本量较小，以至于找到单个特异DNA甲基化标志物仍然困难。已有较多研究发现胆囊癌中常见甲基化差异基因,如p16、A PC、PT EN、CD H 1和CDH13、M A SPIN、SO CS1和PGP9.5等。将潜在DNA甲基化标志物与临床特征结合，必定能提高胆囊癌的诊断和预后评估效果，去甲基化药物也有望与其他药物联合应用来改善患者预后及耐药性。但是，目前仍需要进行更多更大规模的研究来阐明胆囊癌的甲基化机制,包括特异基因甲基化及精确的CGI甲基化位置,以提高其作为生物标志物的可能及其他临床应用的潜力。1 XIA C,DONG X,LI H,et al.Cancer statistics in China and UnitedStates,2022:profiles,trends,and determinants J.Chin Med J(Engl),2022,135(5):584-590.2 付佳禄，李起，张东，等.胆囊癌诊断和治疗指南（2 0 19版）更新解读J.肝胆胰外科杂志，2 0 2 0,32（11）：6 59-6 6 3.FU JL,LI Q,ZHANG D,et al.Guidelines for diagnosis and treat-ment of gallbladder cancer(2019 edition)updated interpretationJ.Journal of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery,2020,32(11):659 663.3RAWLA P,SUNKARA T,THANDRA KC,et al.Epidemiology ofgallbladder cancer J.Clin Exp 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