中枢神经元烟碱型乙酰胆碱受体的显示方法.doc

中枢神经元烟碱型乙酰胆碱受体的显示方法

【关键词】 神经元

关键词: 神经元;烟碱;受体，胆碱能;抗体;重症肌无力

摘 要:目的 用重症肌无力（MG）患者的乙酰胆碱受体抗体

（AChRab）选择性地显示神经元烟碱型乙酰胆碱受体. 方法 用 Elisa

法测定 MG 患者血中的 AChRab 滴度，然后用硫酸铵盐析和免疫亲和层

析法提取纯化 AChRab，再用免疫组化法探讨 AChRab 与大鼠 CNS 神经

元-nAChR 之间的免疫结合反应. 结果 首次表明 AChRab 与神经-nAChR

之间的阳性免疫结合反应广泛分布于鼠 CNS 许多部位，如大脑皮层、

脑干各颅神经运动核团、脊髓运动神经元等部位，与用其他方法显示

者其分布一致或类同. 结论 MG 患者 AChRab 可与大鼠和猴 CNS 神经

-nAChR 交叉结合;可用于选择性地显示 CNS 神经-nAChR.

Keywords:neurons;nicotine;receptors ，

cholinergic;anti-bodies;myasthenia gravis

Abstract:AIM To study the method of expression of

neu-ronal nicotinic acetylcholine receptor by acetylcholine

receptor antibody purified from myasthenia gravis serum.METHODS

ELISA assay was applied to detect the acetylcholine recep-tor

antibody （ AChRab ） .AChRab was purified by im-munoaffinity

tomography method and was used to study the immunoreaction

1

between acetylcholine receptor antibody and rat central nervous

system neuronal nicotinic acetylcholine re┐ceptor.RESULTS The

positive immunoreaction between acetylcholine receptor

antibody and central neuronal nicotinic acetylcholine receptor

was widely distributed in rat central nervous system ， for

instance，cerebral cortex，brain stem motor necleus and spinal

motor neurons.The distribution pattern was consistent with

other methods.CONCLUSION AChRab from MG can crossreact with rat

neuronal nicotinic acetylcholine receptor and can selectively

express central neu-ronal nicotinic acetylcholine.

0 引言

既往多采用放射自显影、原位杂交和免疫组化法来，研究中

枢胆碱能神经系统［1-3］ .乙酰胆碱酯酶组化和 ChAT 免疫组化法等

不能特异性地显示神经-mAChR 和神经-nAChR.目前用原位杂交和抗神

经-nAChRa和b亚单位亚型单抗免疫组化法来研究 CNS 中神经-nAChR

各亚型的分布及其与某些疾病发病机制之间的关系， 但技术操作繁琐，

不易广泛推广应用.

分析肌和神经-nAChR 亚型基因组成和结构，发现两者均属于配

体-门控-离子通道基因家族，两者的同源性达 80%～90%［4］ .重症

肌无力（MG）的 AChRab 可特异性地与肌-nAChRa-亚单位主要免疫区

2

结合［5，6］ .因此，AChRab 也有可能与 CNS 中的神经-nAChR 免疫交

叉结合，选择性地显示神经-nAChR.本项研究，先提取纯化 AChRab，

然后利用免疫组化法探讨 AChRab 与鼠 CNS 神经-nAChR 之间的免疫结

合反应，旨在建立一种简便易行的显示 CNS 神经-nAChR 的方法.

1 材料和方法

1.1 提取和纯化 AChRab 根据典型的 MG 症状，阳性的抗胆碱

酯酶药物试验和血清中 AChRab 滴度测定结果诊断 MG.利用 Protein G

（Sigma）从 3 例 AChRab 阳性的全身型 MG 患者血中提取纯化 AChRab.3 ，

名健康者为正常对照.

1.2 免疫组化 选成年 SD 大鼠各 20 只，平均体质量 250～

300g.用戊巴比妥深度麻醉，左心插管，用 40g L-1 的冷（4℃）多聚

甲醛液 400mL 灌注固定 20～30min;迅速取脑，入 200g L-1 蔗糖溶液

1d.取全脑续列冰冻切片，40mm 厚，入 3g L-1 TritonX-100，室温下

30min，然后用 KPBS（0.01mol L-1 ）洗 3 次，15min/次;然后分别用

AChRab（KPBS1 100 稀释） 和从健康人血中提取的 IgG， ℃下孵育 48h， 4

KPBS 洗 3 次，15min/次;用生物素化羊抗人-IgG（武汉博士德公司）

室温下孵育切片 4h，KPBS 洗 3 次，15min/次;最后用生物素-亲和素

（Sigma）室温下孵育切片 3h，KPBS 洗 3 次，15min/次.用二甲基联苯

铵-硫酸镍铵加强法呈色，适时终止反应.

3