氧化应激后大鼠神经元内Nogo.doc

氧化应激后大鼠神经元内 Nogo

【关键词】 神经元

【Abstract】 AIM: To investigate the change of NogoA

expression in cerebral cortex neurons after oxidative stress and

its possible functions. METHODS: Primarily cultured cerebral

cortex neurons in rats were treated with H2O2 for 8 h and the

morphology of neurons was observed. Hoechst33342 and PI staining

were performed to detect apoptosis and necrosis of neurons, and

NogoA expression was detected by Western blot. RESULTS: We

observed that soma of neurons condensed, rounded, even collapsed,

and processes disrupted and shed after treatment with 10 mmol/L

and 100 mmol/L H2O2. Hoechst33342 and PI staining showed that,

compared with that of control group, the percentage of apoptosis

and necrosis did not increase after neurons were treated with

1 mmol/L H2O2, while it significantly increased after neurons

were treated with 10 mmol/L and 100 mmol/L H2O2 (P<0.05).

Western blot analysis showed that NogoA expression had no

difference with that of control group after neurons were treated

with 1 m mol/L H2O2, whereas was significantly higher than

control group after neurons were treated with 10 mmol/L and 100

m mol/L H2O2 (P<0.05). CONCLUSION: Oxidative stress may

upregulate the expression of NogoA in neurons, and NogoA is

1

presumed to be involved in the pathological processes of CNS

degenerative diseases.

【Keywords 】 rat; neuron; oxidative stress; NogoA;

Western blot

【摘要】 目的: 探讨大鼠大脑皮层神经元受到氧化应激后

NogoA 表达的变化及其可能的作用. 方法: 体外原代培养大鼠大脑皮

层神经元，给予不同浓度 H2O2 处理 8 h 后，倒置相差显微镜下观察神

经元的形态学变化、Hoechst33342 和 PI 染色观察凋亡和坏死情况，

然后 Western blot 观察 NogoA 的表达变化. 结果: 大鼠皮层神经元受

到 10 和 100 mmol/L H2O2 刺激后，神经元出现胞体回缩、变圆甚至

崩解,突起断裂、脱落等细胞受损的现象；Hoechst33342 和 PI 染色观

察到 1 mmol/L H2O2 时神经元凋亡和坏死比例与对照组相比没有差

别，而 10 和 100 mmol/L H2O2 刺激后，神经元凋亡和坏死比例明显

增加（P<0.05） Western blot 结果显示， mmol/L H2O2 时 NogoA
. 1

的表达量与对照组相比无明显差异，而在 10 和 100 mmol/L 时 NogoA

的表达量明显升高（P<0.05）. 结论: 氧化应激可以上调神经元

NogoA 的表达.

【关键词】 大鼠；神经元；氧化应激；NogoA；Western blot

0 引言

氧化应激在许多中枢神经系统（CNS）疾病的发生发展中起重

要作用. 细胞受到氧化应激后基因表达发生改变，并伴随转录因子表

达的改变以适应环境变化［1］. 神经元经 H2O2 处理后，转录因子 Sp1

2

（specificity protein 1） 水平迅速升高而且与 DNA 结合能力也升高.

NogoA 是 CNS 损伤后最重要的轴突再生抑制因子. NogoA 在 CNS 中还具

有其他功能［2］. NogoA 5′端上游区有 12 个可与 Sp1 结合的位点，

即 Sp1 可以调节 NogoA 的表达［3］. 我们体外培养大鼠大脑皮层神经

元， 给予 H2O2 刺激并观察 NogoA 的表达变化， 以期探讨神经元内 NogoA

可能参与的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM, FBS, Neurobasal medium, B27 supplement, DHanks

平衡盐液购自 Gibco 公司；胰酶、多聚赖氨酸、EDTA, Hoechst33342

和 PI 购自 Sigma 公司；6 孔、24 孔板购自 NUNC 公司；300 mL/L H2O2

分析纯购自西安化学试剂公司；NogoA 兔多克隆抗体由本室制备［4］ ；

BM Chemiluminescence Western Blotting Kit 购 自 Boehringer

Mannheim 公司. 新生 SD 大鼠由第四军医大学实验动物中心提供. 所

用的 6 孔、24 孔板和玻片预先经 100 mg/L 多聚赖氨酸硼酸盐缓冲液

37℃包被 4 h，三蒸水洗 3 遍晾干备用.

1.2 方法

新生 SD 大鼠经冷冻麻醉，碘酒乙醇消毒,无菌操作下，将头

剪下放入预冷的 DHanks 平衡盐液中. 在解剖显微镜下分离并取出大

脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约 1 mm×1 mm×1 mm 大小，加入胰酶

－EDTA 消化液，37℃孵箱内消化 20 min，中间摇晃 1 次. 随后吸出组

织转移到装有预冷培养液（DMEM＋100 mL/L FBS）的离心管内，用巴

3