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人 Lrp 蛋白多克隆抗体的制备

作者：于欣平，宋庆贺，侯立朝，杜可军，熊利泽，陈苏民，陈

南春，代忠明

【摘要】 目的：制备人 Lrp 蛋白多克隆抗体. 方法：克隆全长

lrp cDNA 编码序列并进行原核表达与鉴定. 用镍离子螯合柱(Ni

NTA)纯化原核表达的全长 Lrp 蛋白，获得纯度较高的目的蛋白. 用纯

化后蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应

成分. 结果：Western 印迹结果表明，纯化前后的抗血清在 69 ku 处

均检测到目的蛋白条带，说明吸附纯化后的抗体可以与 Lrp 蛋白特异

结合. 而纯化后抗体 Western 印迹结果目的条带只有一条，说明吸附

纯化后得到高特异性抗血清，其免疫印迹的效价在 10-6 以上，有较高

免疫印迹滴度. 结论：成功制备了高效价高特异性的兔抗人 Lrp 蛋白

的多克隆抗体，为 Lrp 功能的进一步研究提供了重要的实验工具.

【关键词】 脂多糖类

0 引言

脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是细菌内毒素，是革兰

氏阴性（G-）细菌感染的主要致病因子，它与某些炎症的发生密切相

关［1］. 探讨脂多糖刺激后表达发生改变的基因的功能，有针对性地

1

研究其在 LPS 信号转导通路中的作用部位及作用性质，有助于增加对

炎症反应分子机制的认识. 人 lrp（lipopolysaccharide responsed

gene, lrp）是一种脂多糖应答基因. 系本课题组采用基于 PCR 的改良

消减杂交技术，从 LPS 刺激后的人牙髓细胞差异表达基因文库中筛选

出的应答基因［2］ GenBank 录入号为 AF143740. 但当时得到的只是 ，

该基因编码 N 端 186 个氨基酸的序列. 随后全长 cDNA 也被克隆并录

入 GenBank（录入号 NM018360）. 本课题组克隆了全长 lrp cDNA

编码序列并进行了原核表达与鉴定［3］. 分析表明，全长人 lrp 编码

528 个氨基酸， 并有亮氨酸拉链的特征结构. 本实验对原核表达的 Lrp

蛋白进行纯化，用纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清.

1 材料和方法

1.1 材料大肠杆菌 BL21(DE3)由本室保存；重组人 lrp 融合

表达载体 pcTAT hlrp 由本课题组构建保存. LPS(Sigma 公司)；HRP

标记的羊抗兔 IgG 及化学发光底物(Pierce 公司)；弗氏完全、不完全

佐剂(GibcoBRL 公司)；Ni NTA 纯化系统(Qiagen 公司)；纯种新西

兰大白兔(第四军医大学实验动物中心).

1.2 方法

1.2.1Lrp 的表达纯化将重组人 lrp 融合表达载体 pcTAT

2

hlrp 转化转化 BL21（DE3）感受态细菌，挑单菌落扩大培养后 IPTG（终

浓度为 0.2 mmol/L）诱导表达 6His TAT Lrp 融合蛋白. 将诱导

后的菌液 2292 g/min 离心 10 min，收集菌体，用 STE (100 g/L 蔗糖,

10 mmol/L Tris Cl pH 8.0, 1 mmol/L EDTA pH 8.0)洗 1 遍；离心

收集菌体后用 STE 重悬， 超声破碎菌体(整个过程均在冰浴中)， 201 13

g，4℃，离心 30 min，收集包涵体沉淀，再用包涵体溶解缓冲液（50

mmol/L Tris Cl pH 8.0, 1 mmol/L EDTA pH 8.0, 100 mmol/L NaCl,

8 mol/L 尿素）溶解沉淀，13 201 g/min，4℃，离心 30 min，收集上

清； 用镍离子金属螯合柱(Ni NTA)纯化 Lrp 蛋白(按公司提供的操作

说明进行)，并作 SDS PAGE 分析.

1.2.2 抗体制备用约 40 mg 纯化的 Lrp 蛋白于脊柱两侧多点

注射免疫新西兰大白兔，免疫周期为 0 d, 7 d, 28 d, 35 d. 第 1 次

加弗氏完全佐剂，其余 3 次加弗氏不完全佐剂. 第 4 次免疫 1 wk 后颈

动脉取血，37℃静置 12 h 分离血清，1467 g/min 离心 10 min 去除残

留红细胞. 将制备的抗血清按 1∶104 稀释， 免疫前兔血清为对照对 以

诱导表达 Lrp 后的全菌蛋白样品进进行 Western Blot 分析检测抗体.

1.2.3 抗 Lrp 抗血清的吸附纯化和特异性鉴定培养转化 pcTAT

载体的 BL21（DE3） ，收菌后用 STE 重悬浮菌体沉淀，加入溶菌酶（每

克湿菌 3 mg）作用 1.5 h，加脱氧胆酸钠（每克湿菌 4 mg）搅动 10 min，

再加 1 g/L 的 DNaseⅠ（每克湿菌 4 mL） 搅拌直至不再粘稠(以上操 ，

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