大叶杨干旱和水淹胁迫的转录组分析.pdf

西北植物学报,2 0 2 3,4 3(1 0):1 6 5 3-1 6 6 2A c t a B o t.B o r e a l.-O c c i d e n t.S i n.d o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 0-4 0 2 5.2 0 2 3.1 0.1 6 5 3 h t t p:/x b z w x b.a l l j o u r n a l.n e t收稿日期:2 0 2 3-0 3-2 3;修改稿收到日期:2 0 2 3-0 7-1 0基金项目:国家重点研发计划项目(2 0 2 2 Y F D 2 2 0 1 2 0 0);国家自然科学基金项目(3 1 9 7 1 5 6 7)作者简介:张佳琪(1 9 9 8-),女,硕士研究生,主要从事野生动植物保护与资源利用研究。E-m a i l:z h a n g_j q 2 0 2 1o u t l o o k.c o m*通信作者:王 婧,教授,博士生导师,主要从事林木演化基因组学和遗传育种学研究。E-m a i l:w a n g j i n g 2 0 1 9s c u.e d u.c n大叶杨干旱和水淹胁迫的转录组分析张佳琪,张新新,冯佳珺,施婷婷,张钰麟,王 婧*(四川大学 生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都 6 1 0 0 0 0)摘 要:大叶杨(P o p u l u s l a s i o c a r p a)是中国特有的杨属物种,干旱和水淹是影响大叶杨生长和分布范围的2个关键因子。A P 2/E R F转录因子家族在植物响应非生物胁迫中发挥重要作用。研究采用转录组测序、生物信息学分析手段并结合分子实验验证初步鉴定了参与大叶杨干旱和水淹胁迫响应的关键基因。研究结果显示,(1)在大叶杨中分别鉴定到3 9 8 6/3 8 5个响应干旱/水淹胁迫的差异表达基因,其中包括2 3 7个同时响应干旱和水淹胁迫的差异表达基因。(2)在大叶杨中共鉴定到2 0 5个A P 2/E R F家族成员,系统发育分析表明其在大叶杨中主要分为5个亚家族,并显著富集于差异表达基因中。(3)筛选部分胁迫前后差异表达的P l A P 2/E R F基因进行q R T-P C R实验,经证实这些基因在大叶杨受到干旱/水淹胁迫时均可被诱导表达。综上,大叶杨在水淹胁迫下的差异表达基因数量明显少于干旱胁迫,A P 2/E R F基因家族的部分基因参与到大叶杨干旱/水淹胁迫的应激表达过程。关键词:大叶杨;A P 2/E R F;水淹胁迫;干旱胁迫;差异表达中图分类号:Q 7 8 6;Q 7 8 9;S 7 9 2.1 1文献标志码:AT r a n s c r i p t o m i c A n a l y s i s o f P o p u l u s l a s i o c a r p a i n R e s p o n s e t o D r o u g h t a n d W a t e r l o g g i n g S t r e s sZ HANG J i a q i,Z HANG X i n x i n,F E NG J i a j u n,S H I T i n g t i n g,Z HANG Y u l i n,WANG J i n g*(K e y L a b o r a t o r y o f B i o-r e s o u r c e a n d E c o-e n v i r o n m e n t o f M i n i s t r y o f E d u c a t i o n,C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e,S i c h u a n U n i v e r s i t y,C h e n g d u 6 1 0 0 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:P o p u l u s l a s i o c a r p a i s a p o p l a r s p e c i e s o n l y l o c a l l y d i s t r i b u t e d i n C h i n a,a n d i t s g r o w t h a n d d i s-t r i b u t i o n r a n g e i s s e r i o u s l y c o n s t r a i n e d b y e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s s u c h a s d r o u g h t a n d w a t e r l o g g i n g.A P 2/E R F t r a n s c r i p t i o n f a c t o r f a m i l y p l a y s i m p o r t a n t r o l e s i n r e s p o n s e t o a b i o t i c s t r e s s e s i n p l a n t s.I n t h i s s t u d-y,w e i n t e g r a t e d t r a n s c r i p t o m e s e q u e n c i n g,b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s a n d e x p e r i m e n t a l v a l i d a t i o n t o i n v e s t i-g a t e g e n e s t h a t a r e l i k e l y t o b e i n v o l v e d i n r e s p o n s e s o f d r o u g h t a n d w a t e r l o g g i n g s t r e s s e s.T h e m a i n r e-s u l t s w e r e p r e s e n t e d a s f o l l o w s,(1)a t o t a l o f 3 9 8 6 a n d 3 8 5 d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s(D E G s)w e r e d e t e c t e d u n d e r d r o u g h t a n d w a t e r l o g g i n g c o n d i t i o n s,r e s p e c t i v e l y,o f w h i c h 2 3 7 D E G s w e r e s h a r e d u n d e r d r o u g h t a n d w a t e r l o g g i n g s t r e s s e s.(2)A t o t a l o f 2 0 5 A P 2/E R F m e m b e r s w e r e i d e n t i f i e d i n P.l a s i o c a r-p a,w h i c h w e r e c l u s t e r e d i n t o f i v e s u b f a m i l i e s a n d s i g n i f i c a n t l y e n r i c h e d i n D E G s.(3)M u l t i p l e P l A P 2/E R F d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s t h a t a r e i n v o l v e d i n t h e r e s p o n s e s t o d r o u g h t a n d w a t e r l o g g i n g s t r e s s e s w e r e f u r t h e r c o n f i r m e d b y q R T-P C R.I n c o n c l u s i o n,t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e n u m b e r o f D E G s u n d e r w a t e r l o g g i n g s t r e s s w e r e l e s s t h a n t h a t u n d e r d r o u g h t s t r e s s i n P.l a s i o c a r p a.P l A P 2/E R F g e n e s w e r e h i g h l y i n v o l v e d i n t h e p r o c e s s o f a b i o t i c s t r e s s r e s p o n s e s.K e y w o r d s:P o p u l u s l a s i o c a r p a;A P 2/E R F;w a t e r l o g g i n g s t r e s s;d r o u g h t s t r e s s;d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n 大叶杨(P o p u l u s l a s i o c a r p a)是杨柳科(S a l i-c a c e a e)杨属(P o p u l u s)大叶杨组的落叶乔木,主要分布于中国湖北、四川、陕西、云南、贵州等地,生长在海拔1 3 0 01 5 0 0 m的山坡、灌丛等水资源较为丰富的区域1,是中国特有的杨属物种。相较于其他广域分布的杨属植物如山杨、银白杨、青杨等2,大叶杨的分布范围较为局限,这可能与其喜湿的生长习性有关。近年来,全球气候变暖导致极端气候事件频发,这可能导致干燥地区变得更加干燥,潮湿地区则变得更加潮湿3。I P C C A R 6报告指出,在过去的5 0余年,全世界范围内强降水事件频发以及干旱事件增加4,而由此引发的干旱和洪水等自然灾害已经严重阻碍了中国林业建设与发展和生态环境的改善。因此在地区生境条件日益恶劣的背景下,培育抗逆性较强的树种并制定相应的保护和育种措施是恢复与重建生态系统平衡和提高林业生产力的重要方式。长期的洪涝会使得土壤含水量处于饱和状态,植物的有氧呼吸逐渐替换为无氧呼吸5,其形态结构、生长生理和新陈代谢等逐步受到影响6-8。如枫杨在水淹1 2 h后,体内类黄酮合成、亚麻酸、茉莉酸等代谢途径明显活跃9。而缺水造成的干旱胁迫可能导致农作物和林木的减产,超过其他环境因子胁迫所造成减产的总和1 0。另外,缺水环境下也能够引起植物的叶子或幼果释放大量的乙烯,从而脱叶、落果1 1。植物也可通过增加体内的脱落酸含量以提高抗旱能力1 2。因此为了维持自身的生长发育,植物在分子水平上已进化出一系列响应非生物胁迫的机制。而外界的非生物胁迫也能影响植物体内功能基因和调控基因的表达1 3-1 4,其中就包括调控基因表达的众多转录因子家族成员1 5。A P 2/E R F转录因子家族在植物的生长发育、代谢以及生物和非生物胁迫的响应中发挥了关键作用1 6。根据A P 2/E R F结构域的数量以及是否含有其他结构域将其分为5个亚家族1 7:A P 2、E R F(响应乙烯)、D R E B(与脱水响应元件结合)、R AV、S o l o i s t。A P 2亚家族含有2个串联重复的A P 2/E R F结构域;E R F和D R E B亚家族中只含有1个A P 2结构域,其共同特点是基因结构中内含子数量很少1 8,但是二者具有不同的作用,E R F亚家族主要与乙烯响应元件结合1 9,而D R E B亚家族,主要通过D R E/C R T顺式作用元件来调控基因的表达2 0;S o l o i s t亚家族也只含有1个A P 2/E R F结构域,但是核苷酸序列和基因结构与E R F等亚家族明显不同,并且核苷酸序列在很多植物中高度保守1 7;R AV亚家族除了含有1个A P 2/E R F结构域外,还带 有1个B 3结构 域。A P 2亚家族主要在植物生长发育阶段起重要作用,例如开花2 1、种子生长与萌发2 2等;E R F主要作用于激素信号传导、非生物胁迫响应等2 3;R AV主要参与叶片衰老、生物与非生物胁迫响应调控2 4;S o-l o i s t在拟南芥中仅包含1个基因,调控水杨酸的合成以及防御细菌病原体的入侵2 5。目前对于大叶杨的研究多集中于种质资源调查和保存2 6,而对于大叶杨如何响应非生物胁迫以及其胁迫耐受能力研究鲜有报道。本研究通过对水淹和干旱胁迫后的大叶杨进行转录组测序,结合生物信息学分析鉴定到一系列响应胁迫的差异表达基因,并发现大叶杨中A P 2/E R F转录因子家族成员在胁迫响应基因中显著富集,最后筛选出可能参与调控干旱或水淹胁迫耐受的候选基因。该研究结果将为今后深入探究极端水分环境下大叶杨的分子响应过程和适应性进化奠定基础,为大叶杨分子遗传育种提供理论参考。1 材料和方法1.1 试验材料大叶杨种子采集于四川省凉山彝族自治州美姑县瓦候乡(2 8 4 3 N,1 0 3 8 E),铺种萌发后移至温室进行培养,温室生长条件为:光照1 6 h,(2 51),黑暗8 h,(2 01),空气湿度在7 0%左右。待植株高度生长到3 04 0 c m时,挑选一部分进行预实验以此确定水分胁迫时间(以出现表型变化但未枯死不影响测序为准),最终确定干旱胁迫时间为5 d,水淹胁迫为1 5 d。挑选出长势均匀良好的植株用于正式试验。1.2 胁迫处理正式试验将材料分为3组:水淹(w a t e r l o g g i n g s t r e s s,WS)处理组(水没过盆土3 c m左右)、干旱(d r o u g h t s t r e s s,D S)处理组(胁迫开始前保持正常浇水,胁迫开始后停止浇水,干旱胁迫结束时土壤含水量约在5 6%)以及对照(c o n t r o l g r o u p,C K)控制组(保持正常浇水,土壤含水量在7 0%8 0%)。为确保胁迫结束的时间一致,于2 0 2 1年1 1月1 8日早上9:0 0先开始水淹胁迫处理,在水淹胁迫的第1 0天早上9:0 0 D S组材料停止浇水,开始干旱胁迫处理,期间保持所有处理组及对照组材料在相同环境,水淹处理组的水每3 d更换1次,以免微生物滋生干扰结果。4561西 北 植 物 学 报 4 3卷在水淹和干旱胁迫第3天和胁迫结束的最后一天采集样品,每组各取3株叶片材料用于转录组学测序,叶片统一取第56片新鲜的成熟叶片,并用液氮速冻后暂存于-8 0 冰箱。将试验样品材料送至深圳华大基因股份有限公司(h t t p s:/www.b g i.c o m/),使用T 7 P E 1 5 0平台进行c D NA文库构建和R NA-S e q测序,每组处理的3株材料作为生物学重复。1.3 生物信息学分析原始测序数据(r a w r e a d s)先用F a s t Q C2 7检验数据质量,T r i mm o m a t i c2 8过滤接头及低质量 的r e a d s。过滤后的r e a d s用H I S AT 22 9比对到组装好的大叶杨参考基因组上,再用S t r i n g T i e3 0统计基因表达量,得到标准化后的T PM(t r a n s c r i p t s p e r k i l o b a s e o f e x o n m o d e l p e r m i l l i o n m a p p e d r e a d s)值。根 据 脚 本p r e p D E.p y(h t t p s:/g i t h u b.c o m/g p e r t e a/s t r i n g t i e/b l o b/m a s t e r/p r e p D E.p y)生成用于D E S e q 23 1差异表达分析的矩阵(c o u n t)文件,将错误发现率F D R(f a l s e d i s c o v e r y r a t e)0.0 5,差异倍数|l o g2 F D|1的基因定义为差异表达基因(d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s,D E G s)。t o p GO3 2包对D E G s进行GO富集分析。1.4 大叶杨A P 2/E R F转录因子家族分析在P f a m蛋 白 质 家 族 数 据 库(h t t p s:/p f a m-l e g a c y.x f a m.o r g/)下载A P 2保守结构域的蛋白序列(序列号:P F 0 0 8 4 7)HMM文件,HMM E R v 3.1 b 23 3(h t t p:/h mm e r.o r g/)鉴定大叶杨基因组数据库中的A P 2/E R F候选基因。S MA R T(h t t p s:/s m a r t.e m b l.d e/)和N C B I C D D(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/c d d/)在线数据库对基因蛋白序列进行检测,保留有A P 2保守结构域的序列用于后续分析。在P l a n t T F D B植物转录因子数据库(h t t p:/p l a-n t t f d b.g a o-l a b.o r g/)中下载拟南芥A P 2/E R F基因家族成员的蛋白质序列。M u s c l e v 3.8.3 13 4对大叶杨和拟南芥的目的基因蛋白序列进行多序列比对,t r i-mA L v.1.4.13 5快速修剪和对齐,M E G A 1 13 6中采用 N J(n e i g h b o r-j o i n i n g)法构建系统发育树,B o o t s t r a p设置为1 0 0 0,在F i g T r e e v 1.4.4(h t t p:/t r e e.b i o.e d.a c.u k/s o f t w a r e/f i g t r e e/)对树进行可视化。1.5 q R T-P C R验证提取R NA后反转录得到c D NA原液用于实时荧光 定 量P C R3 7实 验。N C B I P r i m e r(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/t o o l s/p r i m e r-b l a s t/)对1 2个大叶杨A P 2/E R F家族成员在线设计候选基因和内参基因的特异性引物(表1),U B Q-1 0为内参基因3 8。采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的(h t t p s:/www.v a z y m e.c o m/H o m e.h t m l)试剂T a q P r o U n i v e r s a l S Y B R q P C R M a s t e r M i x进行定量分析。每个孔总体系为2 0 L:1 L模板c D NA,0.4 L上游引物,0.4 L下游引物,1 0 L 2T a p P r o U n i v e r s a l S Y B R q P C R M a s t e r M i x,8.2 L无菌水。每个样品有3个技术重复。扩增反应程序设置为:9 5 预变性3 0 s;9 5 1 0 s,6 0 3 0 s,循环4 0次;9 5 1 5 s,6 0 6 0 s,9 5 1 5 s,循环1次。用2-CT法3 7计算候选基因相对于内参基因的表达量。表1 引物设计信息T a b l e 1 P r i m e r d e s i g n i n f o r m a t i o n基因名 G e n e n a m e引物序列 P r i m e r s e q u e n c e(5 3)正向引物 F o r w a r d p r i m e r(F)反向引物 R e v e r s e p r i m e r(R)P o l a s 0 0 8 0 4AAA T GA G G G G C A G GAAA G C AC G T C A GAAAA G C C C T C C A C TP o l a s 0 5 7 6 3C A T T T C C A C C AA G C AA G C G TC AAA T C C G T T G G T G G T T G G CP o l a s 1 0 3 8 4T C A GAA C C A G GAA C C AT G C CT C AAAA T T G G G C T C C C T C C CP o l a s 2 6 1 3 1C G C AGA GA G GA T T G T G G GA CC C A C C C AA G T A C A C C T C T C CP o l a s 2 8 1 1 5AAAA C A G G G G GAAA C A G G G GA GAT A GA G C T G G T GA G G G T GAP o l a s 3 5 2 8 2AA G C T G C AA G G G C T T A T GA C AT T T T G G T T G C C G T C T C C A C T AP o l a s 2 7 9 9 3G GA G C T GAAAAG T G G C GAA CA C G T G T C AAA G C A G T C A C C AP o l a s 0 1 1 3 1T G T GA GA T G C G G GAA C C AAAT C C A G G C AGAA T C A G C GAA GP o l a s 0 8 8 8 4GAA T C A T C A G G GAA T G C T G C GC G T T G T G C C T A T C C T GA C C AP o l a s 3 7 9 7 0AG C GA C T C T C T T T T C A C C G CT GA GA G C A G C AA C C A T C A C GU B Q-1 0C C AA G C C C AA GAA GA T C AAG CG C A C C G C A C T C AG C AT T A G G55611 0期 张佳琪,等:大叶杨干旱和水淹胁迫的转录组分析表2 转录组样本数据概述T a b l e 2 S u mm a r y o f t h e t r a n s c r i p t o m e s a m p l e d a t a组别G r o u p样本S a m p l e原始测序读段R a w r e a d s过滤后测序读段C l e a n r e a d sQ2 0/%Q3 0/%1链 1 c h a i n2链 2 c h a i n1链 1 c h a i n2链 2 c h a i nG C含量G C c o n t e n t/%比对率M a p p e d r a t i o/%深度D e p t h/碱基数量G b a s e/G对照C o n t r o lC K-18 3 9 7 2 6 4 88 1 1 1 3 0 1 29 8.4 39 6.8 49 5.5 69 2.1 94 4.1 09 4.1 23 2.8 0 1 81 1.7C K-27 9 1 6 2 1 2 07 5 2 7 8 9 3 49 7.3 49 6.4 09 2.1 58 9.8 64 3.9 19 2.4 72 8.9 1 1 41 0.7C K-39 9 4 0 8 9 7 89 4 9 4 7 9 1 89 7.5 99 7.5 09 3.7 89 3.1 64 4.3 79 4.4 63 3.7 2 3 51 3.7水淹3 dW a t e r l o g g i n g f o r 3 d a y sWS-3 d-18 3 4 4 1 9 9 87 7 4 5 0 0 6 09 6.7 69 7.0 39 1.9 99 2.4 24 3.6 39 3.9 33 4.5 2 9 81 1.1WS-3 d-28 5 3 4 0 3 6 47 9 2 2 9 1 7 69 6.7 09 7.0 59 1.8 59 2.4 64 3.9 29 3.9 13 7.3 9 1 51 1.4WS-3 d-38 6 0 5 4 6 4 87 9 6 7 5 8 0 69 6.6 89 7.0 89 1.8 19 2.5 34 3.9 09 4.5 33 2.2 7 2 31 1.5水淹1 5 dW a t e r l o g g i n g f o r 1 5 d a y sWS-1 5 d-18 2 5 8 2 6 7 27 8 8 2 2 5 1 29 7.6 39 7.4 39 3.8 49 2.9 64 3.9 39 4.8 53 1.6 3 4 11 1.4WS-1 5 d-29 2 0 1 2 4 7 08 7 5 7 4 8 1 49 7.5 09 7.3 39 3.5 09 2.7 34 3.6 89 4.5 33 3.4 2 6 01 2.7WS-1 5 d-31 0 5 5 0 8 0 4 81 0 1 1 2 0 1 0 49 7.6 79 7.7 49 4.0 19 3.8 24 3.1 09 3.7 13 0.7 0 3 81 4.6干旱3 dD r o u g h t f o r 3 d a y sD S-3 d-11 0 3 1 8 7 8 1 29 8 9 0 6 6 9 09 7.8 39 7.3 89 4.1 69 3.0 74 3.6 39 3.9 73 0.4 3 6 1 1 4.3D S-3 d-21 0 5 6 2 7 0 6 61 0 1 0 3 7 7 5 89 7.9 09 7.3 79 4.3 79 3.0 44 3.7 59 4.1 73 1.5 2 3 21 4.6D S-3 d-38 8 7 4 6 5 5 08 4 7 0 3 9 9 29 7.8 99 7.1 89 4.3 49 2.5 74 3.8 49 3.6 23 1.5 2 3 21 2.3干旱5 dD r o u g h tf o r 5 d a y sD S-5 d-19 1 8 8 0 6 0 28 8 3 3 0 5 8 89 7.9 69 7.8 09 4.6 19 4.2 34 2.9 19 2.4 73 1.6 4 3 31 2.8D S-5 d-29 5 1 2 9 1 6 89 1 2 1 9 4 1 09 7.9 69 7.4 59 4.5 49 3.2 94 3.6 99 2.6 13 4.7 7 1 11 3.2D S-5 d-38 2 8 0 9 4 9 87 9 4 7 5 7 5 29 7.9 59 7.6 59 4.5 39 3.8 14 3.3 69 3.9 93 3.8 8 6 51 1.56561西 北 植 物 学 报 4 3卷2 结果与分析2.1 转录组数据分析2.1.1 转录组数据比对结果将不同胁迫下的处理组:水淹3 d(WS-3 d)、水淹1 5 d(WS-1 5 d)、干旱3 d(D S-3 d)、干旱5 d(D S-5 d)以及对照组(C K)各3个重复的总共1 5个转录组数据的原始数据(r a w r e a d s)进行质控,得到Q2 0和Q3 0的均值分别为9 7.5 9%和9 3.6 7%和平均G C含量为4 3.7 1%和测序深度均在3 0以上的c l e a n r e a d s。将其比对到组装好的大叶杨参考基因组上,平均比对率为9 3.8 2%(表2)。以上结果表明转录组测 序 数 据 质 量 较 高,可 用 于 后 续 分 析。利 用S t r i n g T i e统计每个样本中基因的T PM值,为了检验每组数据3个个体间的重复性,基于皮尔逊相关系数对不同处理组中3个生物重复的表达量数据绘制相关性热图(图1)。结果显示每个处理组内的3个个体间,其相关性都在0.9及以上,表明各处理组内的3个样本具有良好一致性,可以进行下一步分析。图1 大叶杨对照和胁迫样本相关性热图F i g.1 C o r r e l a t i o n h e a t m a p b e t w e e n c o n t r o l a n d s t r e s s s a m p l e s o f P o p u l u s l a s i o c a r p a2.1.2 差异表达基因鉴定利用D E S e q 2分别将处理组与对照组进行差异分析。干旱处理组:在D S-3 d与C K组鉴定到5 7 4 7个D E G s,其中包含3 3 9 9个上调和2 3 4 8个下调的D E G s;在D S-5 d与C K组鉴定到8 4 8 6个D E G s,其中上调和下调的D E G s分别有4 0 3 5,4 4 5 1个(图2,A,C)。水淹处理组:在WS-3 d与C K组共获 得2 1 1 4个D E G s,其中1 4 5 5个上调和6 5 9个下调;在WS-1 5 d与C K组共获得1 0 7 7个D E G s,上调和下调的D E G s分别有5 7 2,5 0 5个(图2,B,C)。随着水淹胁迫的天数 增加,D E G s的数量 由水淹3 d的2 1 1 4个逐渐减少到1 0 7 7个;而随干旱胁迫天数增加,D E G s数量明显增加。接下来筛选出在WS-3 d和WS-1 5 d共享的D E G s作为全程响应水淹胁迫的D E G s(命名WS-D E G s),同理也筛选出全程响应干旱胁迫的D E G s(命名为D S-D E G s),分别鉴定出3 8 5个W S-D E G s和3 9 8 6个D S-D E G s(图2,A,B)。对二者取交集,其中有2 3 7个W S-D E G s和D S-D E G s共享的D E G s(命 名为S h a r e d D E G s),还 有1 4 8个W S-D E G s和3 7 4 9个D S-D E G s作为独立响应水淹和干旱胁迫的D E G s(分别命名为W S-u n i q D E G s和D S-u n i q D E G s),见图2,D。大叶杨中响应干旱胁迫的差异基因数量明显多于水淹胁迫时差异基因数量。A.干旱处理组v s对照组的D E G s数量;B.水淹处理组v s对照组D E G s数量;C.水淹处理组和干旱处理组v s对照组D E G s上下调数量,深色和浅色分别代表上调和下调基因;D.S h a r e d D E G s、WS-u n i q D E G s和D S-u n i q D E G s数量。图2 水淹和干旱胁迫差异表达基因统计A.N u m b e r o f D E G S i n d r o u g h t v s c o n t r o l g r o u p;B.N u m b e r o f D E G S i n w a t e r l o g g i n g v s c o n t r o l g r o u p;C.N u m b e r o f D E G s u p r e g u l a t e d/d o w n r e g u l a t e d i n w a t e r l o g g i n g a n d d r o u g h t v s c o n t r o l g r o u p.D a r k a n d l i g h t c o l o r s r e p r e s e n t u p a n d d o w n r e g u l a t e d g e n e s,r e s p e c t i v e l y;D.N u m b e r o f S h a r e d,WS-u n i q a n d D S-u n i q D E G s.F i g.2 S t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f D E G s r e l a t e d t o w a t e r l o g g i n g a n d d r o u g h t s t r e s s e s2.1.3 差异表达基因G O富集为了探究大叶杨在水分胁迫下的生物学过程及其响应胁迫的大致机理,将上述鉴定到的S h a r e d 75611 0期 张佳琪,等:大叶杨干旱和水淹胁迫的转录组分析D E G s、WS-u n i q D E G s和D S-u n i q D E G s分别进行基于F i s h e r检验的GO富集。S h a r e d D E G s富集到的生物过程主要包括原花青素生物合成途径、调控叶片衰老、对水分刺激的响应、光周期以及开花调控、获得系统抗性、免疫防御等(图3,A);在WS-u n i q D E G s中,富集到色氨酸代谢、生长素介导的信号通路正调控、芳香族氨基酸代谢过程、吲哚类化合物的代谢过程等通路(图3,B);在D S-u n i q D E G S中,主要富集到光合通路、叶绿素代谢、获得系统抗性、应激防御反应等(图3,C)。依次以不同类型D E G s(S h a r e d、WS-u n i q、D S-u n i q)的数量作为随机取样值,对大叶杨基因组中全部基因进行2 0 0 0 0次随机抽样,统计每次抽样数据集中A P 2/E R F家族成员的数量,比较后发现A P 2/E R F家族成员显著富集 于 差 异 表 达 基 因 中。观 测 值 表 示 不 同 类 型D E G s中A P 2/E R F基因的数量(图3)。A.S h a r e D E G s;B.WS-u n i q D E G s;C.D S-u n i q D E G s.图3 共享和胁迫特异性差异基因G O富集和随机取样的A P 2/E R F基因频率分布F i g.3 GO e n r i c h m e n t o f s t r e s s s p e c i f i c/s h a r e D E G s a n d f r e q u e n c y d i s t r i b u t i o n h i s t o g r a m o f A P 2/E R F g e n e s s a m p l i n g r a n d o m l y2.2 大叶杨A P 2/E R F家族成员鉴定和系统发育关系 参考N a k a n o等1 8在拟南芥中对A P 2/E R F基因家族成员分类的方法,将大叶杨中的候选基因分为5类,包括A P 2、E R F、D R E B、R AV和S o l o i s t。在大叶杨中,有6 5个(3 1%)D R E B亚家族基因,1 0 3个(5 0%)E R F亚家族基因,3 0个(1 4%)A P 2亚家族基因,6个R AV亚家族基因和1个S o l o i s t亚家族基因,其中E R F亚家族中的基因数量最多,S o l o-i s t亚家族中只有1个P o l a s 1 0 3 8 4基因。利用N J法则对2 0 5个大叶杨A P 2/E R F家族成员和1 3 8个拟南芥A P 2/E R F家族成员进行蛋白序列的多重比8561西 北 植 物 学 报 4 3卷对,构建系统发育树(图4)。在前人