丛毛红曲霉工程菌TI-25高产莫纳可林K发酵工艺优化.pdf

食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究基金项目：福建省科技计划对外合作项目（2019I0008）；福建农林大学科技创新专项基金项目（CXZX2023）作者简介：张亚如（1995），女（汉），硕士，研究方向：食品生物技术。*通信作者：黄志伟（1978），男，副教授，博士，研究方向：食品生物技术。DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.20.016丛毛红曲霉工程菌 TI-25 高产莫纳可林 K发酵工艺优化张亚如1，2，肖丽酾1，2，陈丽晨1，2，叶燕芳1，2，郑政淮1，2，黄志伟1，2*（1.福建农林大学 食品科学学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学 福建省特种淀粉品质科学与加工技术重点实验室，福建 福州 350002）摘要：为优化丛毛红曲霉工程菌 TI-25 高产莫纳可林 K（monacolin K，MK）的发酵工艺，以菌株 TI-25 作为研究对象，以 MK 产量为评价指标，采用固态发酵方式，在单因素试验基础上，采用响应面优化设计，探究丛毛红曲霉工程菌TI-25 高产 MK 的最佳发酵工艺。结果表明：发酵瓶装米量、初始加水量和发酵变温时间均会显著影响发酵产物的MK 产量，而发酵时间、种子液培养基初始 pH 值和种子液接种量对发酵产物的 MK 产量的影响较小。因此，选取发酵瓶装米量、初始加水量、发酵变温时间 3 个因素进行响应面优化设计。优化结果表明，菌株 TI-25 固态发酵产 MK 的最佳发酵工艺为发酵瓶装米量 20 g/350 mL，初始加水量 32.38 mL，30 培养 3 d 后，变温为 28 继续培养 12 d，种子液接种量 10%，种子液培养基初始 pH4.5，在此条件下发酵培养，发酵产物红曲米中的 MK 产量高达 635.12 mg/kg。关键词：丛毛红曲霉；工程菌；固态发酵；莫纳可林 K；发酵工艺Optimization of Fermentation Process for High Monacolin K Production by Monascus pilosusEngineering Strain TI-25ZHANG Yaru1，2，XIAO Lishi1，2，CHEN Lichen1，2，YE Yanfang1，2，ZHENG Zhenghuai1，2，HUANG Zhiwei1，2*（1.College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，Fujian，China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Quality Science and Processing Technology in Special Starch，FujianAgriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，Fujian，China）Abstract：This study aimed to optimize the fermentation process for high monacolin K（MK）production byMonascus pilosus engineering strain TI-25.The strain TI-25 was taken as the research object，and the MK yieldwas taken as the evaluation index.The solid-state fermentation method was used to explore the optimal fermentation process for high MK production by Monascus pilosus engineering strain TI-25 on the basis of a single factor experiment and response surface optimization design.The results showed that the amount of fermented bottled rice，initial water addition，and temperature change time of fermentation would significantly affect the MKyield of fermentation products.The fermentation days，initial pH value of culture medium with seed solution，andinoculation amount of seed solution had little effect on the MK yield of fermentation products；therefore，the response surface optimization design was carried out by selecting three factors:the amount of fermented bottledrice，the initial water addition，and the fermentation days.The optimization results showed that the optimal fermentation conditions for MK production by solid-state fermentation of engineering strain TI-25 were as follows:The amount of fermented bottled rice was 20 g/350 mL；the initial water addition was 32.38 mL；the temperaturewas changed from 30 for curing of 3 d to 28 for curing of 12 d；the inoculation amount of seed solution was10%，and the initial pH value of culture medium with seed solution was 4.5.In these conditions，the content ofMK in Monascus rice could reach 635.12 mg/kg.Key words：Monascus pilosus；engineering strain；solid-state fermentation；monacolin K；fermentation process应用技术115食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究引文格式：张亚如，肖丽酾，陈丽晨，等.丛毛红曲霉工程菌 TI-25 高产莫纳可林 K 发酵工艺优化J.食品研究与开发，2023，44（20）：115-121.ZHANG Yaru，XIAO Lishi，CHEN Lichen，et al.Optimization of Fermentation Process for High Monacolin K Production byMonascus pilosus Engineering Strain TI-25J.Food Research and Development，2023，44（20）：115-121.红曲是亚洲的一种传统食物，又称为赤米、红米，具有药用和食用的双重用途1。红曲霉属（MonascusVan.Tiegh.）隶属于散囊菌目（Eurtotiales）、曲霉科（Aspergillaceae）2。红曲霉发酵籼米(又称为红曲米)被广泛食用3。红曲霉发酵后可产生各种有益的次生代谢产物，包括色素、-氨基丁酸、莫纳可林 K（monacolin K，MK）等4-5。莫纳可林 K 最早由日本学者远藤章教授于 1979年从红色红曲霉（Monascus ruber）的发酵产物中首次分离获得6。莫纳可林 K 是一种广泛应用的降血脂药物，其结构与胆固醇合成途径限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶相似，可高效地竞争性抑制该还原酶的活性，从而有效抑制血液中的胆固醇合成7-8。莫纳可林 K 在酸性条件下有酸式和内酯式两种结构，其中起降血脂作用的是酸式莫纳可林 K9。除降血脂外，莫纳可林 K 还具有抗癌防癌10-12、保护神经13-14、抗炎抑菌15等生理功能。红曲霉生产 MK 的常见发酵模式有固态发酵（solid state fermentation，SSF）和液态发酵（submerged fermentation，SmF）。在红曲霉产 MK 的发酵条件优化研究中，以 SSF 的研究居多16-17，其原因可能是与 SmF 法相比，SSF 法有许多优势，真菌在 SSF 中能产生更多的酶和次级代谢物，并且有些酶只在 SSF 中产生18。Zhang 等19-20向液态培养基中加入琼脂制成固态培养基，再将红曲霉分别接种于切割成小块的固态培养基与未加琼脂的液态培养基中进行发酵试验，结果发现与 SmF 相比，SSF 下红曲霉的生物量积累、MK 合成速率、甘油消耗率、细胞膜的流动性与渗透性以及甘油耐受浓度都明显高于 SmF 下的红曲霉。因此，在 SSF下红曲霉的 MK 产量通常会比 SmF 高21-22。本课题组在前期研究中获得了过表达 mok I 基因的丛毛红曲霉工程菌 TI-25，其 MK 产量比出发菌株CICC 5045 提高了 41.39%。本试验采用固态发酵的方式，研究发酵瓶装米量、初始加水量、种子液接种量、种子液培养基初始 pH 值、培养温度、发酵变温时间 6 个因素对该菌株 MK 产量的影响，并结合响应面法优化其产 MK 的最适发酵工艺，以期为该菌株的应用推广奠定基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌株与培养基供试菌株为丛毛红曲霉过表达 mok I 基因的工程菌 TI-25。麦芽汁琼脂培养基：称取 145.1 g 麦芽汁琼脂培养基，加入适量纯净水中，加热使其充分溶解后定容至 1 000 mL，然后分装于试管中，在 121 下高压灭菌20 min。种子液培养基配方：蛋白胨 10 g，葡萄糖 30 g，NaNO32 g、甘油 70 g，KH2PO41 g，MgSO4 7H2O 1 g，豆粕粉 15 g。种子液培养基配制完成后，分装于 250 mL三角瓶中（100 mL/瓶），在 121 下高压灭菌 20 min。固态发酵基础培养基配方：甘油 5 g，籼米 30 g，pH 自然，纯净水 14 mL，于 121 下高压灭菌 20 min。1.1.2材料与试剂籼米（金泰香米）：泉州万年香米业有限责任公司；麦芽汁琼脂培养基：山东海波海洋生物科技股份有限公司；葡萄糖蛋白胨、甘油、磷酸二氢钾、豆粕粉（发酵专用）、ZnSO4 7H2O、氢氧化钠、75%乙醇、NaNO3、MgSO4 7H2O(均为分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；乙腈、磷酸、甲醇（均为色谱纯）：格雷斯（中国）有限公司；MK 标准品（洛伐他汀98%）：中国食品药品检定研究院。1.2仪器与设备DHG-9005 电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；MDF-382E 超低温保存箱：日本三洋电机贸易会社；ZHWY-200D 恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；MJ-54A 高压蒸汽灭菌锅：施都凯仪器设备有限公司；KQ-500VDE 双频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。1.3方法1.3.1丛毛红曲霉菌株 TI-25 产 MK 发酵工艺的单因素试验1.3.1.1发酵瓶装米量对 MK 产量的影响在 350 mL 发酵瓶中分别装入 20、30、40、50、60 g籼米，固定培养基的初始加水量为 30 mL、种子液接种量为 10%、种子液培养基初始 pH4.5、30 培养 2 d应用技术116食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究后，变温为 28 继续培养 13 d。考察发酵瓶装米量对MK 产量的影响。1.3.1.2初始加水量对 MK 产量的影响固定发酵瓶装米量 30 g、种子液接种量 10.0%、种子液培养基初始 pH4.5、30 培养 2 d 后，变温为 28 继续培养 13 d。在大米固态培养基中，分别添加 10、15、20、25、30、35 mL 水，考察培养基的初始加水量对MK 产量的影响。1.3.1.3种子液接种量对 MK 产量的影响固定发酵瓶装米量 30 g、培养基的初始加水量30 mL、种子液培养基初始 pH4.5、30 培养 2 d 后，变温为 28 继续培养 13 d。在大米固态培养基中分别接种 7.0%、10.0%、13.0%、16.0%、19.0%的种子液，考察种子液接种量对 MK 产量的影响。1.3.1.4种子液培养基初始 pH 值对 MK 产量的影响固定发酵瓶装米量 30 g、培养基的初始加水量30 mL、种子液接种量 10.0%、30 培养 2 d 后，变温为28 继续培养 13 d。利用氨水和醋酸调节种子液培养基的初始 pH 值，分别调至 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，种子液培养后接种到籼米固态培养基中，考察种子液培养基初始 pH 值对 MK 产量的影响。1.3.1.5发酵变温时间对 MK 产量的影响固定发酵瓶装米量 30 g、培养基的初始加水量30 mL、种子液接种量 10.0%、种子液培养基初始 pH4.5。分别将已接种丛毛红曲霉的发酵瓶置于 30 下发酵培养 1、2、3、4、5、6 d 后，变温为 28 继续发酵培养至15 d，考察发酵变温时间对 MK 产量的影响。1.3.1.6发酵时间对 MK 产量的影响固定发酵瓶装米量 30 g、培养基的初始加水量30 mL、种子液接种量 10.0%、种子液培养基初始pH4.5，30 发酵培养 2 d，然后 28 发酵培养至 18 d。将接种丛毛红曲霉后的籼米固态培养基分别培养 7、9、13、15、18、21、24 d，考察发酵时间对 MK 产量的影响。1.3.1.7固态发酵条件最优组合的响应面优化设计选取单因素试验的最佳条件中心位置，并分别选取在中心位置的左右水平值。选取对丛毛红曲霉 MK产量影响较显著的因素：发酵瓶装米量、初始加水量、变温时间，进行三因素三水平的响应面试验设计，因素水平见表 1。1.3.2高效液相色谱检测和 MK 产量计算酸式 MK 标准溶液：准确称取 1.5 mg MK 标准品，置于 10 mL 棕色容量瓶中，加入 2 mL 0.2 mol/L NaOH溶液处理，再用 75%乙醇定容至 10 mL，50 水浴35 min，超声转化 35 min，配制成浓度为 150 g/mL 的标准溶液。内酯式 MK 标准溶液：准确称取 1.5 mg MK 标准品，置于 10 mL 棕色容量瓶中，以 75%乙醇溶解，并定容至 10 mL，配制成 150 g/mL 的标准溶液。待测样品的前处理：称取 1.0 g 丛毛红曲霉发酵产物的待测样品，加入 10 mL 离心管中，加入 75%乙醇溶液定容至 10 mL，于 30 下超声处理 40 min，超声过程的前期、中期、后期均要进行摇匀，超声结束后静置 15 min，然后取上清液 5 mL，过 0.45 m 滤膜后待进样检测。色谱条件：色谱柱为 Waters SunFire C18（5 m，4.6 mm150 mm）；流动相为乙腈0.1%磷酸水溶液=5545（体积比）；流速为 1 mL/min；紫外检测器的波长为 238 nm；柱温为 30；进样量为 20 L。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测后，待测样品中 MK 产量的计算公式如下。Y=CMK10mW式中：Y 为 MK 产量，mg/kg；W 为稀释倍数；CMK为MK 标准品浓度和待测样品目标物质峰面积（A）的比值，g/mL；m 为待测样品的质量，g。1.4数据处理与统计采用 SPSS 数据处理系统（IBM SPSS Statistics 24.0）和 Design-Expert 12.0，对试验数据进行统计分析。2结果与分析2.1MK 标准品和待测样品的 HPLC 图MK 标准品的高效液相色谱图见图 1。丛毛红曲霉菌株 TI-25 待测样品的 HPLC 色谱图见图 2。由图 1 可以看出，在 150 g/mL 浓度下，酸式 MK标准品的出峰时间为 9.328 min，内酯式 MK 标准品的出峰时间为 17.751 min，均不存在杂峰，有良好的分离效果。表 1响应面试验的因素和水平Table 1Factors and levels of response surface experiment水平因素A 发酵瓶装米量/gB 初始加水量/mLC 发酵变温时间/d-120252030303140354保留时间/min吸光度0.500.400.300.200.1002.00014.0012.0010.00酸式MK6.004.0018.0016.008.00应用技术117食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究图 2丛毛红曲霉菌株 TI-25 待测样品的 HPLC 色谱图Fig.2HPLC chromatography of Monascus pilosus strain TI-25samples to be measured图 1MK 标准品的高效液相色谱图Fig.1HPLC chromatography of standard form of MK由图 2 可以看出，待测样品中酸式 MK 的出峰时间为 9.032 min，内酯式 MK 的出峰时间为 17.751 min，不存在杂峰，有良好的分离效果。2.2单因素试验结果2.2.1发酵瓶装米量对 MK 产量的影响红曲霉固态发酵中，氧气对产 MK 产量至关重要，发酵过程中，瓶装米量对生产 MK 的影响较大，而对氧浓度的控制主要取决于发酵瓶装米量的多少。发酵瓶装米量对 MK 产量的影响结果如图 3 所示。从图 3 可知，当发酵瓶的装米量为 2030 g 时，丛毛红曲霉的 MK 产量随发酵瓶装米量增加逐渐提高，且在 30 g 时 MK 产量最高，可达到 303.04 mg/kg，其原因可能是发酵瓶的装米量过少时，培养基里的水分易挥发，培养基变干，无法提供红曲霉正常生长所必需的营养23。装米量为 3050 g 时，丛毛红曲霉的MK 产量随着发酵瓶装米量的增加而逐渐降低。分析其原因，可能是发酵瓶中的氧气有限，若装米量过多会加快氧气的消耗，使发酵瓶内产生大量乙醇，不利于红曲霉的生长，从而影响 MK 的产量。因此发酵瓶装米量以 30 g 最优。2.2.2初始加水量对 MK 产量的影响固态发酵基质的不同对其含水量的要求也不同，但一般为 40%60%24，含水量过高或过低都不利于红曲霉的生长。培养基的初始含水量对 MK 产量的影响结果如图 4 所示。从图 4 可知，培养基初始加水量的多少对 MK 产量有一定的影响。在1030mL时，随着初始加水量的增加，丛毛红曲霉菌株 TI-25 的 MK 产量持续增加；在初始加水量达到 30 mL 时，MK 的产量最高，为 601.21 mg/kg。分析其原因，加水量少于 30 mL 时，米粒发酵不充分，断层稍有白色，米质较硬，水不能将大米完全浸泡，不利于菌体的生长繁殖，导致其 MK 产量较低。当初始加水量为 35 mL 时，MK 产量大幅下降，且发酵籼米出现严重结团现象，不利于菌体的生长。因此，加 30 mL 水最有利于丛毛红曲霉菌株 TI-25 的生长和 MK 合成。2.2.3种子液接种量对 MK 产量的影响种子液接种量的不同会影响菌体的生长状况，进而对其 MK 产量存在一定的影响。种子液接种量对MK 产量的影响结果见图 5。保留时间/min吸光度0.500.400.300.200.1002.00014.0012.0010.00内酯式MK6.004.0018.0016.008.00保留时间/min吸光度0.300.250.200.150.100.0502.00014.0012.0010.006.004.0018.0016.008.00不同小写字母表示差异显著（p0.05）。图 3发酵瓶装米量对 MK 产量的影响Fig.3Effect of amount of fermented bottled rice on MK yield不同小写字母表示差异显著（p0.05）。图 4培养基的初始加水量对 MK 产量的影响Fig.4Effect of initial water addition in culture medium on MKyield.,FUNHLHUF*=1FHDBCCCF.,F.,.,FUNHLHU!FN-EDECDCBDEF.,F.,不同小写字母表示差异显著（p0.05）。图 5种子液接种量对 MK 产量的影响Fig.5Effect of inoculation amount of seed solution on MK yieldCBBCBC.,FUNHLHU.FF.,F.,应用技术118食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究如图 5 所示，种子液接种量对其 MK 产量有一定的影响。当种子液接种量为 10.0%时，发酵产物的 MK产量最高，达到 442.12 mg/kg。分析原因可能是当种子液接种量过少时，菌体生长速度较慢，培养基营养过剩，发酵需要的时间增加，MK 产量较低；当种子液接种量不断增加时，菌体生长繁殖加快，从而消耗的营养及溶氧量不断增加，导致 MK 产量受限。因此，丛毛红曲霉产 MK 的最佳种子液接种量为 10.0%。2.2.4种子液培养基初始 pH 值对 MK 产量的影响种子液培养基初始 pH 值对 MK 产量的影响试验结果见图 6。图 6 显示，种子液培养基的不同初始 pH 值对其MK 产量的影响不大。当种子液培养基初始 pH 值小于4.5 时，MK 产量与种子液培养基初始 pH 值呈正比，当种子液培养基初始 pH 值高于 4.5 时，随着种子液培养基初始 pH 值的升高，MK 产量整体呈下降趋势。当种子液培养基初始 pH 值为 4.5 时，MK 产量达到最高，即 298.86 mg/kg，说明此时的种子液培养基初始 pH 值最适宜丛毛红曲霉产 MK。2.2.5发酵变温时间对 MK 产量的影响红曲霉发酵过程中，变温培养的 MK 产量普遍优于恒温培养，但不同的菌株对变温的需求不同21-25。发酵变温时间对 MK 产量的影响试验结果见图 7。如图 7 所示，发酵变温时间对红曲霉产 MK 也有着很大的影响。当 30 培养 3 d 后变为 28 继续培养12 d 时，丛毛红曲霉的 MK 产量最高，达到 826.75mg/kg；当 30 培养的时间过长时，MK 产量会显著降低，这可能是因为丛毛红曲霉的发酵周期一般为 15 d，菌丝体长期在高温下，生长旺盛，营养物质提前耗尽，不利于后期发酵产物的次生代谢物积累，从而降低了 MK的产量。因此，30 培养 3 d 后变为 28 继续培养 12 d，为丛毛红曲霉菌株 TI-25 固态发酵产 MK 的最适变温条件。2.2.6发酵时间对 MK 产量的影响不同红曲霉菌株的发酵周期可能不同，要根据具体的菌株确定其适宜的发酵时间26。发酵时间对 MK产量的影响结果见图 8。如图 8 所示，发酵时间对丛毛红曲霉 MK 产量的影响较大。在发酵前期(16 d)，MK 的产量很低甚至检测不到，说明丛毛红曲霉产 MK 的发酵周期可能较长，发酵前期正处于其生长阶段尚未合成 MK；当发酵至15 d 时，MK 的产量达到最高值（261.47 mg/kg）；继续发酵，MK 的产量整体呈降低趋势，其可能原因是营养物质在发酵后期消耗殆尽，不能再支持菌体的生长，从而导致 MK 的产量降低。因此，红曲霉产 MK 的发酵过程中，其 MK 产量在发酵至第 15 天时达到最大值。2.3固态发酵条件最优组合的响应面优化结果分析2.3.1响应面优化试验与结果根据单因素试验结果，利用 Design-Expert 12.0 进行中心组合试验设计，所得结果如表 2 所示。2.3.2响应面模型的建立与分析利用 Design-Expert 12.0 软件对表 2 中的试验结果进行回归分析，得到二次回归模型的方差分析结果，见表 3。对表 3 中的数据进行二次多项回归拟合，得到MK产量（Y）对发酵瓶装米量（A）、初始加水量（B）、发酵变温时间（C）的二次多项式回归方程：Y=336.4-.,FUNHLHU.Q)CBBCBCCCF.,F.,不同小写字母表示差异显著（p0.05）。图 6种子液培养基初始 pH 值对 MK 产量的影响Fig.6Effect of initial pH of culture medium with seed solutionon MK yield不同小写字母表示差异显著（p0.05）。图 7发酵变温时间对 MK 产量的影响Fig.7EffectoftemperaturechangetimeoffermentationonMKyield.,FUNHLHUF#KECCBDDDF.,F.,.,FUNHLHUFKECDDCDBBCBCBCF.,F.,不同小写字母表示差异显著（pCB，即发酵瓶装米量发酵变温时间初始加水量。各交互作用对 MK 产量影响的响应面图见图 9。根据三维响应面可以看出各变量之间的交互作用对响应值的影响，等高线是响应面在水平方向的投影，等高线呈椭圆形表示两因素交互作用显著，呈圆形表示两因素交互作用不显著。由图 9 可以看出，各因素交互作用大小依次为 BCACAB，但各曲面坡度均较平缓，等高线接近圆形，对响应面值的影响均不显著，与表 3 的回归分析结果相符。由该模型得到的最佳发酵条件：发酵瓶装米量20 g，初始加水量 32.38 mL，30 培养 3 d 后，变温为28 继续培养 12 d，种子液接种量 10.0%，种子液培养基初始 pH 值为 4.5，按此条件发酵培养，MK 产量为635.12 mg/kg，与预测的 643.61 mg/kg 接近，说明该回归方程预测的 MK 产量与实际的 MK 产量是一致的。表 2响应面试验设计与结果Table 2Response surface experimental design and resultsB 初始加水量/mLC 发酵变温时间/dMK 产量/（mg/kg）7002003004005006001003.54.03.02.52.0333531292725A 发酵瓶装米量/gB 初始加水量/mLMK 产量/（mg/kg）70020030040050060003335312725354030252010029A 发酵瓶装米量/g3540302520C 发酵变温时间/dMK 产量/（mg/kg）7002003004005006001003.54.03.02.52.0应用技术120食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究3结论本试验以 MK 为目标产物，通过单因素试验和Box-Behnken 响应面优化试验，得出丛毛红曲霉工程菌TI-25 高产 MK 的最佳发酵工艺：发酵瓶装米量 20 g，初始加水量 32.38 mL，30 培养 3 d 后变为 28 继续培养 12 d，种子液种子液接种量 10%，种子液培养基初始 pH 值为 4.5，按此条件发酵培养，MK 产量高达635.12 mg/kg。这与预测值 643.61 mg/kg 接近，说明通过响应面优化得到的丛毛红曲霉工程菌 TI-25 高产MK 的固态发酵工艺参数准确可靠。参考文献：1LV X C,WENG X,ZHANG W,et al.Microbial diversity of traditional fermentation starters for Hong Qu glutinous rice wine as determined by PCR-mediated DGGEJ.Food 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