大黄芩鱼散半仿生提取物对鹅沙门氏菌生长的影响.pdf

中国饲料2023 年第 17 期基金项目院2021年大学生创新创业训练项目渊X202110160081冤曰辽宁省民生科技计划项目渊2021JH2/10200009冤作者简介院郑心钰渊2001-冤袁女袁动植物检疫专业袁E-mail院*通讯作者院王宏军渊1977-冤袁男袁博士袁教授袁主要从事中兽 药 新 制 剂 研 发 及 其 抗 菌 机 制 研 究 袁E-mail院大黄芩鱼散半仿生提取物对鹅沙门氏菌生长的影响郑心钰1袁 孙健2袁 王宏军1*袁 古玛纳1袁 杨一妍1袁 博意1渊1.锦州医科大学畜牧兽医学院袁辽宁锦州 121001曰2.北京农业职业学院袁北京房山 102442冤DOI院10.15906/11-2975/s.2022100011-08摘要 本研究旨在探讨大黄芩鱼散半仿生提取物渊SEDQS冤对鹅沙门氏菌的体外抗菌活性遥 采用微孔-平板法测定最小抑菌浓度渊MIC冤袁分光光度法和试剂盒法测定不同浓度 SEDQS 对鹅沙门菌生长曲线尧呼吸代谢系统尧可溶性蛋白的影响遥 结果显示院SEDQS 对鹅沙门菌的 MIC 为渊9.10 依 0.11冤mg/mL袁1/4 MIC 2 MIC 的 SEDQS 均能显著抑制鹅沙门氏菌的正常生长袁且最高抑制率为 68.4%曰能显著升高碱性磷酸酶渊AKP冤的含量渊P 0.01冤袁升高率达到88.2%曰使细菌的核酸尧蛋白质等大分子物质显著泄漏渊P 0.01冤袁且最高泄漏率为 92%曰还能显著地抑制琥珀酸脱氢酶渊SDH冤和苹果酸脱氢酶渊MDH冤的活性渊P 0.01冤袁并呈现剂量依赖性遥 由此表明袁SEDQS 通过破坏鹅沙门氏菌的细胞壁和细胞膜结构袁影响其呼吸代谢而发挥体外抗菌活性遥关键词 大黄芩鱼散曰半仿生提取物曰抗菌活性曰鹅沙门氏菌中图分类号 S816.7文献标识码 A文章编号 1004-3314渊2023冤17-0062-04大黄芩鱼散渊DQS冤为叶中华人民共和国兽药典曳渊2020 年版冤收录的鱼用抗菌类中兽药制剂袁有清热解毒的功效袁 主治鱼虾类的细菌性烂鳃病遥 王宏江等渊2009冤提出袁大黄芩鱼散通过拌饵给药袁可能混合不均袁出现个体差异袁不能很好地发挥疗效遥 于是本课题组李虹颖等渊2020冤开展了大黄芩鱼复方中药泡腾片制备工艺尧 质量评价的研究袁古玛纳渊2022冤开展了大黄芩鱼散半仿生提取物渊SEDQS冤制备工艺尧化学成分及其体外抗鹅沙门氏菌的研究遥 在此基础上袁本研究探讨了 SEDQS 体外对鹅沙门氏菌生长性能的影响遥1材料与方法1.1材料大黄芩鱼散半仿生提取物渊锦州医科大学动物药学实验室制备冤曰营养肉汤尧营养琼脂渊北京奥星生物技术有限责任公司冤曰 碱性磷酸酶渊AKP冤检测试剂盒尧苹果酸脱氢酶渊MDH冤检测试剂盒尧琥珀酸脱氢酶渊SDH冤检测试剂盒渊南京建成生物技术研究所冤曰Bradford 蛋白浓度测定试剂盒渊碧云天生物科技有限公司冤曰鹅沙门氏菌渊锦州医科大学周铁忠教授鉴定馈赠冤遥1.2仪器DHG-9245A 型电热恒温鼓风干燥箱渊上海一恒有限公司冤曰HZQ-C 恒温摇床培养箱渊上海一恒科技有限公司冤曰Tecan 酶标仪 渊瑞士Tecan 公司冤曰SW-CJ-2FD 超净工作台渊苏州净化有限公司冤曰UV-1800 紫外可见分光光度计渊上海美谱达仪器有限公司冤遥1.3试验方法1.3.1MIC 的测定精确称取 SEDQS 加水溶解配制成浓度为 100 mg/mL袁 采用徐淑云等渊1994冤提出的活菌计数法调整细菌浓度为106cfu/mL袁采62中国饲料2023 年第 17 期图 1SEDQS 对鹅沙门氏菌生长曲线的影响图 2SEDQS 对鹅沙门氏菌培养液中核酸物质光密度的影响用 Jiang 等 渊2013冤 报道的微孔-平板法测定SEDQS 对鹅沙门氏菌的最小抑菌浓度 渊MIC冤袁重复 3 次遥1.3.2SEDQS 对鹅沙门氏菌生长曲线的影响按照朱艳蕾 渊2016冤 报道的细菌生长曲线测定方法袁测定不同时间点 SEDQS 对鹅沙门氏菌在营养肉汤中生长的影响遥 以培养时间为横坐标袁600 nm波长下的 OD 值为纵坐标袁 绘制不同浓度SEDQS渊2MIC尧MIC尧1/2MIC尧1/4MIC冤 对鹅沙门氏菌生长曲线的影响袁重复 3 次遥1.3.3SEDQS 对鹅沙门氏菌培养液中核酸物质的影响按照黄燕飞渊2016冤报道的方法袁在波长260 nm 下袁用 UV-1800 型紫外-可见分光光度计测定不同浓度 SEDQS 与鹅沙门氏菌共培养后上清液中 DNA尧RNA 的 OD 值袁重复 3 次遥1.3.4SEDQS 对鹅沙门氏菌细胞壁的影响将104CFU/mL 鹅 沙 门 氏 菌 加 入 到 含 不 同 浓 度SEDQS 的营养肉汤中共培养袁按照黄燕飞渊2016冤报道的方法测定样品中碱性磷酸酶 渊AKP冤 的含量袁重复 3 次遥1.3.5SEDQS 对鹅沙门氏菌呼吸代谢系统的影响取鹅沙门氏菌与不同浓度 SEDQS 的共培养物袁按照蛋白浓度测定试剂盒尧SDH 试剂盒尧MDH试剂盒说明书及孙嘉一渊2019冤报道的方法袁测定蛋白标准曲线及样品中 SDH 浓度和 MDH 浓度遥1.3.6数据处理和统计分析试验数据以 野平均数依标准误差冶 表示遥 P 0.01 表示数据差异极显著曰P 0.05 表示数据差异不显著遥2结果2.1SEDQS 体外对鹅沙门氏菌的 MICSEDQS体外对鹅沙门氏菌的 MIC 为渊9.10 依 0.11冤mg/mL遥2.2SEDQS 体外对鹅沙门氏菌生长曲线的影响如图 1 所示袁对照组细菌在 6 h 前快速繁殖袁10 h后进入生长稳定期遥 与对照组相比袁当 SEDQS 浓度为 2MIC尧MIC 时袁 对鹅沙门氏菌增殖有显著的抑制作用 渊P 0.05冤袁 抑制率分别为 50.8%68.4%尧33.9%50.6%曰当 SEDQS 浓度为 1/2MIC时袁早期对鹅沙门氏菌增殖有显著的抑制作用渊P 0.05冤袁抑制率为 30.8%遥 在 1/2MIC 2MIC袁鹅沙门氏菌的生长没有表现出明显的对数阶段遥 这表明 SEDQS 对鹅沙门氏菌有明显的抑制作用遥2.3SEDQS 对鹅沙门氏菌核酸物质的影响如图 2 所示袁不同浓度的 SEDQS 与鹅沙门氏菌共培养的菌液 OD260nm值极显著高于对照组 渊P 0.01冤袁当 SEDQS 浓度为 2MIC 时袁鹅沙门氏菌培养液中DNA尧RNA 核酸大分子物质泄漏率为 74.3%92%袁 当 SEDQS 浓度分别为 MIC尧1/2MIC 和 1/4MIC 时核酸大分子物质泄漏率分别达到 67.2%89%尧56.5%86.3%和 66%83.3%曰 不同浓度的 SEDQS 对鹅沙门氏菌培养液中 DNA尧RNA 等核酸大分子有显著性影响渊P 0.05冤袁且呈现剂量依赖性遥2.4SEDQS 对 AKP 活性的影响不同浓度SEDQS 能够极显著提高鹅沙门氏菌胞外 AKP 含量渊P 0.01冤袁与对照组相比袁当 SEDQS 浓度为2MIC 时袁 鹅沙门氏菌培养液中 AKP 含量升高了44.4%88.2%袁当 SEDQS 浓度分别为 MIC尧1/2 MIC和 1/4MIC 时 AKP 含量升高了 37.5%84%尧16.6%75%和 10.5%63.6%袁 且与 SEDQS 浓度成正比遥图 3 所示袁不同浓度 SEDQS 组 AKP 含量在 10 h 达到峰值袁 由此表明 SEDQS 对细菌细胞壁有一定的破坏作用遥时间/h时间/h63中国饲料2023 年第 17 期组别对照组0.027依0.0080.803依0.091驻OD570nm蛋白质含量/渊mg/mL冤32.978依0.788SDH活性/渊U/mg prot冤1/4MIC0.023依0.0110.717依0.10624.296依0.556*1/2MIC0.012依0.0030.65依0.07919.262依0951*MIC0.008依0.0020.592依0.05710.818依0.689*2 MIC0.003依0.0010.519依0.0297.647依1.127*注院与对照组比较袁*表示有显著差异袁P 0.01曰下同遥表 1SEDQS 对细菌 SDH 的影响表 2SEDQS 对细菌 MDH 的影响组别对照组0.057依0.0190.803依0.091驻OD340nm蛋白质含量/渊mg/mL冤43.013依0.650MDH活性/渊U/mg prot冤1/4MIC0.041依0.0140.717依0.10635.856依0.586*1/2MIC0.03依0.0070.65依0.07930.172依0.281*MIC0.024依0.0040.592依0.05720.649依0.582*2 MIC0.008依0.0010.519依0.02911.039依0.772*图 3SEDQS 对 AKP 含量的影响时间/h2.5SEDQS 对鹅沙门氏菌呼吸代谢系统的影响标准蛋白质浓度的回归方程为 Y=0.7632X+0.5095袁R2=0.9746渊n=6冤曰表 1 显示袁1/4MIC尧1/2MIC尧MIC 和2MIC 组的 SDH 活性分别比对照组降低了 26.32%尧41.59%尧67.19%和 76.81%渊P 0.01冤曰SEDQS 对MDH 活性 的 影响见 表 2袁1/4MIC尧1/2MIC尧MIC尧2MIC 组的 MDH 活性分别比对照组降低 16.63%尧29.85%尧51.99%尧74.33%渊P 0.01冤遥 由表 1 和表 2可知袁2.27 18.2 mg/mL 的 SEDQS 能够显著抑制鹅沙门氏菌的 SDH尧MDH 活性渊P 0.01冤遥3讨论3.1SEDQS 对鹅沙门氏菌生长曲线的影响李凡等渊2008冤提出袁细菌生长曲线在科学研究和生产实践中具有指导意义袁朱艳蕾渊2016冤用 OD600 nm值显示细菌生长情况遥 于是本项研究也采用该方法测定了不同浓度的 SEDQS 对鹅沙门氏菌生长的影响袁结果表明 SEDQS 能够显著抑制鹅沙门氏菌的繁殖和生长并呈剂量依赖性遥 另外袁Zhang 等渊2017冤报道袁细菌生长分为 4 个阶段袁即滞后期尧对数生长期尧稳定生长期尧衰变生长期袁反映在细菌的生长曲线上遥 Wang 等渊2019冤指出袁对数生长期阶段活菌数量呈对数增长袁细菌形态尧染色和生理活性典型袁对外界环境敏感袁该阶段是研究细菌生物学特性和药物敏感性试验的理想阶段遥 于是后续试验均选择对数生长期的细菌遥如图 1 所示袁SEDQS 对对数生长期的鹅沙门氏菌生长有显著的抑制作用袁 进而影响了鹅沙门氏菌进入稳定生长期的数量遥3.2SEDQS 对鹅沙门氏菌培养液中大分子物质的 影 响Wang 等渊2019冤尧Minasyan 渊2019冤尧Zhang 等渊2017冤等均提出袁细胞壁是细菌的重要组成部分之一袁 当细菌细胞壁的完整性被破坏时袁渗透屏障的功能丧失袁导致细胞内蛋白质尧DNA尧RNA 等大分子物质的泄漏袁也会导致细菌膨胀和变形袁最终裂解死亡遥 如图 2 所示袁不同浓度 SEDQS 能够显著引起鹅沙门氏菌菌体内的核酸物质泄漏渊P 0.01冤袁表明细胞膜受损或细胞膜的通透性发生变化袁 引起细胞内的 DNA尧RNA 等大分子物质可以通过细胞膜泄漏到培养液中袁从而导致培养液 OD260 nm呈上升趋势遥由于细菌中的 AKP 主要存在于细菌的细胞壁和细胞膜之间袁 通过测定 AKP 含量可反映细菌细胞壁的状态遥如图 3 所示袁不同浓度 SEDQS 能够显著提高鹅沙门氏菌培养液中 AKP 的含量 渊P 0.01冤袁由此进一步表明 SEDQS 能够通过破坏鹅沙门氏菌的细胞壁导致胞内大分子物质泄漏而发挥抑菌和杀菌作用遥3.3SEDQS 对鹅沙门氏菌呼吸代谢的影响呼吸代谢是生物体正常生命活动的重要表现袁 主要表现为碳水化合物和脂类的氧化遥 徐明生等渊2005冤袁 提出一些药物和抑菌剂可以通过抑制细菌的呼吸代谢来影响细菌的正常生长和繁殖遥 云宝仪等渊2012冤尧周磊等渊2011冤尧Boyd 等渊1994冤均提出袁SDH 和 MDH 的变化可以反映细胞内能量代谢的水平遥 由表 1 和表 2 可知袁SEDQS 能够显著抑制鹅沙门氏菌 SDH 和 MDH 活性 渊P 0.01冤袁 提示 SEDQS 可以通过破坏呼吸系统来抑制鹅沙门氏菌的繁殖和生长遥64中国饲料2023 年第 17 期Effects of semi-bionic extract of Dahuang Qinyu Sanon the growth ofgooseZHENG Xinyu1袁SUN Jian2袁WANG Hongjun1*袁Hatungimana Fran袁coise1袁YANG Yiyan1袁Abdoulaye Beyer Sirinou1渊1.College of Animal Husband&Veterinary Medicine袁Jinzhou Medical University袁Jinzhou袁Liaoning Province 121001袁China曰2.Beijing Vocational College of Agriculture袁Fangshan district袁Beijing 102442袁China冤Abstract The aim of this study was to investigate the antibacterial activity of the semi-bionic extract ofDahuang Qinyu San渊SEDQS冤 against Salmonella goose 渊S.goose冤 in vitro.The minimum inhibitoryconcentration渊MIC冤 of SEDQS against S.goose was determined by the micropore-plate method.The effectsof SEDQS on the growth curve袁respiratory metabolic system and soluble protein of S.goose were studied bythe spectrophotometer and the kit method.The results showed that MIC of SEDQS against S.goose was 渊9.10依0.11冤mg/mL and 1/4MIC 2MIC of SEDQS could significantly inhibit the growth of S.goose and thehighest inhibition rate was 68.4%.The 1/4MIC 2MIC of SEDQS could significantly increased the content ofAKP with an increase rate of 88.2%.The 1/4MIC 2MIC of SEDQS could significantly release nucleic acidsand proteins from S.goose 渊P 0.01冤袁and the highest leakage rate was 92%.The 1/4MIC 2MIC of SEDQScould significantly inhibited the activities of succinate dehydrogenase acid渊SDH冤 and malate dehydrogenaseacid渊MDH冤 in a dose-dependent manner 渊P 0.01冤.The conclusion indicated that SEDQS exerted itsantibacterial activity in vitro by destroying the cell wall and membrane structure of S.gosse and affecting itsrespiratory metabolism in vitro.Key words Dahuang Qinyu San曰semi-bionic extract曰antibacterial activity曰Salmonella goose4结论SEDQS 体外能通过破坏鹅沙门氏菌细胞壁和细胞膜导致菌体内核酸尧 蛋白质等生命大分子泄漏袁通过显著下调 SDH 和 MDH 活性抑制鹅沙门氏菌的生长繁殖遥参考文献1 古玛纳袁姚丹袁王宏军袁等.大黄芩鱼散半仿生提取及其活性成分的检测J.中国饲料袁2022袁7院68 71.2 黄燕飞.黄连水提物对痢疾杆菌的抑菌机制研究院硕士学位论文D.合肥院安徽农业大学袁2016.3 李帆袁刘敬兴袁徐志凯.医学微生物学M.北京院人民卫生出版社袁2008.4 李虹颖袁王利袁刘海月袁等.大黄芩鱼复方中草药泡腾片制备工艺的优化J.中国饲料袁2020袁3院37 40.5 孙嘉一.四黄止痢复方中药提取物的制备及其抗 APEC 作用机制研究院硕士学位论文D.锦州院锦州医科大学袁2019.6 王宏江袁谷新利.中兽药制剂的研究进展J.兽医导刊袁2009袁2院37 38.7 徐明生袁陈锦屏袁上官新晨.鱼精蛋白对黑曲霉细胞内的琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的影响J.食品科学袁2005袁4院48 51.8 徐淑云袁卞如濂袁陈修.药理实验方法学M.北京院人民卫生出版社袁1994院1208 1245.9 云宝仪袁周磊袁谢坤鹏袁等.黄芩素抗菌活性及机制的初步研究J.中国药学杂志袁2012袁47渊12冤院1587 1592.10 周磊袁云宝仪袁汪业菊袁等.大黄素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制J.中国生物化学与分子生物学报袁2011袁27渊12冤院1156 1160.11 朱艳蕾.细菌生长曲线测定实验方法的研究J.微生物学杂志袁2016袁36渊5冤院108 112.12 Boyd F袁Nelson K袁Wang S袁et al.Molecular genetic basis of al鄄lelic polymorphism in malate dehydrogenase渊mdh冤in natural popula鄄tions of Escherichia coli and Salmonella entericJ.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America袁1994袁91渊4冤院1280 1284.13 Jiang H袁Zhou T袁Li X袁et al.Antimicrobial activity of com鄄pound traditional Chinese medicine Feizhu powder J.AdvancedMaterials 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