大白猪FST基因多态性与生长和繁殖性状的关联分析.pdf

-185-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 大白猪FST基因多态性与生长和繁殖性状的关联分析张庆泽1，李清春1，和军飞1，卢世豪1，陈 鑫1，何 凡1，祁梦凡1，黎明国1，符彬彬1，任玉军1，张化鹏1，黄 涛1,2*（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000；2.新疆生猪种业工程技术研究中心，新疆昌吉 831100）摘 要：本实验旨在研究卵泡抑素（FST）基因多态性与猪生长、繁殖性状的关系，为母猪生长、繁殖性能提供新的遗传标记。选用大白猪为实验对象，采用 DNA 混池测序对猪FST基因多态位点进行筛选，利用GenoPlexs 基于多重 PCR 的靶向测序基因型分型技术对候选单核苷酸多态性（SNP）进行分型，并与大白母猪出生重、达 100 kg 时的生长性能（日增重、背膘厚、体重日龄、眼肌面积和眼肌厚）、母系指数、父系指数、繁殖指数、出生乳头数、终身繁殖性能（总产仔数、产活仔数、死胎数、产仔窝重、仔猪 21 日龄窝重和妊娠期）进行关联分析。结果显示，在FST基因中筛到 3 个单碱基突变，分别为 g.32808636GA、g.32809116AG、g.32809757TA。其中 g.32809116AG 为同义突变，突变后未改变FST基因 mRNA 二级结构。FST基因的g.32808636GA、g.32809116AG、g.32809757TA 3 个位点完全连锁遗传（D=1，R2=1），且表型值完全相同，对父系指数、出生乳头数、终身产仔窝重、死胎数、100 kg 眼肌面积和眼肌厚有显著影响，对终身妊娠期、100 kg 背膘厚有极显著影响。以上结果初步表明，FST基因遗传变异对大白母猪生长、繁殖性状存在不同程度的影响，本研究中的 3 个 SNPs 位点可以作为大白母猪生长和繁殖性状的潜在分子标记，且在选育过程中仅需使用单一位点进行分子标记，应用于母猪的选育中。关键词：大白母猪；FST基因；多态性；生长性状；繁殖性状中图分类号：S828.2 文献标识码：A DOI 编号：10.19556/j.0258-7033.20230515-03据中国统计年鉴显示，2021 年全国肉类总产量8 990 万 t，其中猪肉产量 6 507.5 万 t，占肉类总产量的 72.39%；但 2021 年生猪价格同比降低 35.1%1。因此，通过降低成本提高饲养者收益变得尤为重要。提高母猪生长性能和繁殖性能则是遗传领域降低成本的重要方法。然而，生长性状和繁殖性状的遗传结构较为复杂，由于其低遗传力特性2-3，常规的表型选育进展缓慢。因此，挖掘与母猪生长、繁殖性能相关的 SNPs 作为辅助选育的分子标记位点，对于提高母猪生产性能具有重要意义。卵 泡 抑 素（Follistatin，FST）是 一 种 单 链 糖 蛋白，也被称为卵泡休止素或者性激素抑制蛋白。1987年 Ueno 等4和 Robertson 等5分别从猪和牛的卵泡液中获取了 FST 蛋白。在有关动物繁殖性状的研究中发现 FST 在猪断奶至发情间隔期间是卵泡生长和功能的负调控因子6；FST 在促进猪早期胚胎发育中起作用，促进初始卵裂时间并提高胚泡形成率，还可以提高胚泡质量7；使用高浓度的卵泡抑素后，猪卵丘细胞中的FST基因转录物水平显著降低，同时降低卵母细胞的成熟率8。在有关动物生长性状的研究中发现FST 对于骨骼肌生成是必需的，其通过促进肌纤维形成从而促进肌肉的生长9；FST 的靶向消融导致小鼠骨骼肌受损，从而导致小鼠围产期死亡10；以及FST杂合子小鼠（Fst/-）基因表现出单倍不足和显著减少的肌肉质量11。FST 在猪和其他动物的胚胎阶段调节不同重要器官的发育以及孵化后阶段调节肌肉、生殖和循环器官的生长中起着关键作用12。因此有必要进一步研究FST基因 SNPs 对大白猪生长和繁殖性状的影响。收稿日期：2023-05-15；修回日期：2023-06-15资助项目：兵团科技创新人才计划项目（2020CB018）；国家自然科学基金（31460586）作者简介：张庆泽（1999-），男，黑龙江哈尔滨人，在读硕士研究生，主要从事猪分子育种研究，E-mail：zhangqingze2021 *通讯作者：黄涛（1978-），男，湖北随州人，教授，主要从事猪分子育种研究，E-mail：-186-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期1 材料与方法1.1 实验材料 实验猪均来源于新疆五家渠天康畜牧种猪场（316 头大白母猪），饲养管理条件一致、健康无病。采集耳组织样，放入含 75%乙醇的离心管中，于冰盒中带回实验室-20冰箱保存，以备后续进行样本组织DNA 的提取。1.2 主要仪器、试剂 主要仪器有 LabCycler 梯度 PCR仪，购自 SENSO 公司；DYY-8C 稳流稳压电泳仪，购自北京六一生物科技有限公司；DK-8D 电热恒温水浴锅，购自上海精宏实验设备有限公司；MIKRO 220R台式冷冻离心机，购自 Hettich 公司；Gel DocTM EZ凝 胶 成 像 系 统，购 自 Bio-Rad Laboratories 公 司 等。主要试剂有琼脂糖，购自 Thermo 公司；DNA Marker（1003000 bp），购自生工生物工程（上海）股份有限公司；血液、细胞、组织基因组 DNA 抽提试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；2Es Taq MasterMix，购自北京康为世纪生物科技有限公司等。1.3 实验方法1.3.1 DNA 提取 剪少许猪耳组织样于 EP 管中剪碎，参照血液、细胞和组织 DNA 提取试剂盒说明书进行DNA 提取。用 NanoDrop 2000 可见光分光光度仪检测所提取 DNA 的纯度和浓度，-20保存备用。1.3.2 引物设计 根据 Ensembl 数据库提供的猪FST（Ensembl 号：ENSSSCG00000016892）基因全长序列，采用 Primer Primier 5.0 进行 PCR 扩增引物设计，扩增产物包含全部外显子和部分内含子序列，引物序列见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.3.3 混池测序 随机选取经检测合格的 DNA 样品 40个，每个样品取 10 L 构建 DNA 混池进行 PCR 扩增。PCR 反 应 体 系 15 L，包 括 2Taq Master Mix 6.5 L（1），上、下游引物（10 mol/L）各 0.4 L，模板DNA 0.5 L，ddH2O 补 充 至 15 L。PCR 扩 增 程 序：95预变性 5 min；95变性 30 s，退火（各引物退火温度见表 1）30 s，72 延伸 30 s，共 35 个循环；72延伸 5 min；4保存。PCR 产物用 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果经 chromas 2.6.5 软件进行分析，将正反向测序序列与 Ensembl 所得序列通过DNAMAN 6.0 软件进行比对，检测基因的 SNPs 位点。1.3.4 多态位点分型 对筛查到的多态位点委托石家庄博瑞迪公司利用 GenoPlexs基于多重 PCR 的靶向测序基因型分型技术进行基因分型。1.3.5 数据获取 记录母猪的出生重、出生乳头数；母猪达 100 kg 时的日增重、体重日龄、背膘厚、眼肌面积、眼肌厚；母猪 16 胎次各胎次的总产仔数、产活仔数、死胎数、产仔窝重、仔猪 21 日龄窝重、妊娠期。参照种猪生产性能测定规程（NY/T 822-2004）计算母猪的出生重、出生乳头数；母猪达 100 kg 时的日增重、体重日龄、背膘厚、眼肌面积、眼肌厚的校正数据。统计各指标的估计育种值（Estimated Breeding Value，EBV），并基于此，建立最佳线性无偏预测（Best Linear Unbiased Prediction，BLUP）进行评估，得 出 终 端 品 系（父 系）指 数（Terminal Line Index，TLI）、母系指数（Maternal Line Index，MLI）和繁殖指数（Swine Productivity Index，SPI）。公式如下：TLI=1004.8BVBF2.0BVDAYSMLI=100+120.0BVNBA20.0BVW2E+8.8BVLWT24.0BVBF10.0BVDAYSSPI=100+120.0BVNBA20.0BVW2E+8.8BVLWT式中：BVBF 为校正 100 kg 背膘厚育种值，BVDAYS为校正 100 kg 体重日龄育种值，BVNBA 为胎产活仔数育种值，BVW2E 为断奶至再配天数育种值，校正 21日龄窝重育种值。1.3.6 数据统计与分析 使用 Excel 2016 对数据进行整理并统计各分型结果，分析各位点的基因型频率、基因频率、遗传纯合度（Heterozygosity Observed，Ho）、遗传杂合度（Expected Heterozygosity，He）、有效等位基因数（Effective Number of Alleles，Ne）、多态信息 含 量（Polymorphism Information Content，PIC），并进行卡方适合性检验，检测是否符合 Hardy-Weinberg平衡定律，利用在线软件（RNAfold web server）对外显子区突变前后的 mRNA 二级结构进行预测，利用表 1 引物信息引物 引物序列（53）退火温度,产物长度,bpP1F:CCACCTCCCACTTCTTCAATC62680R:TGTGTTCCCATACCCAAATCTCP2F:CCCTGCCTCTTTCCAACTCT62293R:GTCTTGCTGCGGGACTACCTP3F:TCAAATGCTGAGTCCCAAAG62440R:GTGAGCAGGACAGTTTACCC-187-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 Haploview 4.2 进行连锁不平衡分析。FST基因各位点 SNP 多态性与终身各胎次的总产仔数、产活仔数、死胎数、产仔窝重、仔猪 21 日龄窝重、妊娠期的相关性分析采用 SPSS 26.0 的 General Linear Model 程序，模型如下：yijk=+Gi+Pj+eijk式中：yijk是性状观察值，为总体均数，Gi为基因型效应，Pj为胎次效应，eijk为随机误差，假定eijk相互独立，服从 N（0，2）分布。利 用 SPSS 26.0 的 One-way ANOVA 程 序 对 受 试猪群各基因型与其余生产及繁殖性状进行关联分析，SPSS 26.0 不同基因型对应的性状用“平均值 标准差”的形式表示，P0.05 表示差异显著，P0.01 表示差异极显著。2 结 果2.1 PCR 产物检测 将提取得到的质检结果为浓度在50 ng/L 以 上、OD260/OD280为 1.72.1、无 大 分 子 污染的 DNA 构建 DNA 混池；以 DNA 混池为模板进行PCR 扩增，所得产物经 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图 1）显示，PCR 扩增产物长度与预期大小一致，条带清晰明亮，可进行下一步实验。2.2 FST基因分型结果及突变位点信息 FST基因经混池测序初步筛选出 3 个多态位点，分别为 g.328091 16AG（为同义突变，不改变其编码的谷氨酸）、g.32808636GA 和 g.32809757TA（表 2）。除了 g.3280 9757TA 位点为碱基间的颠换外，其他 SNPs 位点均为碱基间的转换（图 2）。2.3 FST基因多态信息含量、杂合度、有效等位基因数及卡方检验 对 316 头大白母猪进行上述 3 个位点的分型检测。3 个候选位点均在大白母猪群中检测到多态性。316 个样本中有 2 个样本分型失败，成功率大于 95%。根据表 3 可知，3 个 SNPs 在大白猪群基因型频率相同，且均表现为野生纯合型 杂合型 突变纯合型；3 个SNPs 在大白猪群均处于哈代-温伯格平衡状态；3 个SNPs 在大白猪群体均处于低度多态，没有高度多态。2.4 FST基因连锁不平衡分析 根据FST基因 SNPs 信息，利用 Haploview 4.2 软件进行连锁不平衡分析。如图 2 所示，FST基因 3 个位点在大白母猪群均处于完全连锁（D=1，R2=1）（图 3）。表 2 FST基因 SNPs 位点筛查图 2 FST基因 SNPs 位点测序峰图M：100-3000 bp Ladder-K Marker，13：P1P3 引物 PCR 扩增产物。图 1 大白母猪FST基因 PCR 扩增结果P1：GAP2：AGP3：TASNPs所处区域物理位置等位基因变异类型g.32808636GA内含子g.32808636GA内含子突变g.32809116AG外显子g.32809116AG同义突变（Glu）g.32809757TA内含子g.32809757TA内含子突变M123700 bp600 bp500 bp400 bp300 bp200 bp100 bp680 bp440 bp293 bpCCCCAAGAAAAAGATGTAACAGCAAGC-188-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期2.5 FST基因外显子突变后二级结构预测 g.32809 116AG 位于外显子区域，突变后改变FST基因 mRNA序列；g.32808636GA 和 g.32809757TA 位于内含子区域，并不会改变FST基因 mRNA 序列。当FST基因第 4 外显子区发生 g.32809116AG 同义突变后，FST基因 mRNA 二级结构未发生变化（图 4），但野生型的最小自由能为-7 336.82 kJ/moL，而突变型的最小自由能为-7 383.92 kJ/moL，野生型的 mRNA 自由能高于突变型。2.6 FST基因多态位点对母猪生长性状的影响 由于FST基因的 g.32808636GA、g.32809116AG 和 g.3280 9757TA 处于完全连锁遗传，其表型值完全一致，后续数据仅列出 g.32808636GA 位点，下同。GG 基因型 100 kg 眼肌面积显著高于 AA 基因型，GG 基因型100 kg 背膘厚极显著高于 AG 基因型，GG 基因型 100 kg眼肌厚显著高于 AG 和 AA 基因型；其余各性状在各基因型间差异均不显著（表 4）。2.7 FST基因多态性对母猪繁殖性状的影响 g.32808 636GA 位点 GG 基因型个体和 AG 基因型个体的父系指数和出生乳头数均显著高于 AA 基因型个体；其余各性状在各基因型间差异均不显著（表 5）。大白母猪FST基因 SNPs 位点与 16 胎次繁殖性状的关联分析结果见表 6。g.32808636GA 位点 GG 基因型个体母猪产仔窝重显著高于 AA 基因型个体，在母猪妊娠期上 AA 基因型个体极显著高于 AG 基因型个体、显著高于 GG 基因型个体，GG 基因型个体死胎数显著低于 AA基因型个体；其余各性状在各基因型间差异均不显著。3 讨 论卵泡抑素是转化生长因子-（TGF-）家族信号转导的调节因子，通过选择性结合 TGF-家族配体并阻止配体与受体复合物结合发挥作用13-15。相关研究表明TGF-通路对动物排卵数、繁殖16和生长发育17方面有重要影响。因此本研究通过对FST基因 SNPs 位点的检测寻找与母猪生长繁殖性能有关的新标记位点。目前，FST基因的研究主要集中在人、羊、鸡和水牛等动物，与人的痤疮表现18-19和多囊卵泡综合征20、美利奴羊羊毛品质21、鸡的生长性状22和水牛的繁殖性能23密切相关。为了深入探索FST基因与大白母猪生长繁殖性状的相关性，本研究通过 DNA 混池测序技术，筛查到FST基因上的 3 个 SNPs 位点分别为 g.32808636GA、g.32809116AG、g.32809757TA；并通过基因分型检测了FST基因 3 个 SNPs 位点在大白母猪群体中的多圆圈表示 g.32809116AG 位点位置。图 4 FST基因二级结构预测方块颜色表示连锁程度，颜色越深，连锁程度越高；方块中数值为位点间相关性值的百分数，无数值代表两位点完全连锁。图 3 FST基因连锁不平衡分析表 3 大白母猪FST基因 SNP 位点的群体遗传学分析注：df=2，P=0.05 时2=5.99；P=0.01 时2=9.21；PIC0.25 为低度多态；0.25PIC0.5 为高度多态。SNPs基因型频率基因频率遗传纯合度遗传杂合度有效等位基因数多态信息含量2g.32808636GAg.32809116AGg.32809757TAGG/AA/TTAG/GA/ATAA/GG/AAGA0.72790.27201.37380.23501.26280.7102（223）0.2548（80）0.0350（11）0.83760.1624野生型（Wild type）突变型（Mutant）g.32808636GABlock 1（1 kb）123g.32809116AGg.32809757TA-189-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 态性，结果发现，FST基因 3 个 SNPs 位点在大白母猪群体中均处于哈代-温伯格平衡状态，说明FST基因 3个 SNPs 位点在长期选择和进化过程中具有较强的遗传稳定性，并且受到人工选择的干扰较小。而FST基因3 个 SNPs 位点在大白母猪群体中有效等位基因数约为1.37，说明该 3 个位点在大白猪群体中分布相对不均匀。纯合度约为 0.73、杂合度约为 0.27，表明在大白母猪群体中纯合基因型个体占比较大。FST基因 3 个 SNPs 位点在大白母猪群体中均为低度多态，表明该位点在上述大白母猪群体中具有较小的选择潜力，但依旧具有作为选择位点的潜力。动物同一基因上多个突变位点可能同时对性状产生影响24。连锁位点较单一无连锁位点作用更大25。FST基因的 g.32808636GA、g.32809116AG 和 g.3280975 7TA 共 3 个 SNPs 位点完全连锁形成 1 个单倍型块，且其单倍型与FST基因的 3 个 SNPs 位点基因型相同，说明在选育过程中仅需使用单一位点进行分子标记，可降低育种成本。在对FST基因 3 个 SNPs 位点与大白母猪生长性能进行关联分析时发现，3 个 SNPs 位点对 100 kg 眼肌面积、100 kg 眼肌厚和 100 kg 背膘厚有显著或极显著影响，且优势等位基因纯合子具有较好的生长性能。在对FST基因 3 个 SNPs 位点与大白母猪基础繁殖性能进行关联分析时发现，3 个 SNPs 位点对父系指数和出生乳头数有显著影响，优势等位基因纯合子和杂合子具有较好的繁殖性能。本研究显示g.32808636GA、g.32809116AG 和 g.32809757TA位点对母猪终身产仔窝重、死胎数和妊娠期有显著影响，且优势等位基因纯合子具有较好的繁殖性能。因此优势等位基因纯合子可作为大白母猪生长繁殖性状的优势基因型用于大白猪选育过程中。其中 g.32808636GA 和g.32809757TA 属于内含子突变，而 g.32809116AG属于外显子区域的同义突变。内含子突变不会改变蛋白质序列，但内含子突变可能影响基因转录活性从而改变基因功能26。有研究发现，小尾寒羊第 5 内含子中存在 1 个突变位点与产羔数显著相关27。同义突变虽发生在外显子区域，也不会造成氨基酸的改变，但氨基酸的替换会改变 mRNA 的剪切效率或准确性和蛋白产物的结果或效率，也可以通过改变 mRNA 局部结构，影响蛋白质的翻译，进而对表型产生影响28-29。有研究通过分析翻译过程中基因 mRNA 二级结构的功能，发现 mRNA 二级结构稳定性会影响翻译过程且形式较为复杂，最终表现为与蛋白质表达量显著相关30。同时有研究发现绵羊ADIPOQ基因上存在 2 个同义突变位点，第 1 个位点对绵羊初生体高和初生体斜长存在显著影响，第 2 个位点对绵羊初生体重、体高、体斜长、胸围以及 3 月龄体高和胸围存在显著影响31。因此，本研究经在线软件（RNA fold web server）对FST基因g.32809116AG 位点同义突变前后的 mRNA 二级结构进行预测，发现同义突变前后FST基因 mRNA 二级结构未发生改变，但 mRNA 自由能发生改变，可能会影表 6 FST基因多态位点（g.32808636GA）对母猪终身繁殖性状的影响表 5 FST基因多态位点（g.32808636GA）对母猪繁殖性状的影响表 4 FST基因多态位点（g.32808636GA）对母猪生长性状的影响注：同列数据相同位点肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05）；相同位点肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.05）。下同。基因型出生重,kg100 kg 体重日龄,d100 kg 日增重,g100 kg 眼肌面积,cm2100 kg 背膘厚,mm100 kg 眼肌厚,mmGG（223）1.450.27149.356.94671.0031.3024.944.07a14.082.87Aa58.115.49aAG（80）1.500.27149.447.31670.7733.53 23.904.14ab12.902.90Bb56.705.68bAA（11）1.440.21152.973.52654.0515.5422.233.60b 13.643.15ABab54.094.17b基因型母系指数父系指数繁殖指数出生乳头数GG（223）110.2931.57107.6517.34a106.1829.2814.030.41aAG（80）108.8328.06106.6918.63a105.3226.6314.050.42aAA（11）101.5325.9695.198.65b104.1125.3213.730.47b基因型总产仔数产活仔数死胎数产仔窝重21 日窝重妊娠期GG（223）14.673.7413.593.700.751.24b18.134.95a64.5911.48 115.351.48ABbAG（80）14.883.6513.633.67 0.871.37ab 17.184.99ab64.3911.81115.211.33BbAA（11）14.643.3313.073.991.181.99a16.415.03b63.4413.11115.841.68Aa-190-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期响其稳定性和蛋白的表达能力，进而影响其表型。4 结 论本研究揭示了FST基因 g.32808636GA、g.32809 116AG 和 g.32809757TA 位点对大白母猪 100 kg 眼肌面积、100 kg 眼肌厚、100 kg 背膘厚、父系指数、出生乳头数、终身产仔窝重、死胎数和妊娠期有显著或极显著影响，并发现其中优势等位基因纯合子个体具有较好的生长繁殖性能。这些位点可能是影响大白母猪生长繁殖性状的潜在分子标记，在大白母猪分子选育中具有一定的指导意义。参考文献：1 中华人民共和国国家统计局.中国统计年鉴 2022M.北京:中国统计出版社,2022:397.2 李秀领,陈健梅,吴姿仪,等.全基因组关联分析鉴定法系大白猪繁殖性状基因组区域和候选基因 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