青藏高原田鼠源多刺带绦虫囊尾蚴的鉴定及遗传进化分析.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 11 期2023 年 11 月Vol.45，No.11Nov.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202306016青藏高原田鼠源多刺带绦虫囊尾蚴的鉴定及遗传进化分析张学勇1覮，简莹娜1覮，朵红1，郭志宏1，马霄2，张青2，赵存哲2，郭帅2，马万里2，李志1*，付永1*(1.青海大学 畜牧兽医科学院/青海省动物疾病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室，青海 西宁 810016；2.青海省地方病预防控制所，青海 西宁 810016)摘要：为鉴定我国青藏高原分离的田鼠源绦虫囊尾蚴的种类及其遗传进化特征，本研究通过对该囊尾蚴进行形态学观察，采用绦虫cox1基因通用引物，利用PCR扩增并测序，初步鉴定该囊尾蚴。形态学观察结果显示，该囊尾蚴为小型虫体，虫体背部和腹部稍扁平，长度约为200.0 mm，虫体横截面直径约为2.5 mm；虫体分为3部分：前端部分直径通常略小，中间部分表面为皱褶区域，约占整个虫体的一半，后端部分细长，相对光滑，有平行的横向凹陷；PCR结果显示，在约440 bp处出现与预期目的片段大小相符的条带，测序结果显示，该基因序列与多刺带绦虫()cox1基因序列(EU544581)的同源性高达97.0%。初步表明该囊尾蚴属于多刺带绦虫囊尾蚴。采用多刺带绦虫线粒体cox1、nad1和12S rRNA特异性基因引物经PCR进一步鉴定并测序。将3个基因测序结果与GenBank登录的多刺带绦虫的相应基因序列比对，分析它们之间的同源性，并构建这3个基因的进化树，分析它们之间的遗传进化关系。PCR结果显示，分别扩增到约390 bp(cox1)、480 bp(nad1)和240 bp(12S rRNA)的目的条带。同源性分析结果显示，3个基因序列与GenBank登录的多刺带绦虫相应基因序列的同源性最高分别达99.4%、98.7%和100.0%。进化树结果显示，该虫株的3个基因均与不同宿主的多刺带绦虫处于同一分支。本研究在国内首次鉴定到青藏高原田鼠源多刺带绦虫囊尾蚴，并分析其线粒体基因的同源性及遗传演化关系，为多刺带绦虫的分类、鉴定和种群遗传进化分析及分子流行病学调查等奠定了研究基础。关键词：多刺带绦虫；囊尾蚴；田鼠；鉴定；遗传进化中图分类号：S852.7文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)11-1193-06Identification and phylogenetic analysis ofcysticercus isolated from vole in the Qinghai-Tibet Plateau areaZHANG Xue-yong1覮,JIAN Ying-na1覮,DUO Hong1,GUO Zhi-hong1,MA Xiao2,ZHANG Qing2,ZHAO Cun-zhe2,GUO Shuai2,MA Wan-li2,LI Zhi1*,FU Yong1*(1.The Academy of Animal and Veterinary Sciences,Qinghai University,Qinghai Provincial Key Laboratory of Pathogen Diagnosis for AnimalDisease and Green Technical Research for Prevention and Control,Xining 810016,China;2.Qinghai Province Institute for Endemic DiseasesPrevention and Control,Xining 810016,China)Abstract:In order to identify the species and genetic evolution characteristics ofcysticercus isolated fromvole in the Qinghai-Tibet Plateau,this study preliminarily identified the cysticercus by observing its morphological characteristics,收稿日期：2023-06-14基金项目：青海省科技厅应用基础研究项目(2021-ZJ-724)；青海省“昆仑英才高端创新创业人才”项目覮 共同第一作者：张学勇(1986-)，男，河北承德人，博士研究生，主要从事人兽共患病诊断和防治研究；简莹娜(1989-)，女，河北邢台人，博士研究生，主要从事人兽共患病诊断和防治研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding author;覮Equal contributorsand using universal primers for the tapeworm cox1 gene amplification.Morphological characteristics observation results showedthat the cysticercus was a small worm,with a slightly flat back and abdomen,a length of about 200.0mm,and a cross-sectionaldiameter of about 2.5mm;the cysticercus was mostly divided into three parts:the front part was usually slightly smaller indiamater,the surface of the middle part was a wrinkled area,accounting for about half of the entire length of the insect body,andthe rear end part was slender,relatively smooth,and had parallel lateral depressions.The PCR results showed that a band consistentwith the size of the expected target fragment appeared at about 440bp.The sequencing results showed that the homology of thisgene sequence with the cox1 gene(EU544581)of thewas as high as 97.0%.Preliminary results indicated that thecysticerci belonged tocysticerci.The specific primers to mitochondrial cox1,nad1 and 12S rRNA gene ofwere used for PCR amplification.The sequencing results of the three genes were compared with the corresponding genesequences ofin GenBank,and the homology between them was analyzed.The evolutionary trees of these threegenes were constructed to analyze the genetic evolutionary relationship.The PCR results showed that the target bands ofapproximately 390bp(cox1),480bp(nad1)and 240bp(12S rRNA)were amplified respectively.The results of homology analysisshowed that the homology between the three gene sequences and the corresponding gene sequences ofregistered inthe GenBank database was up to 99.4%,98.7%and 100.0%,respectively.The evolutionary tree results showed that the threegenes of this strain were in the same branch asfrom different hosts.This study was the first in China to identifycysticercus from vole and analyze its mitochondrial gene homology and genetic evolution relationship.This studyprovides a basis for the classification,identification,population genetic evolution analysis and molecular epidemiologicalinvestigation of the.Key words:;cysticercus;vole;identification;phylogenetic analysis多刺带绦虫()属扁形动物门()、绦虫纲()、圆叶目()、带科()、带属()的一种寄生性蠕虫，其成虫主要寄生于终末宿主犬、狐狸等犬科动物的小肠内，虫卵随动物粪便排出体外；中间宿主(主要是啮齿类动物如鼠类等)因食用了含有虫卵的水及食物而感染，虫卵在其腹腔生长发育为囊尾蚴，同时对宿主产生严重危害1-2。多刺带绦虫虫卵与其他带科绦虫的虫卵相似，呈球形，表面光滑；囊尾蚴长度约1 cm2 cm，宽度约2 mm3 mm，发育时间不同的囊尾蚴大小也不一样2-3。多刺带绦虫主要分布于欧亚大陆北部冻土带以南地区，如在北欧的芬兰、中欧的德国、西欧的法国、南欧的保加利亚和日本等地区有报道狐狸感染多刺带绦虫1，但在青藏高原尚未有多刺带绦虫感染的研究报道。形态学鉴定是寄生虫研究的重要基础，但从形态上难以对相似种或近缘种绦虫准确区分，这给绦虫的虫卵及囊尾蚴的准确分类鉴定造成一定困难。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，分子生物学鉴定方法可以弥补形态学鉴定的缺陷，PCR、PCR的限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)及DNA测序技术已经成为病原鉴定及其遗传变异研究的有效技术手段4-9。生物体细胞的线粒体DNA基因组是独立于细胞核染色体基因组外的，具有结构简单、母系遗传、无重组、进化速度快、多拷贝等特点；在种群间具有广泛的多态性5-9，已经被广泛用于寄生虫种类鉴定及遗传进化研究8-12。本研究首次对分离自青藏高原地区青海田鼠体内的疑似多刺带绦虫囊尾蚴，经形态学和绦虫cox1基因通用引物的PCR初步鉴定其属于多刺带绦虫囊尾蚴。进一步采用PCR扩增该多刺带绦虫囊尾蚴线粒体基因cox1、nad1和12S rRNA，并分析这3个基因与其它绦虫相应基因的同源性及遗传进化关系。为多刺带绦虫的分类鉴定、分子流行病学调查和种群遗传进化研究提供基础资料及参考依据。1材料与方法1.1主要实验材料1株疑似多刺带绦虫囊尾蚴分离自青藏高原某草场青海田鼠腹腔内(QH1株)，于75%酒精中保存备用。组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR试剂2伊TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix、DNA分子量标准Trans2K DNA Marker、核酸染料GelStain和琼脂糖中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1194Agarose购自北京全式金生物技术有限公司。1.2囊尾蚴的形态特征观察从75%的酒精中取出囊尾蚴虫体，用双蒸水反复冲洗3次后，置于载玻片上，使用体式显微镜观察虫体形态特征，拍照并记录，根据其主要形态特征，查阅文献并对比以初步鉴定囊尾蚴种类。1.3囊尾蚴线粒体相关基因的PCR扩增对1.2中洗涤处理过的囊尾蚴虫体，利用组织基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，以其为模板，根据参考文献11中绦虫的通用引物(cox1基因引物2575/3021)，经PCR初步鉴定并测序。根据初步鉴定结果，利 用 在 线 软 件 Primer 3(https:/bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)设计多刺带绦虫线粒体基因cox1(EU544585)、nad1(EU544637)及 12S rRNA(LT635753)基因扩增引物(表1)，引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。以提取的囊尾蚴样品基因组DNA为模板，分别采用上述3种基因引物经PCR扩增相应基因。反应条件为：94 5 min；94 30 s、各退火温度见表1，退火约40 s、72 1 min，共35个循环，72 10 min。PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物由苏州金唯智生物科技有限公司测序。1.4囊尾蚴线粒体基因序列的同源性和进化树分析测序结果经Clustal X软件校准后，在NCBI上进行BLAST比对分析，并利用DNAStar软件分析测序获得的3个基因序列与GenBank中多刺带绦虫的cox1、nad1和12S rRNA基因序列的同源性；采用MEGA5.0软件以邻接法(Neighbor-Joining method)和Kimura2模式构建这3个基因的系统发育树，以曼氏血吸虫()的线粒体相应基因序列为外群，Bootstrap值设为2000，分析分离的囊尾蚴的遗传进化关系。2结果与讨论2.1囊尾蚴的形态特征观察结果田鼠源囊尾蚴寄生于田鼠腹腔，将其处理后置于体式显微镜下观察虫体形态特征。观察可见其为小型虫体，虫体背部和腹部稍扁平，长度约200.0 mm，虫体横截面直径约2.5 mm；虫体分为3部分：前端部分直径通常略小，中间部分表面为皱褶区域，约占整个虫体长度的一半，后端部分细长，相对光滑，有平行的横向凹陷(图1)。这些特征与某些带科绦虫囊尾蚴相符，与Rausch等描述的多刺带绦虫囊尾蚴的形态特征基本一致2-3，初步鉴定该囊尾蚴为多刺带绦虫囊尾蚴。尽管某些绦虫囊尾蚴间形态差异较大，但某些绦虫如多刺带绦虫、才氏绦虫()和田氏绦虫()囊尾蚴在形态上均非常相似。2.2多刺带绦虫囊尾蚴线粒体基因的PCR扩增结果分子生物学鉴定方法可以在一定程度上克服形态学鉴定方法的某些局限性，准确鉴定并区分形态相似的虫种7-9,12。通过形态学初步鉴定后，本研究利用绦虫cox1基因通用引物(2575/3021)对田鼠源囊尾蚴基因组DNA经PCR初步鉴定，结果显示：在约440 bp处出现与预期目的片段大小相符的条带(图2)，测序后经与GenBank中的带科绦虫cox1基因序列比对，显示该基因序列与多刺带绦虫囊尾蚴cox1基因序列的同源性高达97.0%。再以该囊尾蚴基因组DNA为模板，采用靶向多刺带绦虫线粒体cox1、图1多刺带绦虫囊尾蚴的形态观察(伊4)张学勇，等.青藏高原田鼠源多刺带绦虫囊尾蚴的鉴定及遗传进化分析第 11 期1195表1囊尾蚴PCR鉴定所用引物靶基因Target genescox1cox1nad112S rRNA引物序列Primers sequences2575:5-TTTTTTGGNCATCCKGAGGTTTAT-33021:5-TAACGACATAACATAATGAAAATG-3cox1-F:5-TTTAATTCTTCCTGGGTTTGGTAT-3cox1-R:5-GCAACAACAAATCAAGTATCATGT-3nad1-F:5-TGGTATAATGGGTTTATTTCAAAGT-3nad1-R:5-CCTCACTATAATCAAATGGAATACGA-312S rRNA-F:5-GTGGTGTAAAGGATGTTCC-312S rRNA-R:5-TGTGTACATGAGCTAAACTTTTT-3Tm值Tm value49525152产物大小Product length444bp393bp482bp242bpnad1和12S rRNA基因特异性引物，经PCR扩增。结果显示：分别在约390 bp(cox1基因)、480 bp(nad1基因)和240 bp(12S rRNA基因)处出现相应目的条带，均与预期目的片段长度相符，而阴性对照均无条带(图2)。测序结果显示，这3个基因序列分别与多刺带绦虫的cox1、nad1和12S rRNA基因序列的同源性最高分别达99.4%、98.7%和100.0%。上述结果进一步表明从田鼠体内分离的囊尾蚴为多刺带绦虫囊尾蚴。2.3多刺带绦虫线粒体基因序列的同源性分析结果线粒体cox1基因测序所得序列经生物信息学程序与软件(Clustal X、BLAST和DNAStar)分析后结果显示：分离自田鼠腹腔的囊尾蚴cox1基因序列(OR019678)与多刺带绦虫(EU544581和EU544585)cox1基因序列高度同源(同源性分别为99.4%和99.1%，覆盖度均为100.0%)，与其他多刺带绦虫cox1基因序列的同源性分别达93.1%98.9%(覆盖度为88.0%99.0%)，与(JF268498)cox1基因序列同源性为98.7%(覆盖度为98.0%)，与sp.polyacantha-like(MZ513000)cox1基因序列同源性为96.3%(覆盖度为95.0%)，与其他绦虫如田氏绦虫()、克罗卡特绦虫()、和多头带绦虫()等cox1基因序列的同源性分别低于89.0%。线粒体nad1基因测序所得序列经生物信息学程序与软件分析后结果显示：分离自田鼠腹腔的囊尾蚴 nad1 基 因 序 列(OR023057)与 多 刺 带 绦 虫(EU544635、EU544637和DQ408420)nad1基因序列高度同源(同源性分别为98.7%、98.5%和98.3%，覆盖度均为100.0%)；与其他多刺带绦虫nad1基因序列的同源 性分别 达90.2%98.3%(覆盖 度 为98.0%99.0%)；与 多 刺 带 绦 虫(MN448474)、sp.(KM042889)和(MT882037)nad1基因序列的同源性均为88.4%(覆盖度为100.0%)，与其他绦虫如牛带绦虫()、熊带绦虫()和带状带绦虫()等nad1基因序列同源性分别低于80.0%。线粒体12S rRNA基因测序所得序列经生物信息学程序与软件分析后结果显示：分离自田鼠腹腔的囊尾蚴12S rRNA基因序列(OR020966)与多刺带绦虫(LT635750和LT635753)12S rRNA基因序列高度同源(同源性均为100.0%，覆盖度均为100.0%)，与其他多刺带绦虫12S rRNA基因序列同源性分别达98.2%100.0%(覆盖度为82.0%100.0%)，而与带状泡尾绦虫()(LT635754)12S rRNA基因序列同源性为99.2%(覆盖度为100.0%)，与(MT882037)12S rRNA基因序列同源性为94.2%(覆盖度为100.0%)，与其他绦虫如、泡状带绦虫()、和链状绦虫()等的12S rRNA基因序列同源性分别低于89.0%。本研究分离的囊尾蚴的cox1、nad1和12S rRNA基因均与多刺带绦虫相应基因序列同源性最高，综合3个基因的同源性分析结果可以确定分离的囊尾蚴为多刺带绦虫囊尾蚴；但在分析过程中发现：囊尾蚴cox1基因序列与一株带状带绦虫cox1基因序列同源性也高达98.7%(覆盖度为98.0%)；囊尾蚴12SrRNA基因序列与一株带状泡尾绦虫12S rRNA基因序列同源性为99.2%(覆盖度为100.0%)。上述结果表明，单个分子标记基因可能会出现虫种鉴定错误或不能确定虫种的情况，所以要进行多标记基因的鉴定及分析才可以确保鉴定的准确性8-9。目前，国内对多刺带绦虫生物学与流行病学研究非常少，仅在新疆地区狐狸粪便样品中检测到多刺带绦虫1，尚无其中间宿主的研究报道。本研究首次在青海田鼠中鉴定到多刺带绦虫囊尾蚴，丰富了多刺带绦虫的中间宿主。同时，发现这些遗传标记基因cox1、nad1和12S rRNA在种内变异很小，但在种间差异明显，且已被广泛应用于寄生虫虫种的分类学研究4-6,8-10。2.4分离的多刺带绦虫线粒体基因系统发育分析利用MEGA 5.0软件中的NJ法构建基于绦虫cox1、nad1和12S rRNA基因的系统发育树，分析田鼠源囊尾蚴与其它绦虫的遗传进化关系。基于3种基因构建的系统发育树显示，分离自田鼠的囊尾蚴均与中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1196M:DL2000 DNA Marker;1:ddH2O;2:Amplication products of cox1gene using universal primer;3:Amplication of cox1 gene using specificprimer;4:nad1 gene;5:12S rRNA gene图2多刺带绦虫囊尾蚴线粒体相关基因的PCR扩增结果1000bp750bp500bp250bp100bpM123451234荫：本研究鉴定的囊尾蚴。荫:Identificaition of crysticercus in this study.图3基于多刺带绦虫cox1基因构建的系统进化树张学勇，等.青藏高原田鼠源多刺带绦虫囊尾蚴的鉴定及遗传进化分析第 11 期1197GenBank登录的不同多刺带绦虫分离株位于同一分支，但与其它绦虫如肥头带绦虫()、亚洲 带 绦 虫()、克 氏 绦 虫()、马堤绦虫()、羊带绦虫()、豆状带绦虫()、猪 带绦 虫()、和特氏绦虫()所属分支均较远，能够区别多刺带绦虫与其他带科绦虫。本研究分离株与多刺带绦虫遗传距离上最近，进一步表明寄生于田鼠腹腔的囊尾蚴为多刺带绦虫囊尾蚴(仅附cox1基因进化树，图3)；但在进化树上，本研究分离的多刺带绦虫囊尾蚴与其他地区分离多刺带绦虫各自形成独立的小分支，这可能与青藏高原地理环境相关，该囊尾蚴已经形成了特有的地理种群结构，这也需要后续采集更多的囊尾蚴样品进行相关研究。本研究通过对我国青藏高原分离的青海田鼠源囊尾蚴进行形态学观察及分子鉴定，最终确定分离的田鼠源囊尾蚴为多刺带绦虫囊尾蚴，该结果为多刺带绦虫的分子生物学鉴定奠定了基础，同时表明线粒体基因适合作为多刺带绦虫囊尾蚴虫种鉴定的遗传标记。本研究是国内首次对田鼠源多刺带绦虫囊尾蚴进行分子生物学鉴定及系统进化分析，不仅丰富了多刺带绦虫的群体遗传学研究资料，而且为多刺带绦虫的分类、鉴定和种群遗传进化研究及其流行病学调查等提供了参考依据。参考文献：LIU GANG,JI NA,HORNOK S,et al.Morphological andmolecular analyses ofandspecies fromred foxes()in northwestern China J.Int J Para-sitol Parasites Wildl,2021,16:270-274.RAUSCH R L,FAY F H.Postoncospheral development and cy-cle ofLeuckart,1856(Cestoda:Taeniidae):First part J.Ann Parasitol Hum 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saginata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刘韵佳.CRISPR-Cas12a和Cas13a对猫1型疱疹病毒(FHV-1)与猫杯状病毒(FCV)核酸检测方法的建立及初步应用D.成都：西南民族大学，2022.YE JING-FEI,LI ZHI-JIE,SUN FEIYAN,et al.Developmentof a triple NanoPCR method for feline calicivirus,feline pan-leukopenia syndrome virus,and feline herpesvirus type I virusJ.BMC Vet Res,2022,18(1):379.郑焕英，张官婷，柯碧霞，等.新型冠状病毒荧光定量PCR的Ct值与病毒分离的结果分析J.病毒学报，2023，39(1)：199-205.CAO NAN,TANG ZHI-HUI,ZHANG XI-YU,et al.Develop-ment and application of 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