葱白提取物对心肌梗死大鼠促血管新生作用及机制研究.pdf

葱白提取物对心肌梗死大鼠促血管新生作用及机制研究罗雨佳，雷杰，祝炜，段刚峰*（武汉市中西医结合医院心血管内科，湖北武汉430022）摘要：目目 的的探讨葱白提取物（fistular onion bulb，FOB）对促血管新生（angiogenesis）的作用及其机制。方方 法法将 SD 大鼠，随机分成葱白提取物组、麝香保心丸组、模型组、假手术组，每组10 只。在适应性喂养 1 周后，行左冠脉前降支结扎造模。CD34 免疫组化染色观察心肌梗死边缘区微血管数量（microvessel quantity，MVQ）及微血管密度（microvessel density，MVD）；ELISA 法检测血清转化生长因子-（transforming growth factor-，TGF-）含量；Western Blot 法检测大鼠左室心肌组织丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MEK）、细胞外信号调节激酶（extracellular singnal-regulated kinase，ERK）蛋白含量；RT-PCR 法检测心肌梗死边缘组织 MEK、ERK mRNA 表达量。结结 果果与模型组相比，葱白提取物组、麝香保心丸组在 CD34 染色后心肌梗死边缘区微血管计数大幅升高（P 0.01）；葱白提取物组微血管计数低于麝香保心丸 组（P 0.01）。与 模 型 组 相 比，葱 白 提 取 物 组、麝 香 保 心 丸 组 血 清 TGF-均 增 加（P 0.01，P 0.05）。葱白提取物组及麝香保心丸组 MEK、ERK 蛋白表达量均增加，MEK、ERKmRNA 扩增倍数显著升高（P 0.01）；与麝香保心丸组相比，葱白提取物组 ERK 蛋白表达量、ERK mRNA 扩增倍数均较低（P 0.01，P 0.05）。结结 论论葱白提取物具有促进梗死心肌血管新生作用，增加心肌梗死边缘区新生血管数目，其机制可能与上调血清 TGF-水平及 MEK/ERK 信号通路表达有关。关键词：葱白提取物；心肌梗死；血管新生；TGF-；MEK/ERK中图分类号：R542.220.5文献标志码：A文章编号：1673-0143（2023）05-0060-07DOI：10.16389/42-1737/n.2023.05.008Study on Angiogenesis Effect and Mechanism of Fistular Onion Bulbon Myocardial Infarction in RatsLUO Yujia，LEI Jie，ZHU Wei，DUAN Gangfeng*（1.Department of Cardiovascular Medicine，Wuhan Hospital of Integrated Traditional Chinese and WesternMedicine，Wuhan 430022，Hubei，China）Abstract：Objective To probe the function and mechanism of the fistular onion bulb（FOB）in收稿日期：2022-10-22基金项目：武汉市卫生计生委员会科研项目（WZ16D03）；新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（2021D01F22）作者简介：罗雨佳（1994-），女，护师，研究方向：中西医结合心血管疾病护理。*通信作者：段刚峰（1977-），男，副主任医师，博士，研究方向：中西医结合治疗心血管疾病。E-mail：第 51卷 第 5期2023年 10月江 汉 大 学 学 报（自 然 科 学 版）J.Jianghan Univ.（Nat.Sci.Ed.）Vol.51 No.5Oct.20232023年第 5期promoting angiogenesis on myocardial infarction in rats.Methods Randomly dividing the ratsinto 4 groups（10 in each group）：the FOB group，the Shexiang Baoxin pill group，the modelgroup，and the sham operation group.After one week of adaptive feeding，the model of leftanterior descending coronary artery ligation was performed.The quantity and density of microvascularin the margin of myocardial infarction were observed by CD34 immunohistochemical staining.Serum TGF-content was detected by ELISA.The protein levels of MEK and ERK in theleft ventricular myocardium of rats were detected by Western Blot.The mRNA expressionlevels of MEK and ERK in the edge of myocardial infarction were detected by RT-PCR.Results Compared with the model group，The MVD value of CD34 staining in The FOBgroup and the Shexiang Baoxin pill group was significantly increased（P 0.01）.The MVDvalue in The FOB group was lower than that in the Shexiang Baoxin pill group（P 0.01）.Compared with the model group，the level of serum TGF-in the FOB group wassignificantly increased（P 0.01），and the level of TGF-in the Shexiang Baoxin pillgroup was also increased（P 0.05）.The protein expression levels of MEK and ERK wereincreased，and the amplification factor of MEK and ERK mRNA was significantly increased（P 0.01）.Compared with the Shexiang Baoxin pill group，the ERK protein expressionlevel，and the ERK mRNA amplification multiple were lower in the FOB group（P 0.01，P 0.05）.Conclusion The FOB can promote the angiogenesis of myocardial infarction and increase thenumber of neovascularization at the edge of myocardial infarction.The mechanism may berelated to the up-regulation of serum TGF-level and the expression of the MEK/ERKsignaling pathway.Key words：fistular onion bulb（FOB）；myocardial infarction；angiogenesis；TGF-；MEK/ERK据 2020 年 中国心血管健康与疾病报告 显示，自 2002 年以来中国心肌梗死患病率与病死率呈持续增长趋势1。心肌梗死是指在严重冠状动脉狭窄的情况下，出现供血区心肌严重且持续缺血，导致左心室功能障碍2。临床上常予以冠脉介入等方法快速有效地恢复心肌血供，避免心肌梗死的进一步严重发展。而若患者为冠状动脉远端弥漫性病变、缺血梗死病变范围广泛或不能耐受手术等情况，介入等传统血管重建手术治疗在此时出现一定的局限性3。所以在发生心肌梗死后，通过促进相应部位血管新生建立侧支循环代偿或许能达到更好的治疗效果，“治疗性血管新生”的观念应运而生4。本团队前期研究发现，以葱白为代表的益气温阳治法能改善心肌缺血情况，减小心肌梗死区域 面 积，减 轻 心 肌 梗 死 后 再 灌 注 损 伤5-6。本 次 试 验 拟 探 讨 葱 白 提 取 物（fistulan onion bulb，FOB）促进血管新生的具体机制，行左冠状动脉结扎构建心肌梗死大鼠模型，通过 CD34 免疫组化染色观察新生血管情况，并研究葱白提取物对 TGF-及 MEK/ERK 通路的调控作用，发掘葱白提取物对于心肌梗死后相应区域新生血管的影响及机制。1材料和方法1.1材料1.1.1试验动物SPF 级 SD 大鼠 40 只，雄性，3 4 月龄，体重（200 20）g，购于湖北省实验罗雨佳，等：葱白提取物对心肌梗死大鼠促血管新生作用及机制研究61江汉大学学报（自然科学版）总第 51卷动物研究中心（42000600004917）。1.1.2药物葱白提取物（武汉市中西医结合医院提供，批号 2081205）配成浓度 300 mg/mL 混悬液；麝香保心丸（上海和黄药业有限公司，批号：Z31020068），配成浓度 7.5%混悬液。1.1.3试剂TGF-试剂盒（欣博盛生物科技有限公司），RIPA 裂解液、50*cooktail、PMSF、磷酸化蛋白酶抑制剂、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、ECL、显影定影试剂（武汉谷歌生物科技有限公司），三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、二甲苯、H2O2（国药集团化学试剂有限公司），抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒（丹麦 Agilent Dako 公司），BSA（罗氏制药公司）。1.1.4主要仪器分光光度仪、高精度加液器（美国 GeneRay 公司，UV-photomete 型），TGL-16c 台式离心机（上海安亭科学仪器厂），荧光定量 PCR 仪（上海宏石医疗科技有限公司），纯水仪（青岛富勒姆科技有限公司，FBZ2001-up-p 标准试剂型），WD-9405A 脱色摇床、DYY-6C 电泳仪（北京六一仪器厂），AX-暗匣（广东粤华医疗器械厂有限公司），感光胶片（美国 EastmanKodak 公司），V300 扫描仪（日本 EPSON 公司），alphaEaseFC 灰度分析软件（Alpha Innotech 公司），HX200 动物人工呼吸机（成都春盟科技有限公司）。1.2方法1.2.1大鼠心肌梗死造模将大鼠于 SPF 级动物房分笼适应性饲养 1 周，再行造模。首先将大鼠经腹腔注射麻醉（10%水合氯醛，3 mL/kg），再取仰卧位固定大鼠四肢于无菌操作台上，颈、胸部备皮及消毒处理，连接心电图记录仪，记录术前正常心电图。用小型动物呼吸机行有创呼吸支持，而后打开胸腔，充分暴露心脏术野，4 号线结扎大鼠冠状动脉左前降支。根据心电图记录仪、导联出现 ST 段上抬，同时左室心肌组织颜色变浅为结扎成功标准7。术毕将心脏回纳，缝合胸腔。假手术组操作步骤同上，但只放置手术线不结扎冠脉（造模后死亡 3 只大鼠，当即予以补充，步骤同前）。1.2.2分组、给药将造模成功大鼠编号，通过随机数字表分成模型组、葱白提取物组、麝香保心丸组、假手术组，每组 10 只。于造模后给药，葱白提取物组及麝香保心丸组各以 2 mL/kg 的剂量标准灌胃给药，模型组和假手术组予同体积生理盐水灌胃，每日 1 次，持续 28 d。1.2.3标本采集、指标检测持续给药 28 d 后，次日清晨开始行腹腔麻醉（方法同上），麻醉完全后，从腹主动脉处采血 3 mL，立即置于离心机离心 15 min（3 000 r/min），用移液枪取上层血清于EP 管，采用 ELISA 法快速检测大鼠血清 TNF-含量，具体步骤依照 TGF-试剂盒说明书进行。剪取心脏左心室组织，0.9%氯化钠溶液冲洗后，放入 4%多聚甲醛溶液浸没固定 24 h，再依次行多梯度酒精脱水、二甲苯透明处理、石蜡包埋，切片，烤片，存储。1.2.4CD34 染色并检测微血管数量及密度以 ELPS（Enhance Labeled Polymer System）8法将预处理好的心肌切片先行 TBS 处理、蒸馏水漂洗，再依次置入一抗、EnVision、色源底物溶液孵育30 min，蒸馏水漂洗封片。每组内每张切片随机选取 200倍 3处视野进行拍照记录，运用 Image 6.0图像分析软件分析出每张照片心肌组织面积和相应微血管计数数量（MVQ），平均微血管计数数量比上心肌面积就能得到微血管密度（MVD）。1.2.5Western Blot 法检测 MEK、ERK 蛋白含量取冻存心肌组织常温解冻，剪碎成小块置于组织液中进行匀浆，取 1.5 mL 匀浆液离心，收集上清液，即为总蛋白溶液。采用 Bradford 法测定蛋白浓度，计算上样量值。随后进行 SDS-PAGE 电泳，100 V 上样电泳 60 min，200 mA 转膜60 min，5%脱脂牛奶封闭 60 min，加入一抗（稀释 1 1 000）4 孵育过夜，TBST 清洗 3 次，加入二抗（稀释 13 000）孵育 30 min，再次 TBST 清洗 3 次。行化学发光显影，样本灰度值用 AlphaEaseFC 软件分析。1.2.6RT-PCR 法检测 MEK mRNA、ERK mRNA 扩增倍数取 100 mg 心肌组织加入匀浆器研622023年第 5期磨至无小块状组织，加入250 L三氯甲烷颠倒混匀随后平放3 min，在4 下离心8 min（13 000 r/min），用移液枪移取上清液，再加异丙醇继续颠倒混匀，-20 平放 15 min后离心 10 min（13 000 r/min），吸去液体，继续加入 75%乙醇 1.5 mL 洗涤，再次 4、13 000 r/min 离心 5 min，去除液体，即能得到总 RNA。然后于 PCR 机上，使 RNA 溶液与 10 mmol/L dNTPs、RNA inhibitor、反转录酶混合反应 30 min，结束时灭活反转录酶（80 保温 5 min）得到 cDNA。取 20 LPCR 管配置 PCR 反应 体 系（2 qPCR Mix 12.5 L、7.5 mol/L 基因引物 2.0 L、cDNA 2.5 L、ddH2O 8.0 L），95 预变性 10 min，95 变性 15 s，60 退火 60 s，循环 40 次，60 延伸 5 min，将得到的扩增结果以 2-CT 法进行处理并整理呈图表。各引物信息见表 1。表 1各 PCR 引物序列Tab.1PCR primer sequencesPrimersRat MEKRat ERKRat-actin引物序列上游引物下游引物上游引物下游引物上游引物下游引物5-GACGAGCAGCAGCGGAAG-35-CTTGAACACCACTCCACCATTG-35-TGCCATTGAGCAGGACTACC-35-GGTGATGGTTGCCACAGTCTT-35-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-35-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-31.2.7统计学方法实验中使用 SPSS19.0 统计软件对数据进行分析，结果以均数标准差（x s）表示，使用单因素方差分析比较多组间的均值，以 P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠心肌梗死边缘区微血管密度及 CD34 免疫组化染色结果见表 2和图 1。由表 2结果可知，与假手术组相比，心梗模型大鼠心肌微血管密度升高（P 0.01）；且与模型组相比，应用葱白、麝香保心丸治疗的大鼠 MVD 数值均进一步升高（P 0.01）。表 2各组大鼠心梗边缘区微血管密度Tab.2MVD in the marginal area of myocardial infarction in rats of each group（x s）（n=10）组别假手术组模型组葱白组麝香保心丸组MVD/（个mm-2）29.99 10.7559.94 8.81a73.58 8.03b102.30 13.65b注：与假手术组比较，a 表示 P 0.01；与模型组比较，b 表示 P 0.01。A.假手术组；B.模型组；C.葱白提取物组；D.麝香保心丸组。图 1四组大鼠心梗边缘区心肌组织 CD34 染色结果（200）Fig.1CD34 staining results of myocardial tissue in the marginal zone of myocardial infarction in four groupsof rats(200)罗雨佳，等：葱白提取物对心肌梗死大鼠促血管新生作用及机制研究63江汉大学学报（自然科学版）总第 51卷2.2各组大鼠血清 TGF-水平比较结果如表 3 所示。模型组大鼠血清 TGF-水平较假手术组明显升高（P 0.01）。与模型组相比，麝香保心丸组、葱白组大鼠血清 TGF-水平均升高（P 0.05，P 0.05）。表 3各组大鼠血清 TGF-含量比较Tab.3Serum TGF-content comparison of rats in each group（x s）（n=10）分组假手术组模型组麝香保心丸组葱白组TGF-/（gmL-1）30.697.9039.509.75a48.815.03c50.164.90bd注：与假手术组比较，a 表示 P 0.05；与模型组比较，b 表示 P 0.01，c 表示 P 0.05。2.3各组大鼠心肌边缘区 MEK、ERK 灰度比值比较结 果 见 图 2。由 图 2 可 知 与 假 手 术 组 比 较，模 型 组 大 鼠 心 肌 ERK/actin 比 值 下 降（P 0.05）。与模型组比较，麝香保心丸组、葱白组心肌MEK/actin、ERK/actin 比值均明显上升（P 0.05），ERK/actin 比值有所降低（P 0.05，b 表示 P 0.01；与模型组比较，c 表示 P 0.05，e 表示 P 0.01。图 2各组大鼠心梗边缘区 MEK、ERK 蛋白表达（n=10）Fig.2Expression of MEK and ERK proteins in the marginal zone of myocardial infarction in rats of eachgroup（n=10）2.4各组大鼠心梗边缘区 MEK mRNA、ERK mRNA 表达比较结果见图 3。由图 3 可知，以假手术组为参照对比，记录其余各组大鼠心梗边缘区 MEKmRNA、ERK mRNA 扩增倍数。葱白组和麝香保心丸组较模型组而言，上述指标均极显著增加（P 0.01）；与 麝 香 保 心 丸 组 比 较，葱 白 组 MEK mRNA、ERK mRNA 扩 增 倍 数 均 明 显 降 低642023年第 5期（P 0.01，P 0.05）。ABCD2.01.51.00.50.0ABCD3210MEK mRNA 扩增倍数baacERK mRNA 扩增倍数A 假手术组；B 模型组；C 葱白组；D 麝香保心丸组；与模型组比较，a 表示 P 0.01；与麝香保心丸组比较，b 表示 P 0.01，c 表示 P 0.05。图 3各组大鼠心梗边缘区 MEK mRNA、ERK mRNA 表达情况Fig.3Expression of MEK mRNA and ERK mRNA in the marginal zone of myocardial infarction in rats ofeach group3讨论中医药在心血管系统疾病治疗方面有着悠久的历史，如 金匮要略 所言：“夫脉当取太过不及，阳微阴弦，即胸痹而痛”指出胸痹主要病机为上焦心阳虚衰，治当以温阳通脉9。葱白为辛温通阳药，具有温通心脉，宣通胸阳的作用。且葱白提取物能抗氧化损伤、抑制炎症反应，对心肌缺血损伤大鼠心肌有保护作用10。当冠状动脉的血供急剧减少或中断时，冠脉微循环也遭受巨大损伤，梗死区发生微血管解体和毛细血管狭窄，相应供血区域心肌组织能量和氧气都会急剧减少，血管内皮细胞缺氧诱导因子被激活，静止的内皮细胞重新调整血管形状来优化血流11。但仅靠自发性代偿性血流调节远远不够，目前临床常见的治疗手段如血管介入和冠脉搭桥手术均旨在尽快改善心肌组织缺血情况，若为冠状动脉远端弥漫性病变或不能耐受手术，采用促血管新生治疗建立侧支循环也不妨是一种更合适的治疗手段。血管新生是一个复杂的过程。首先是血管活化阶段，血管基底膜降解、通透性增加，使血管内皮细胞可以迁移到缺血区，以出芽的方式形成新的毛细血管，其次是血管稳定阶段，血管内皮细胞分泌 TGF-将间充质细胞召集到血管周围，并分化为周细胞和成纤维细胞，紧密保护新生血管12。TGF-1 可以启动周细胞祖细胞的分化，也能推动神经嵴或间充质来源的祖细胞分化为平滑肌样细胞13。内皮素敲除小鼠的实验证实了 TGF-1 在这一过程中的功能意义，这些小鼠由于血管重构缺陷和平滑肌细胞分化而无法存活14。内皮素是一种 TGF-结合蛋白，也被称为 TGF-III 型受体。也有研究15发现，麝香通心滴丸可促进心梗大鼠的心肌梗死区血管新生，减小梗死面积，上调心肌 TGF-1 蛋白表达。TGF-的下游信号通路，除了经典的 Smad 通路外，还有丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路16。MAPK 通路是由 Ras、Raf、MEK 和 ERK 组成的一系列蛋白激酶，在所有真核细胞中都具有高度保守特性17。ERK 是介导血管生成的重要信号蛋白，可被细胞外生长因子刺激，然后通过其下游细胞质或细胞核中的信号分子调控内皮细胞的细胞周期、增殖、迁移、凋亡和血管生成18。研究19发现，丹红注射液可通过激活 ERK 信号通路，上调 ERK、MEK 磷酸化水平，减小心肌梗死模型小鼠的心梗面积、增加心梗边缘区毛细血管密度、提高心脏射血分数。本试验通过 CD34 免疫组化染色发现，葱白提取物能增加心肌梗死边缘区新生血管数量，有促血管新生作用，同时其也能明显提升血清 TGF-及心肌组织中 MEK、ERK 表达含量。综上罗雨佳，等：葱白提取物对心肌梗死大鼠促血管新生作用及机制研究65江汉大学学报（自然科学版）总第 51卷所述，葱白提取物促血管新生改善心肌缺血情况有正向作用，其作用机制可能通过上调 TGF-及 MEK/ERK 信号通路水平有关，最终实现促血管新生促进心肌梗死区侧支循环血管建立。参考文献（References）1国家心血管中心.中国心血管健康与疾病报告 2020 概要 J.中国循环杂志，2021，36（6）：521-545.2CABAC-POGOREVICI I，MUK B，RUSTAMOVA Y，et al.Ischaemic cardiomyopathy，pathophysiological insights，diagnostic management and the roles of revascularisation and device treatment.Gaps and dilemmas in the era of advanced technologyJ.Eur J Heart Fail，2020，22（5）：789-799.3SYED I S，SANBORN T A，ROSENGART T K.Therapeutic angiogenesis：a biologic bypassJ.Cardiology，2004，101（1/2/3）：131-143.4WU X，REBOLL M R，KORF-KLINGEBIEL M，et al.Angiogenesis after acute myocardial infarctionJ.Cardiovasc Res，2021，117（5）：1257-1273.5贺清，赵勇，覃佐涛，等.葱白提取物对心脑血管疾病作用的现代研究概况 J.中西医结合心脑血管病杂志，2016，14（9）：970-972.6谢婷婷，邢若丹，顾歆韵，等.葱白提取物对心梗后心衰大鼠心室重构及细胞凋亡的影响 J.中国中医基础医学杂志，2021，27（2）：244-246，283.7 李雪健，张晓，车运输，等.大鼠心力衰竭模型的建立与评估 J.心脏杂志，2016，28（6）：671-675.8王杨，张娟，唐俊明，等.腺病毒介导的基质细胞衍生因子-1 对心肌梗死大鼠心脏功能的影响 J.第四军医大学学报，2009，30（15）：1375-1378.9张敏州，丁邦晗，林谦.急性心肌梗死中医临床诊疗指南 J.中华中医药杂志，2021，36（7）：4119-4127.10 田立群，雷杰，祝炜，等.葱白提取物对心肌缺血-再灌注损伤大鼠的保护作用及其机制 J.医药导报，2022，41（1）：24-29.11 CARMELIET P，JAIN R K.Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesisJ.Nature，2011，473（7347）：298-307.12 GOUMANS M J，TEN DIJKE P.TGF-signaling in control of cardiovascular functionJ.Cold SpringHarb Perspect Biol，2018，10（2）：a022210.13 DOSTAL D，GLASER S，BAUDINO T A.Cardiac fibroblast physiology and pathologyJ.Compr Physiol，2015，5（2）：887-909.14 CHEN S，LECHLEIDER R J.Transforming growth factor-beta-induced differentiation of smooth musclefrom a neural crest stem cell lineJ.Circ Res，2004，94（9）：1195-202.15 杨杉杉.基于 TGF-1/ALK1/Smad1/5 信号通路的麝香通心滴丸促血管新生作用机制研究 D.哈尔滨：黑龙江中医药大学，2021.16 BERTOLINO P，DECKERS M，LEBRIN F，et al.Transforming growth factor-beta signal transduction inangiogenesis and vascular disordersJ.Chest，2005，128（6 Suppl）：585S-590S.17 DHILLON A S，HAGAN S，RATH O，et al.MAP kinase signalling pathways in cancerJ.Oncogene，2007，26（22）：3279-3290.18 徐润强，刘海盛.靶向 VEGFA 调控 MAPK/ERK 和 PI3K/Akt 信号通路在结直肠癌血管生成中的作用及机制 J.中国医学创新，2021，18（9）：33-37.19 LI S N，LI P，LIU W H，et al.Danhong injection enhances angiogenesis after myocardial infarction by activating MiR-126/ERK/VEGF pathwayJ.Biomed Pharmacother，2019，120：109538.（责任编辑：范建凤）66