PCR技术的原理及其应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR,技术的原理及其应用,1,PCR,技术简史,最早，,Korana,于,1971,年提出核酸体外扩增的设想：,“,经过,DNA,变性，与合适的引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆,tRNA,基因,”,。,1985,年美国,PE-Cetus,公司人类遗传研究室的,Mullis,等发明了聚合酶链反应。其原理类似于,DNA,的体内复制，只是在试管中给,DNA,的体外合成提供一种合适的条件,模板,DNA,，,寡核苷酸引物，,DNA,聚合酶，合适的缓冲体系，,DNA,变性、复性及延伸的温度与时间。,2,1988,年,Saiki,等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌,(,thermus aquaticus),中提取到一种耐热的,DNA,聚合酶。此酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度,(2.0,Kb),。,由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。此酶的发现使,PCR,技术被,广泛的应用。,3,1.,PCR,技术的基本原理,PCR,由变性,-,退火,-,延伸三个基本反应步骤构成：,模板,DNA,的变性：即在高温（93左右）下，待扩增的靶,DNA,双链受热变性成为两条单链,DNA,模板；,模板,DNA,与引物的退火(复性)：在低温（3755）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合；,引物的延伸：在,TaqDNA,聚合酶的最适温度（72）下，以,dNTP,为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的53方向延伸，合成,DNA,新链。重复循环变性,-,退火,-,延伸三过程，就可获得更多的,“,半保留复制链,”,，而且这种新链又可成为下次循环的模板。,4,5,PCR,反应五要素：,即参加,PCR,反应的五种主要物质：引物、酶、,dNTP、,模板和,Mg,2+,。,引物,：,引物是,PCR,特异性反应的关键，,PCR,产物的特异性取决于引物与模板,DNA,互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板,DNA,序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用,PCR,就可将模板,DNA,在体外大量扩增。,6,酶浓度：催化,PCR,反应约需酶量1,ul(,总反应体系为100,ul,时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,dNTP,的质量与浓度：注意4种,dNTP,的浓度要相等(等摩尔配制)。如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配；浓度过低又会降低,PCR,产物的产量。,dNTP,能与,Mg,2+,结合，使游离的,Mg,2+,浓度降低。,7,模板：模板核酸的量与纯化程度，是,PCR,成败与否的关键环节之一。传统的,DNA,纯化方法通常采用,SDS,和蛋白酶,K,来消化处理标本。,SDS,的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，,SDS,还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶,K,能水解消化蛋白质，特别是与,DNA,结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于,PCR,反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于,PCR,扩增。,RNA,模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶,K,法，要防止,RNase,降解,RNA,。,8,Mg2+,浓度：,Mg2+,对,PCR,扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的,PCR,反应中，各种,dNTP,浓度为200,umol/L,时，,Mg2+,浓度为1.52.0,mmol/L,为宜。,Mg2+,浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低,Taq DNA,聚合酶的活性，使反应产物减少。,9,2.PCR,技术的主要类型及其应用,原位,PCR,技术,:,原位,PCR,就是在组织细胞里进行,PCR,反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的,PCR,技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。,原位,PCR,既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值,。,其特异性和敏感性高于一般的,PCR。,10,反向,PCR：,反向,PCR,的目的在于扩增一段已知序列旁侧的,DNA,，,也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成,DNA，,用于研究与已知,DNA,区段相连接的未知染色体序列。这时选择的引物虽然与核心,DNA,区两末端序列互补，但两引物3端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品,DNA，,然后用,DNA,连接酶连接成一个环状,DNA,分子，通过反向,PCR,扩增引物的上游片段和下游片段。,利用反向,PCR,可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知,DNA,片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA,进行分子克隆，建立全长的,DNA,探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列,DNA,旁侧病毒整合位点分析等研究。,11,反向,PCR,原理示意图,12,反向,PCR,的不足：,需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的,DNA,片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶,DNA,；,大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在,YAC,或,Cosmid,中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向,PCR,得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。,13,锚定,PCR,：,锚定,PCR,（,Anchored PCR,A-PCR,）,主要用于分析具有可变末端的,DNA,序列，,Loh,等用锚定,PCR,对人外周血淋巴细胞,T,细胞受体,-,链的,mRNA,的多变性进行了分析。先合成,cDNA,，,并用末端脱氧核苷酸转移酶在其,3-,可变区末端加上一个,PolyG,尾巴。,Loh,等在恒定区与可变区连接部位设一个引物，另一个引物是一个具,5-,polyG,尾巴的引物。带有,PolyG,尾巴的引物是一个固定点，它可以并与,PolyG,尾巴结合，无论其余部分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述,mRNA,中检出至少,20,种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定,PCR,不对任何特殊序列有倾向性结果，可用于,T,细胞、,肿瘤,及其它部位抗体基因的研究。,14,锚定,PCR,原理示意图,15,标记,PCR,和彩色,PCR：,标记,PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR,是利用同位素或荧光素对,PCR,引物的5端进行标记，用来检测靶基因是否存在。彩色,PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，,是,LP-PCR,的一种。它用不同颜色的荧光染料标记引物的5端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物5的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等。,16,不对称,PCR：,不对称,PCR(asymmetric PCR),是用不等量的一对引物，,PCR,扩增后产生大量的单链,DNA。,这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为501001。在,PCR,反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链,DNA，,但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的,PCR,就会产生大量的单链,DNA。,不对称,PCR,的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。还有一种方法是先用等浓度的引物,PCR,扩增，制备双链,DNA，,然后以此双链,DNA,为模板，再以其中的一条引物进行第二次,PCR，,制备单链,DNA。,不对称,PCR,制备的单链,DNA，,主要用于核酸序列测定。,17,多重,PCR：,一般,PCR,仅用一对引物，通过,PCR,扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。多重,PCR(multiplex PCR)，,又称多重引物,PCR,或复合,PCR，,它是在同一,PCR,反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的,PCR,反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般,PCR,相同。,18,多重,PCR,的用途主要有两方面：,1.,多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一,PCR,反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行,PCR,扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。,2.病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个突变部位，多重,PCR,可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等。,19,多重,PCR,的特点有,：,高效性，在同一,PCR,反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体,；,系统性，多重,PCR,很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检,；,经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息,。,20,免疫-,PCR：,免疫-,PCR(immuno-PCR),是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统。它利用抗原-抗体反应的特异性和,PCR,扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测。,21,免疫-,PCR,试验的主要步骤有三个：抗原-抗体反应，与嵌合连接分子结合，,PCR,扩增嵌合连接分子中的,DNA(,一般为质粒,DNA)。,该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备。在免疫-,PCR,中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒,DNA,结合，其基本原理与,ELISA,和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒,DNA，,在操作反应中形成抗原抗体-连接分子-,DNA,复合物，通过,PCR,扩增,DNA,来判断是否存在特异性抗原。,22,免疫,PCR,优点为：,特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上；,敏感度高，,PCR,具有惊人的扩增能力，免疫,PCR,比,ELISA,敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测；,操作简便，,PCR,扩增质粒,DNA,比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行。,23,