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StvacINV1负调控马铃薯的耐旱性.pdf

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资源描述

1、作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2023,49(11):30073016 http:/zwxb.chinacrops.org/ISSN 0496-3490;CN 11-1809/S;CODEN TSHPA9 E-mail: 本研究由国家自然科学基金项目(31860397,31360296),旱区作物逆境生物学国家重点实验室开放课题项目(CSBAAKF2018006)和甘肃省自然科学基金重点项目(22JR5RA228)资助。This study was supported by the National Natural Science Foundation of Chin

2、a(31860397,31360296),the Open Project of the State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas(CSBAAKF2018006),and the Key Program of Natural Science Foundation of Gansu Province(22JR5RA228).*通信作者(Corresponding author):巩慧玲,E-mail: Received(收稿日期):2023-01-18;Accepted(接受日期):2023-04-17;Publishe

3、d online(网络出版日期):2023-05-05.URL:https:/ This is an open access article under the CC BY-NC-ND license(http:/creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).DOI:10.3724/SP.J.1006.2023.34015 StvacINV1 负调控马铃薯的耐旱性 巩慧玲1,*林红霞1 任小丽1 李 彤1 王晨霞1 白江平2,3 1兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730050;2甘肃省干旱生境作物学重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点

4、实验室,甘肃兰州 730070;3甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070 摘 要:植物液泡酸性转化酶不可逆的催化蔗糖转化为葡萄糖和果糖,在植物的生长和发育及其逆境适应中扮演重要的角色。马铃薯液泡转化酶基因 StvacINV1 参与调控薯块的糖化,但其是否参与对干旱胁迫的调控尚不清楚。本研究以马铃薯品种Atlantic和Russet Burbank的 StvacINV1 RNA 干扰表达的转基因株系及其野生型为材料,采用停止浇水进行自然干旱处理,研究 StvacINV1 对马铃薯植株耐旱性的调控机制。结果表明干旱胁迫引起马铃薯叶片StvacINV1 的表达量及其液泡酸性转化酶活性显著降低;与

5、野生型相比,干旱胁迫下 StvacINV1 干扰效率高的转基因株系植株不易失水萎蔫、离体叶片的失水率低,MDA 含量低且叶片的相对水分含量高,由此表明 StvacINV1 干扰效率高的转基因株系的耐旱性高于野生型,即 StvacINV1 负调控马铃薯的耐旱性;进一步的分析表明,干旱胁迫下StvacINV1 干扰效率高的转基因株系的气孔开度和气孔导度显著低于野生型,水分利用率显著高于野生型,因此推测StvacINV1 可能通过介导气孔的关闭来调节马铃薯植株的耐旱性;干旱胁迫下 StvacINV1 干扰株系的蔗糖含量显著高于野生型,且外源高浓度蔗糖处理可诱导气孔的关闭,因此推测 StvacINV1

6、 可能通过其底物蔗糖参与调控气孔的关闭;外源 ABA 诱导的气孔关闭过程中,StvacINV1 干扰株系比野生型更敏感。综上所述,干旱胁迫下 StvacINV1 通过介导气孔的关闭负调控马铃薯植株的耐旱性,StvacINV1 可能通过其所催化的底物蔗糖参与调控气孔的关闭,StvacINV1 也参与 ABA 介导的气孔关闭。本研究为选育既耐糖化(块茎)又耐干旱的马铃薯品种提供理论依据。关键词:马铃薯;液泡酸性转化酶;耐旱性;气孔关闭 StvacINV1 negatively regulates drought tolerance in potato GONG Hui-Ling1,*,LIN Ho

7、ng-Xia1,REN Xiao-Li1,LI Tong1,WANG Chen-Xia1,and BAI Jiang-Ping2,3 1 School of Life Sciences and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,Gansu,China;2 Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science/Gansu Key Laboratory of Crop Improvement and Germplasm Enhancement,Lanzh

8、ou 730070,Gansu,China;3 College of Agronomy,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,Gansu,China Abstract:Plant vacuolar acid invertase catalyses irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose,which plays a vital role in plant growth,development,and abiotic stress adaption.The vacu

9、olar acid invertase gene StvacINV1 in potato(Solanum tuberosum L.)are involved in regulating cold-induced sweetening in tubers,however the physiological role of StvacINV1 during adaptation to drought stress conditions is not yet fully understood.To investigate the mechanism of StvacINV1 regulating d

10、rought toleration under natural drought stress(water was withheld),this experiment was conducted with potato cultivars Atlantic,Russet Burbank,and their StvacINV1-RNAi transgenic lines.The results showed that drought stress strongly reduced mRNA abundance of StvacINV1 and vacuolar acid invertase act

11、ivity in the leaves of the wild-type plants and StvacINV1-RNAi transgenic lines.Compared with the wild type,the transgenic lines with high interference efficiency of StvacINV1-RNAi were less prone to slower wilting,lower water loss,lower MDA content,and higher relative water content in leaves under

12、drought stress,which 3008 作 物 学 报 第 49 卷 indicated that the transgenic strains with high interference efficiency of StvacINV1 had higher drought tolerance than wild type.StvaclNV1 regulated negatively drought tolerance of potao.Further analysis showed that under drought stress,stomatal aperture and

13、stomatal conductance in highly interfered StvacINV1-RNAi transgenic lines were significantly lower than wild type,whereas water use efficiency was significantly higher,which demonstrated StvacINV1 might regulate the drought tolerance of potato plants by stomatal movement.Sucrose content in highly in

14、terfered StvacINV1-RNAi transgenic lines was significantly higher than wild type under drought stress,meanwhile the exogenous high concentration sucrose treatment can induce stomatal closure,which led us to speculate that StvacINV1 was involved in regulating stomatal closure through its catalytic su

15、bstrate sucrose.Compared with wild type,StvacINV1-RNAi transgenic lines were more sensitive during ABA-induced stomatal closure.In conclusion,StvacINV1 negatively regulated the drought tolerance by stomatal closure in potato plants,and StvacINV1 may be involved in regulating stomatal closure through

16、 its catalytic substrate sucrose,and StvacINV1 was involved in ABA-induced stomatal closure.This study provides a theoretical basis for breeding potato varieties resistant to both sweetening(tubers)and drought stress.Keywords:potato;vacuolar acid invertase;drought tolerance;stomatal closure 植物转化酶(in

17、vertase,INV,EC 3.2.1.26)是蔗糖代谢的关键酶,可以水解二糖中的-呋喃果糖苷键即不可逆的催化蔗糖分解为葡萄糖和果糖。根据转化酶的最适 pH、溶解性和亚细胞定位等差异,将转化酶分为酸性转化酶和中性/碱性转化酶 2 类,其中酸性转化酶可分为液泡酸性转化酶(vacuolar inver-tase,VIN)和细胞壁酸性转化酶(cell wall invertase,CWIN),而中性/碱性转化酶一般存在于细胞质、线粒体或质体中1。不同转化酶基因的表达具有组织器官和发育时期的特异性,还受低氧、糖、激素、生物和非生物胁迫等多种信号的转录水平的表达调控2,此外,酸性转化酶活性还受内源蛋白

18、抑制因子(proteinaceous inhibitor,INH)的翻译后水平的调控3。植物液泡酸性转化酶在催化蔗糖代谢的同时也参与了生长发育的调控,例如影响拟南芥植株的碳代谢4和根的延长5,参与棉花纤维的延长和种子发育的调控以及棉花的花器官建成以及雌蕊和雄蕊的育性5-6,参与番茄果实成熟7。此外,研究发现,玉米受干旱胁迫时,子房中的液泡酸性转化酶基因Ivr2 的表达水平下降8;与此相反,玉米叶片在中等程度的水分胁迫下会出现早期 VIN 活性增强的现象,并且伴随有 Ivr2 的表达上调和己糖的积累9。大多数马铃薯栽培品种的块茎在低温贮藏下 VIN 基因StvacINV1 的表达量及其酶活性均显

19、著增加10。马铃薯(Solanum tuberosum L.)是仅次于水稻、小麦和玉米的世界第四大粮食作物,属典型的温带气候作物,其对水分的亏缺十分敏感,水分短缺严重影响马铃薯的产量和品质11-13。马铃薯加工产品中油炸食品是最主要的部分,大约占马铃薯加工产业的 70%以上14。马铃薯炸片炸条等油炸食品的色泽与块茎还原糖(葡萄糖和果糖)含量密切相关,高温油炸过程中,还原糖与游离氨基酸发生非酶促褐变反应,即“美拉德反应”,造成高糖组织的褐化,并伴随产生潜在致癌物质丙烯酰胺15-17。因此,控制马铃薯块茎的还原糖含量是保证马铃薯炸片炸条的品质的重要途径。马铃薯块茎还原糖的异常积累一般受生长条件、贮

20、藏条件和遗传因素等的影响18。马铃薯块茎在低温贮藏期间,大多数栽培品种会发生还原糖积累即低温糖化10,15-17;马铃薯块茎膨大期的短期水分亏缺导致薯块的茎端还原糖含量增加即块茎末端糖化19,中度干旱和高温共同胁迫导致块茎末端糖化20;块茎在长期贮藏期间也会发生还原糖及其他可溶性糖的积累即衰老糖化21;以上这些低温糖化、末端糖化和衰老糖化均会引起块茎油炸产品的褐化和品质降低。研究发现,通过 RNA 干扰技术下调马铃薯 VIN 基因 StvacINV1 的表达而降低液泡酸性转化酶活性,转基因马铃薯块茎表现为耐受低温糖化15,22,同时,块茎末端糖化程度降低23且衰老糖化现象也被延迟24。由此表明

21、,StvacINV1是调控马铃薯块茎糖化现象的关键基因。此外,将马铃薯的酸性转化酶抑制蛋白基因 StInvInh2 或烟草酸性转化酶的抑制蛋白基因 Nt-inhh 在马铃薯中超表达,转基因马铃薯块茎酸性转化酶的活性降低,低温糖化现象受到显著抑制,炸片褐化现象显著低于野生型16,25-26;而将烟草酸性转化酶的抑制蛋白基因 Nt-inhh 在拟南芥液泡中超表达,导致液泡酸性转化酶活性降低,同时发现转基因拟南芥植株的叶片气孔开度降低,耐旱性增强27。同时,Yang 等28也发现,甘薯转化酶的抑制蛋白基因 IbINH 被超表达后,转基因甘薯植株耐旱性显著提高,而 IbINH被下调表达后,转基因甘薯耐

22、旱性降低。由此表明,植物酸性转化酶活性可能与植株的耐旱性相关。因此,我们推测 StvacINV1 除了参与调控马铃薯块茎的低温糖化、末端糖化和衰老糖化外,可能也参与调控马铃薯植株的耐旱性。马铃薯品种Atlantic的块茎呈卵圆形,生产中被用于加工薯片,而品种第11期 巩慧玲等:StvacINV1 负调控马铃薯的耐旱性 3009 Russet Burbank的块茎呈长圆型,生产上被用于加工薯条。为了探究 StvacINV1 在马铃薯植株的耐旱性中的功能,本研究以 StvacINV1 下调表达的转基因马铃薯品种Atlantic和Russet Burbank为材料,首先对其进行耐旱性评价,然后探讨

23、StvacINV1 调控马铃薯耐旱性的机制,从而为培育既耐糖化又耐干旱的马铃薯品种的选育提供理论依据。1 材料与方法 1.1 供试材料与培养 试验材料:马铃薯四倍体栽培品种Atlantic及其 StvacINV1 RNA 干扰株系 a-1、a-2 和 a-3,以及栽培品种Russet Burbank及其 StvacINV1 RNA 干扰株系 b-11、b-12 和 b-13,均由美国密歇根州立大学Jiming Jiang 教授实验室提供。培养条件:马铃薯组培苗在 MS 培养基中进行继代增殖培养,培养条件为光周期 16 h d1、光照强度 50 mol m2 s1、温度 232;待组培苗生长 4

24、周后,移栽至装有蛭石的花盆中,置于温室中培养,24 d 浇一次水,10 d 浇一次 Hoagland 营养液,生长50 d 后供试验使用。1.2 材料处理 1.2.1 干旱胁迫处理 马铃薯组培苗移栽至温室生长 50 d 后,停止浇水开始干旱胁迫处理,对照组正常浇水,观察植株表型变化并照相记录,Atlantic干旱胁迫 7 d 后,Russet Burbank干旱胁迫 10 d,在光照开始 4 h 后取倒 35叶片,直接测定生理生化指标,或液氮中速冻后保存在80冰箱中备用。1.2.2 外源蔗糖处理 将生长 3 周的马铃薯试管苗转至黑暗条件下进行暗饥饿处理(旨在除去保卫细胞中存在的储藏状态的糖类)

25、40 h,剪取暗处理后的叶片,在光照条件下于 MES-KCl 缓冲液漂浮处理2 h 使气孔充分打开,然后将叶片转移至 0.1、1、10、100 mmol L1的蔗糖溶液中,经过 2 h 的孵化后测定气孔开度29。1.2.3 外源 ABA 处理 剪取马铃薯移栽苗的倒35 叶片,置于盛有 MES-KCl 缓冲液的培养皿中,25光照 2 h 使气孔充分打开,然后将叶片转移至10 mol L1 ABA 中,分别在 0.5、1 和 2 h 后撕下叶片下表皮并制片,测量气孔开度29。1.3 测定指标与方法 1.3.1 离体叶片脱水率的测定 剪取温室中生长50 d 的马铃薯移栽苗叶片,立即称重并记录,之后放

26、置于温度为 25、湿度为 60%70%的植物培养室中使其失水,每隔1 h称重一次,共统计5 h,重复3次。以叶片离体时的重量为初始值,计算叶片失水率30。1.3.2 叶片相对含水量 参考田伟丽等31的方法,叶片相对含水量(%)=(Wf Wd)/(Wt Wd)100,式中,Wf:叶片鲜重(g);Wd:叶片干重(g);Wt:叶片饱水重(g)。1.3.3 丙二醛含量的测定 参考李合生32的方法即硫代巴比妥酸试剂测定丙二醛含量。1.3.4 气孔开度的测定 取经干旱、蔗糖和 ABA处理的马铃薯叶片,用透明胶带轻轻撕下叶片下表皮并制片,在光学显微镜下用 ImageJ 图像处理软件测量气孔的内纵径和内横径。

27、测量时,在 1030 倍下,随机选取78个视野,每个视野随机选34个气孔,重复 3 次。气孔开度以气孔的内纵横径之比表示,即横径/纵径29。1.3.5 气孔导度和水分利用率的测定 待马铃薯盆栽苗生长 50 d,选择从顶叶往下数的第 35 片叶,测定气孔导度和水分利用率。使用便携式光合仪在CO2浓度为 400 L L1和光合有效辐射(PAR)为 1000 mol m2 s1的 光 照 下 测 定,测 定 时 间 为09:0011:00,每个处理测定 8 片叶31。1.3.6 蔗糖含量的测定 参考肖世远33的方法即间苯二酚试剂测定蔗糖的含量。1.3.7 液泡酸性转化酶活性的测定 称取 0.5 g叶

28、片组织,在 2 mL 抽提缓冲液(30 mmol L1 MOPS,250 mmol L1 Sorbitol,10 mmol L1 MgCl2,10 mmol L1 KCl,1 mmol L1 PMSF)中研磨成匀浆(4下操作),在 4、6000g 离心 10 min。吸取全部上清液,然后取 50 L 上清加入到 600 L 反应缓冲液(30 mmol L1 NaAc(pH 4.7),30 mmol L1蔗糖)中37下反应 1 h,再加入 1000 L DNS 溶液,沸水浴反应 5 min。冷却后在波长 540 nm 处测定吸光值25。1.3.8 基因表达量的测定 采用 TRIzol 试剂盒(T

29、aKaRa 公司)进行 RNA 提取,反转录为 cDNA,稀释后用 TB Green Premix Ex Taq II(TliRNAaseH Plus)(TaKaRa 公司)试剂盒在荧光定量 PCR 仪(Bio-Rad,美国)上进行qPCR。qPCR体系20 L,包含TB Green PreMix Ex Taq II 10 L、上下游引物各 0.8 L、cDNA 4 L、dd H2O 4.4 L。反应程序:95 30 s;95 5 s,60 30 s,40个循环。以 ef1-作为内参基因,基因表达量用 2Ct计算23。qPCR 引物序列见表 1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。3010

30、 作 物 学 报 第 49 卷 表 1 试验所用的引物序列 Table 1 Primer sequences used in the study 基因名称 Gene name 正向引物 Forward primer(53)反向引物 Reverse primer(53)ef1-CAAGGATGACCCAGCCAAG TTCCTTACCTGAACGCCTGT StvacINV1 GGTACGATATTAACGGTGTCTGG AGAAGGAGAGGATCAGATAAG 1.4 数据处理与统计分析 利用 Microsoft Excel 2016 软件进行数据处理和作图;采用 SPSS19.0 统计软

31、件对数据进行单因素方差分析,运用 Duncans 检验法对显著性差异(P0.05)进行多重比较,所有数据用平均值标准误(mean SE)表示。2 结果与分析 2.1 马铃薯 StvacINV1 干扰株系的鉴定 对本研究中所使用的马铃薯 StvacINV1 RNA 干扰株系 StvacINV1 的表达水平和 VIN 活性进行检测,如图 1 所示,正常生长条件下,品种Atlantic的 3 个StvacINV1 干扰株系 ai-1、ai-2 和 ai-3 的 StvacINV1 mRNA 表达量分别较 WT 下调 13.6%、45.7%和52.6%,而其 VIN 活性较野生型(WT)分别下调9.2

32、%、22.4%和 23.1%,3 个干扰株系的 StvacINV1 表达量和 VIN 活性均与野生型差异显著;品种Russet Burbank的 3 个 StvacINV1 干扰株系 bi-11、bi-12 和bi-13 的 StvacINV1 mRNA 表达量分别较 WT 下调5.2%、34.2%和 61.0%,而其 VIN 活性较 WT 分别下调 10.5%、34.4%和 42.3%(图 1)。说明马铃薯品种Atlantic的 ai-2、ai-3 株系和品种Russet Bur-bankbi-12、bi-13 株系是 StvacINV1 干扰率较高的株系,而品种Atlantic的 ai-1

33、 株系和品种Russet Burbankbi-11 株系的是 StvacINV1 干扰率较低的株系;马铃薯 StvacINV1 下调表达降低了 VIN 的活性,2 个品种的 StvacINV1 各干扰株系的 VIN 的活性与其野生型均差异显著。2.2 干旱胁迫抑制马铃薯 StvacINV1 的表达水平和 VIN 活性 干旱胁迫后,品种Atlantic WT 和 StvacINV1 干扰株系的StvacINV1 mRNA表达量和酶活性均明显下降,其中 WT 和干扰株系 ai-1、ai-2、ai-3 的 StvacINV1 mRNA 表达量比胁迫前分别降低 73.2%、76.2%、79.5%和 5

34、2.6%;各干扰株系的 StvacINV1 mRNA 和VIN 活性显著低于野生型,其中 ai-1、ai-2、ai-3 株系的 StvacINV1 mRNA 表达量比野生型低 23.1%、58.4%和 69.3%,而 VIN 活性比野生型低 10.5%、34.4%、43.3%。对于品种Russet Burbank,干旱胁迫导致 WT和各干扰株系的StvacINV1 mRNA表达量和VIN活性均显著下降,且干扰株系的 StvacINV1 mRNA 和 VIN活性显著低于野生型,这与品种Atlantic对干旱胁迫的响应相似,即干旱胁迫引起 StvacINV1 mRNA 表达量及其 VIN 活性下降

35、,且干旱胁迫下 2 个品种的StvacINV1 干扰株系的 StvacINV1 mRNA 和 VIN 活性均显著低于其野生型(图 1)。图 1 野生型和 StvacINV1 干扰株系干旱处理前后 StvacINV1 表达量(A)和液泡酸性转化酶活性(B)Fig.1 StvacINV1 relative expression level(A)and vacuolar acid invertase(VIN)activity(B)in the WT and StvacINV1 RNA inter-ference lines under normal or drought conditions *:P

36、 0.05.第11期 巩慧玲等:StvacINV1 负调控马铃薯的耐旱性 3011 2.3 StvacINV1 下调表达增强了马铃薯植株的耐旱性 为了解 StvacINV1 下调表达后对马铃薯耐旱能力的影响,马铃薯 2 个品种Atlantic和Russet Bur-bank的野生型及其 StvacINV1 RNA 干扰株系在干旱胁迫前后的生理生化指标如植株形态、离体叶片失水率、相对含水量和 MDA 含量被测定和分析。正常浇水条件下,马铃薯品种Atlantic和Russet Bur-bank的野生型及其各干扰株系的生长状态无明显差异。对于品种Atlantic,停止浇水进行自然干旱处理 7 d 后

37、,叶片开始失绿变黄,野生型叶片的失绿变黄现象最为明显;经干旱处理 9 d 后,野生型和 ai-1株系植株均出现明显的倒伏、叶片失水萎蔫和卷曲,而 ai-2 和 ai-3 株系叶片仅表现极轻微的萎蔫现象。对于品种Russet Burbank,在干旱处理 10 d 时,叶片开始失绿变黄,野生型和 bi-11 株系的叶片失绿变黄现象最明显,在干旱处理 14 d 时,野生型、bi-11和 bi-12 株系的植株叶片失水萎蔫和卷曲现象较明显,而 bi-13 株系仅表现轻微的萎蔫(图 2-A)。干旱胁迫后,Atlantic的3个干扰株系的相对水分含量显著高于野生型,且干扰率较高的2个株系ai-2和ai-3

38、的丙二醛含量显著低于野生型;Russet Burbank的StvacINV1 干扰率较高的 2 个株系 bi-12 和 bi-13 的相对水分含量显著高于其野生型,且其丙二醛含量也显著低于野生型(图 2-B,C)。品种Atlantic和Russet Burbank StvacINV1 各干扰株系离体叶片的失水率均低于其野生型,即 StvacINV1 各干扰株系的离体叶片失水速率减缓。综上,通过比较 2 个马铃薯品种的野生型及其 StvacINV1 RNA 干扰株系在干旱胁迫前后的植株形态、离体叶片失水率、相对含水量和 MDA 含量,均发现干旱胁迫后 StvacINV1干扰率较高的干扰株系,受干

39、旱胁迫的伤害程度较低,即耐旱性高于其野生型(图 2-D,E)。表明StvacINV1 参与对马铃薯耐旱性的负调控。2.4 StvacINV1 下调表达降低干旱胁迫下气孔开度,提高水分利用率 气孔调节是控制植物水分系统的一种主要机制,当植物突然遭受干旱时,最重要的快速响应是气孔关闭34。为了探讨 StvacINV1 下调表达后马铃薯植株耐旱性提高的原因,气孔开度、气孔导度和水分利用率等气孔相关的参数被检测。干旱胁迫引起 2个品种Atlantic和Russet Burbank的野生型及其StvacINV1 各干扰株系的叶片气孔开度和气孔导度降低,且 StvacINV1 干扰率较高的株系 ai-2、

40、ai-3、bi-12 和 bi-13 的叶片气孔开度和气孔导度均显著低于其相应的野生型(图 3-A,B)。干旱胁迫后,Atlan-tic 和 Russet Burbank 两 品 种 的 野 生 型 及 其StvacINV1 各干扰株系的水分利用率显著上升,且StvacINV1干扰率较高的株系ai-2、ai-3、bi-12和bi-13的叶片水分利用率均显著高于其野生型(图 3-C)。综上,在干旱胁迫下,StvacINV1 干扰率较高的转基因株系,气孔开度和气孔导度显著低于其野生型,且水分利用率显著高于其野生型。说明 StvacINV1 可能介导气孔的运动,影响水分利用率,从而调控植株的耐旱性。

41、2.5 StvacINV1 的下调表达增加干旱胁迫下蔗糖含量,高浓度蔗糖诱导气孔关闭 为了探讨马铃薯 StvacINV1 干扰株系在干旱胁迫后气孔开度显著低于野生型的原因,测定了StvacINV1 所催化的底物即蔗糖的含量,并用外源蔗糖处理检测其对气孔开度的影响。干旱处理后品种 Atlantic 和 Russet Burbank 的 野 生 型 及 其StvacINV1 各干扰株系的蔗糖含量明显上升,且StvacINV1 干扰株系的蔗糖含量均显著高于其相应的野生型(图 4)。不同浓度的外源蔗糖处理对马铃薯叶片气孔开度的影响不同,低浓度的蔗糖处理(0.1 mmol L1,1 mmol L1)并不

42、影响气孔开度,而高浓度蔗糖处理(10 mmol L1,100 mmol L1)显著降低了气孔开度,且 100 mmol L1蔗糖处理下的气孔开度小于 10 mmol L1蔗糖处理(图 5)。因此,我们推测,干旱胁迫下 StvacINV1 下调表达引起其所催化的底物蔗糖含量增加,而高浓度蔗糖引起气孔关闭。2.6 StvacINV1 参与 ABA 介导的气孔关闭 为了探讨 StvacINV1 是否参与 ABA 诱导的气孔 关 闭,用 外 源 10 mol L1 ABA 处 理 品 种Atlantic野生型和干扰株系 ai-1、ai-3 的离体叶片,检测气孔开度的变化。由图 6 可知,随着 ABA

43、处理时间的延长,气孔开度逐渐降低,且干扰株系ai-1 和 ai-3 的气孔开度显著小于野生型,即干扰株系对 ABA 处理更敏感。说明 StvacINV1 参与 ABA介导的气孔关闭。3012 作 物 学 报 第 49 卷 图 2 野生型和 StvacINV1 干扰株系干旱处理前后的植株形态(A)、叶片相对水分含量(B)、丙二醛含量(C)和失水率(D 和 E)Fig.2 Plant morphology(A),relative water content(B),MDA content(C),fresh weight loss(D and E)of leaves in the WT and Stv

44、acINV1 RNA interference lines under normal or drought conditions*:P0.05.第11期 巩慧玲等:StvacINV1 负调控马铃薯的耐旱性 3013 图 3 野生型和 StvacINV1 干扰株系干旱处理前后的气孔开度(A)、气孔导度(B)和水分利用率(C)Fig.3 Stomatal aperture(A),stomatal conductance(B),and water use efficiency(WUE)(C)of leaves in the WT and StvacINV1 RNA interference line

45、s under normal or drought conditions*:P 0.05.图 4 野生型和 StvacINV1 干扰株系干旱处理前后的蔗糖含量 Fig.4 Sucrose content of leaves in the WT and StvacINV1 RNA plants under normal or drought conditions*:P 0.05.图 5 蔗糖处理对马铃薯气孔开度的影响 Fig.5 Effect of sucrose treatments on potato stomatal apear-ture*:P 0.05.图 6 ABA 处理对马铃薯气孔开

46、度的影响 Fig.6 Effect of ABA treatments on potato stomatal aperture*:P 0.05.3 讨论 植物液泡酸性转化酶在植物的生长和发育及其逆境适应中发挥着重要的作用。马铃薯液泡转化酶基因 StvacINV1 下调表达的转基因株系,在正常生长条件下其植株表型和块茎产量与野生型相比均没 有显著的差异,但其块茎的品质性状却产生了显著的改善,如块茎低温糖化、衰老糖化和末端糖化现象均显著降低或减缓15,22-24。本研究表明,StvacINV1下调表达的马铃薯转基因株系的耐旱性显著高于野生型,即 StvacINV1 负调控马铃薯的耐旱性。因此,30

47、14 作 物 学 报 第 49 卷 StvacINV1 可作为选育既耐糖化又耐干旱的马铃薯品种的标记基因。3.1 干旱胁迫抑制 StvacINV1 的表达 植物液泡酸性转化酶基因响应干旱、缺氧和低温等非生物胁迫,也具有组织、器官特异性。Ahiakpa等34发现,番茄在干旱胁迫下,不同器官中液泡酸性转化酶基因 SlvacVIN9 的表达量差异显著,根和叶片的 SlvacVIN9 受干旱胁迫的诱导表达,而花和茎 SlvacVIN9 的表达受干旱胁迫的抑制,而 Albacete等35却发现,干旱胁迫下番茄叶片液泡酸性转化酶活性下降。在马铃薯中,液泡酸性转化酶基因 StVIN在花、叶和块茎等不同组织中

48、的表达量差异显著,且在高温、盐和干旱胁迫下的表达量显著高于其他转化酶基因36。本研究中,干旱胁迫引起马铃薯 2个品种Atlantic和Russet Burbank的野生型及其StvacINV1 各干扰株系叶片的 StvacINV1 mRNA 表达量不同程度的下降,其液泡酸性转化酶的活性也随之降低。液泡酸性转化酶除了受转录水平的调控外,也受酸性转化酶抑制蛋白等翻译后水平的调控,研究发现,甘薯、番茄的酸性转化酶抑制蛋白基因的表达受干旱胁迫的诱导表达28,35。本研究发现,干旱胁迫下,马铃薯 2 个品种Atlantic和Russet Bur-bank的野生型及其StvacINV1干扰株系的Stvac

49、INV1 mRNA 表达量下调的幅度与液泡酸性转化酶活性降低的幅度差异很大(图 1),由此暗示,马铃薯酸性转化酶抑制蛋白基因的表达也响应干旱胁迫,从而调控液泡转化酶活性。3.2 StvacINV1 负调控马铃薯的耐旱性 在拟南芥和甘薯等植物中发现,液泡酸性转化酶的活性与植物的耐旱性之间有一定关联。在拟南芥中,将烟草酸性转化酶的抑制蛋白基因 Nt-inhh 连接上 AtRab18 基因(ABA 敏感及保卫细胞特异启动子)超表达后,液泡酸性转化酶的活性降低,同时也发现转基因植株的耐旱性增强27;此外,在甘薯中,超表达酸性转化酶抑制蛋白基因 IbINH 后,转基因植株的耐旱性也显著提高28。本研究也

50、发现与此相同的结果,通过 RNA 干扰技术下调马铃薯 2 个品种Atlantic和Russet Burbank的 StvacINV1 的表达量,液泡酸性转化酶的活性随之降低(图 1),转基因马铃薯植株的耐旱性高于野生型(图 2),由此表明,液泡酸性转化酶基因 StvacINV1 负调控马铃薯的耐旱性。但是,将红叶藜的细胞壁转化酶基因CIN1在番茄中超表达后,转基因番茄的耐旱性增加,即 CIN1 正调控植物的耐旱性35。马铃薯液泡酸性转化酶基因StvacINV1 与红叶藜细胞壁酸性转化酶基因 CIN1 分别正调控和负调控植物的耐旱性,因而,液泡酸性转化酶基因与细胞壁酸性转化酶基因在耐旱性中的功能

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