北美栅锈菌和松杨栅锈菌可视化检测体系建立.pdf

DOI:10.12403/j.1001-1498.20220420北美栅锈菌和松杨栅锈菌可视化检测体系建立蓝燕，农花萍，彭子嘉，陆颖，李坤蓬，徐勇，余仲东*(西北农林科技大学林学院，陕西杨凌712100)摘要：目的 为实现北美栅锈菌和松杨栅锈菌快速有效的鉴别及鉴定。方法 本研究根据两种锈菌的28SrDNA 基因序列设计若干组 LAMP 引物。经筛选得到的引物以北美栅锈菌、松杨栅锈菌、图拉斯叉钩丝壳菌、芍药白粉菌、梨胶锈菌、羊肚菌、金针菇的基因组 DNA 为模板进行 LAMP 反应并完成特异性检测；首先建立初始 LAMP 反应体系，再进一步优化 LAMP 反应体系的组分和反应条件，加入羟基萘酚蓝实现可视化检测；最后确定检测体系灵敏度。结果 表明，筛选出的引物具有特异性；25L 北美栅锈菌 LAMP 检测体系最佳 Mg2浓度为 6mmolL1，最佳内外引物比例为 8：1，最佳 dNTPs 浓度为 1.2mmolL1；同样地，25L 松杨栅锈菌 LAMP 检测体系最佳 Mg2浓度为 4mmolL1，最佳内外引物比例为 6：1，最佳 dNTPs 浓度为 1mmolL1。加入 160M 羟基萘酚蓝（HNB）可清晰地指示反应结果，两种检测体系在 61 条件下，分别反应 30min 和 40min 可实现目视判断结果，且灵敏度分别可达 34fgL1和 60fgL1。结论 通过建立两种锈菌的可视化 LAMP-HNB 检测体系可实现对北美栅锈菌和松杨栅锈菌进行区分及鉴定，为快速鉴定和区分重要杨树锈病提供了技术支撑和实践参考。关键词：杨树；北美栅锈菌；松杨栅锈菌；环介导等温扩增技术；羟基萘酚蓝中图分类号：S763.15文献标识码：A文章编号：1001-1498(2023)05-0140-09杨 树 是 杨 柳 科（Salicaceae Mirb.）杨 属（PopulusL.）多年生落叶乔木，因其速生成林、防风固沙、抗逆性强、木材质佳等优势，成为我国用材林、防护林主要造林树种之一1。我国杨树栽培规模不断扩大，但受限于栽培技术和杨树病虫害的日益频发。杨树叶锈病是一种严重的叶部病害，导致杨树的生长量和材积严重降低，造成杨树人工林巨大经济损失2。杨树叶锈病的病原菌多为栅锈菌属（MelampsoraCastagne）锈菌。北美栅锈菌（Melampsora medusaeThmen.）原寄主为北美 洲 东 部 的 美 洲 黑 杨（Populus deltoides W.BartramexMarshall），后逐渐传播至世界各地，是印度、欧洲、日本等国家和地区的检疫性有害生物3，也是我国最近发现的外来入侵种，危害极大，并有持续传播的趋势4。该种与我国本土流行种 松 杨 栅 锈 菌（Melampsora larici-populinaKleb.）在形态、寄主谱范围等方面高度相似，给杨树叶锈病的检验检疫带来了实际困难，因此亟待建立一种快速准确的杨树叶锈病检测技术。目前林木真菌病原检测方法主要包括传统检测法和分子生物学法。传统检测法多为形态观察，较为直观但对一线检疫人员的要求较高。如形态结构相似的同属不同种真菌，往往需要扫描电子显微镜（SEM）才能实现有效辨别；同种病原菌在不同时期或不同生长条件下也会表现出不同的形态特征等。因此，对新病原菌或疑难种病原菌进行物种水平的辨别常常有困难。分子生物学法中广泛使用的收稿日期：2022-08-24修回日期：2022-09-09基金项目：国家自然科学基金（31670650）；大学生创新创业训练计划项目（X202110712224）*通讯作者:余仲东，博士，教授，主要研究方向：森林病理学、林业微生物学E-mail：2023，36（5）：140-148林业科学研究http:/Forest Research常规 PCR 及以常规 PCR 为基础建立的多重 PCR、实时荧光 PCR 等技术特异性强，检出率高，但依赖昂贵的仪器，耗时较长，且需要专业的技术人员进行操作5-7。因此，以上两种方法很难满足目前生产实践中快速准确检测的需求。环 介 导 等 温 扩 增 技 术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是 Notomi 等人在 2000 年建立的一种恒温核酸扩增技术，在恒定温度下，利用 46 条引物及 BstDNA 聚合酶对模板进行扩增，经 3060min 可将微量模板扩增109倍8-9。LAMP 结果检测方法多样化，除了琼脂糖凝胶电泳外，目前常用的方法还有浊度法、显色法、实时荧光法等，这些方法可以实现闭管检测，从而降低污染概率10-11。LAMP 具特异性好、灵敏度高、反应速度快和操作简易便捷等特点，应用前景广阔12-14，在林业病害检测方面已有许多报道15-16。另外，LAMP 还广泛应用于医学17-18、农业19-20、食品21-22等行业。本研究以北美栅锈菌和松杨栅锈菌为研究对象，根据 LAMP 的反应原理，针对两种不同锈菌的靶标序列分别设计了多组引物。经实验初步筛选引物后，再以北美栅锈菌（M.medusae）、松杨栅锈菌（M.larici-populina）、图拉斯叉钩丝壳菌（Sawadaia tulasnei(Fuck.)Homma）、芍药白粉菌（Erysiphe paeoniaeZhengCheng）、梨胶锈菌（Gymnosporangium asiaticumMiyabeexYamada）、羊 肚 菌（Morchella esculenta(L.)Pers.）、金 针 菇（Flammulina velutipes(Curt.:Fri.)Sing）的基因组 DNA 为模板进行特异性检测，后续进行体系优化、反应条件优化、灵敏度检测等研究，并结合羟基萘酚蓝（HNB）建立LAMP-HNB 可视化检测体系，以期为松杨栅锈菌和北美栅锈菌的快速、准确的鉴别及鉴定提供技术支撑。1材料与方法1.1材料与试剂供试北美栅锈菌（M.medusae）、松杨栅锈菌（M.larici-populina）、羊肚菌（M.esculenta）、金针菇（F.velutipes），菌株由西北农林科技大学森林病理学实验室保存并提供，其余参考菌株包括图拉斯叉钩丝壳菌（S.tulasnei）、芍药白粉菌（E.paeoniae）、梨胶锈菌（G.asiaticum）均采自西北农林科技大学南校区内感病植株。等温扩增试剂盒、引物均购于生工生物（上海）股份有限公司；BstDNA 聚合酶购于 NEB（北京）公司；羟基萘酚蓝购于上海麦克林生化科技有限公司；dNTPs 购于宝日医（大连）公司。1.2试验方法1.2.1CTAB 法提取真菌基因组 DNA将 CTAB缓冲液置于 65 水浴锅中充分裂解。向盛有样品的离心管中加入 500LCTAB 缓冲液，添加适量石英砂充分研磨，再加入 2L 巯基乙醇，置于恒温孵育器中 65 保温 1h，每 10min 颠倒均匀一次。保温结束后加入 500LDNA 提取液（氯仿 异 戊 醇=241），室 温 离 心 11 000 rpm，10min，2 次。取上清液，加入 2 倍体积无水乙醇，上下颠倒均匀，20 保存 23h 后取出，室温离心 11000rpm，10min。弃上清液，加入75%乙 醇 750 L，再 室 温 离 心 12 000 rpm，10min，2 次，弃上清液，于超净工作台吹干后加入 50LTE 缓冲液，于20 保存，备用。1.2.2LAMP 引物设计与筛选在 NCBI 上获取M.medusae 和 M.larici-populina 的 28SrDNA 基因序列。根据两种菌的 28srDNA 序列，利用在线LAMP 引物设计工具（PrimerExplorerV5）分别设计多组引物，以 dimer 值、引物两端自由能为依据初步选出若干组引物（每组引物包括两条内引物：FIP、BIP，两条外引物：F3、B3），送至生工生物（上海）股份有限公司合成。根据研究目的，需确保引物在 M.medusae与 M.larici-populina 之间不发生交叉反应，因此需要 对 引 物 进 一 步 筛 选。每 组 引 物 分 别 以 M.medusae、M.larici-populina 基因组 DNA 为模板进行 LAMP 扩增反应。参考厂家等温扩增试剂盒说明书建立反应体系。25L 体系包括 12.5LLAMPMasterMix、2LFIP、2LBIP、0.5LF3、0.5 L B3、2 L 模 板 DNA、0.5 L BstDNA 聚合酶，最后 ddH2O 补至 25L。在冰上将各组分置于 PCR 管中并涡旋混匀，反应条件为65 水浴 60min 后 80 水浴 10min。反应结束后取 7L 产物进行 1.5琼脂糖凝胶电泳检测。通过观察 LAMP 梯状条带，选出仅扩增 M.medusae 或 M.larici-populina 基因组 DNA 的引物进行后续特异性检测。1.2.3引物特异性检测在北美栅锈菌引物特异第5期蓝燕，等：北美栅锈菌和松杨栅锈菌可视化检测体系建立141性检测中，同时以提取的松杨栅锈菌、芍药白粉菌、图拉斯叉钩丝壳菌、梨胶锈菌、羊肚菌、金针菇基因组 DNA 为模板进行 LAMP 扩增反应；同样地，松杨栅锈菌引物特异性检测中，同时以提取的北美栅锈菌及上述菌种基因组 DNA 为模板进行LAMP 扩增反应；两组试验均以 ddH2O 为空白对照。反应体系和条件同 1.2.2。反应结束后取 7L产物在 1.5琼脂糖进行凝胶电泳。通过观察LAMP 梯状条带判断 LAMP 方法的特异性。1.2.4反应体系建立参考 NEB 公司的 BstDNA聚合酶使用说明书建立初始反应体系（表 1）。表1初始反应体系Table1Initialreactionsystem组分及浓度ComponentsandConcentrations体积Volume/L10Buffer2.5Mg2（100mmolL1）1.5dNTPs（10mmolL1each）3.5FIP（10molL1）4.0BIP（10molL1）4.0F3（10molL1）0.5B3（10molL1）0.5模板template1.5BstDNA聚合酶BstDNApolymerase（8000UmL1）0.5ddH2O补至25L在冰上将各组分置于 PCR 管中并涡旋混匀，反应条件为65 水浴60min 后80 水浴10min。在初始反应体系和条件的基础上，按表 2 设置的梯度依次对 Mg2、内外引物比例、dNTPs 进行单因素优化，同时以 ddH2O 为空白对照，反应结束后取 7L 产物进行 1.5琼脂糖凝胶电泳检测。根据 LAMP 梯状条带的有无以及清晰度确定最佳浓度及比例。在优化后的体系中加入 2L 羟基萘酚蓝（2mmolL1）指 示 LAMP 反 应 的 结 果。同 时 以ddH2O 为空白对照，通过目视溶液颜色，判断是否发生反应（阳性为蓝色，阴性为紫色），反应结束后取 7L 产物进行 1.5琼脂糖凝胶电泳检测，观察羟基萘酚蓝的指示效果。1.2.5反应条件优化在组分优化后的体系中加入羟基萘酚蓝为显色剂，并依次进行温度和时间的优化。初始反应温度为 65，初始反应时间为 60min。优化反应温度时，反应时间为初始反应时间，温度梯度设置如表 3 所示；优化反应时间时，以上一步得出的优化温度作为反应温度，时间梯度设置如表 3 所示。以 ddH2O 为空白对照，筛选出颜色分化时对应的最低反应温度和最短反应时间，从而进一步优化反应条件。表3条件梯度Table3Conditionalgradient因素Factor梯度Gradient温度Temperature/61、63、65、67时间Time/min30、40、50、601.2.6灵敏度检测M.medusae 和 M.larici-populina 基因组 DNA 经浓度测定后进行 10 倍浓度的梯度稀释，在优化后的体系和反应条件中进行反应。同时以 ddH2O 为空白对照，观察反应后的溶液颜色以判断最低检测浓度。2结果与分析2.1引物筛选通过在线引物设计软件共设计了 12 组引物，经过初步筛选，得到 M.medusae 引物 BM、BM、BM、BM以及 M.larici-populina 引物SY、SY、SY。进一步的引物筛选结果如图 1 所示。图 1-A 显示 M.medusae 的 4 组引物中，BM所属的电泳道中仅以 M.larici-populina基因组 DNA 为模板进行 LAMP反应时出现梯状条带，表明 BM无法扩增目标菌；BM和 BM所属的电泳道均出现了梯状条带，表明这两组引物既能以 M.medusae 基因组 DNA 为模板进行扩增，又能以 M.larici-populina基因组 DNA 为模板进行扩增，因此不具有特异性；BM所属的两个电泳道中，仅以 M.medusae基因组 DNA 为模板进行表2组分梯度Table2componentgradient因素Factor梯度GradientMg2浓度Mg2+concentration/（mmolL1）2、4、6、8、10内外引物比例ratioofinternaltoexternalprimer1:1、2:1、4:1、6:1、8:1、10:1dNTPs浓度dNTPsconcentration/（mmolL1）1、1.2、1.4142林业科学研究第36卷LAMP 反应时出现了梯状条带。因此，4 组引物中只有 BM能够特异性扩增 M.medusae。图 1-B 显示 M.larici-populina的 3 组引物中，SY所属的电泳道中仅以 M.medusae 基因组 DNA 为模板进行 LAMP 反应时出现梯状条带，表明 SY不能扩增目标菌；SY所属的两个电泳道中，仅以M.larici-populina 基因组 DNA 为模板进行 LAMP反应时出现了梯状条带；SY所属的两个电泳道中均无梯状条带，表明 SY发生无效扩增；因此，3 组引物中只有 SY能够特异性扩增 M.larici-populina。综上，仅 BM和 SY能够有效区分 M.medusae 和 M.larici-populina，因此可用于建立 LAMP 检测体系。二者序列如表 4 所示。AB87654321M2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp654321M注：A：M.medusae 引物筛选；B：M.larici-populina 引物筛选 A：引物：1、5 泳道：BM，2、6 泳道：BM，3、7 泳道：BM，4、8 泳道：BM；DNA：泳道 14：M.medusae，泳道 58：M.larici-populina；B：引物：1、4 泳道：SY；2、5 泳道：SY；3、6 泳道：SY；DNA：泳道 13：M.medusae，泳道 46：M.larici-populina；M：DL2000DNAMarkerNotes：A,PrimerselectionforM.medusae;B,PrimerselectionforM.larici-populinaA:Lane1、5,PrimerBM;Lane2、6,primerBM;Lane3、7,primerBM;Lane4、8,primerBM;DNA,Lane14,M.medusae;Lane58,M.larici-populina;B:Lane1、4,primerSY;Lane2、5,primerSY;Lane3、6,primerSY;DNA,Lane:13,M.medusae;Lane46,M.larici-populina;M,DLMarker2000图1供试引物筛选Fig.1Testedprimersselection表4特异性引物序列Table4Specificprimersequences编号No.引物名称Primername引物序列PrimersequencesBMF3AGCAAGTCAACATCAGTCTB3CTAATACTCGCAAGCATGTFIPTCGAGGTCCCAAGCTATAACAGAGTGTTGGAAAAAGGGCBIPGTTCGAAAGAGCCTCCTTACTCTTGGTCCGTGTTTCAAGSYF3AAGCTTTGAGCGGATTCGAB3AATGATCCAGACTGGTCGAFIPCCGTGTTTCAAGACGGGTCGGATCTCCTTACTATGGATGTTGGBIPACCAAGGAGTCTAACATGCTTGCGGATCACATCTGAAATTCACT2.2引物特异性检测图 2-A 显示，BM只有以 M.medusae 基因组 DNA 为模板进行 LAMP 扩增时出现了典型的梯状 条 带，M.larici-populina、E.paeoniae、S.tulasnei 等菌株以及空白对照均未出现梯状条带；图 2-B 显示，SY只有以 M.larici-populina 基因组 DNA 为模板进行 LAMP 扩增时出现了典型的梯状条带，M.medusae、E.paeoniae、S.tulasnei等菌株以及空白对照均未出现梯状条带。综上，BM和 SY具备特异性扩增目标菌的能力。2.3反应体系建立图 3-A 第 3 泳道、图 3-B 第 5 泳道、图 3-C第 2 泳道梯状条带最为清晰明亮，因此确定 25LM.medusae 体系最佳 Mg2浓度为 6mmolL1，最佳内外引物比例为 8：1，最佳 dNTPs 浓度为1.2mmolL1；图 3-D 第 2 泳道、图 3-E 第 4 泳第5期蓝燕，等：北美栅锈菌和松杨栅锈菌可视化检测体系建立143A7654321MN7654321MNB2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp注：A：BM特异性检测；B：SY特异性检测 A：泳道 17：M.medusae、M.larici-populina、E.paeoniae、S.tulasnei、G.asiaticum、M.esculenta、F.velutipes；B：泳 道 1 7：M.larici-populina、M.medusae、E.paeoniae、S.tulasnei、G.asiaticum、M.esculenta、F.velutipes；M：DLMarker2000；N：空白对照Notes:A,SpecificitydetectionforBM;B,SpecificitydetectionforSYA,Lane17,M.medusae,M.larici-populina,E.paeoniae,S.tulasnei,G.asiaticum,M.esculenta,F.velutipes;B,Lane17,M.larici-populina,M.medusae,E.paeoniae,S.tulasnei,G.asiaticum,M.esculenta,F.velutipes;M,DLMarker2000;N,theblank图2引物特异性检测Fig.2Primer-specificdetectionsADEFBC54321MN564321MN54321MN564321M321MNN321MN2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp注：A：M.medusaeMg2浓度优化；B：M.medusae 内外引物比例优化；C：M.medusaedNTPs 浓度优化；D：M.larici-populinaMg2浓度优化；E：M.larici-populina 内外引物比例优化；F：M.larici-populinadNTPs 浓度优化；A、D：泳道 15 的 Mg2浓度：2mmolL1，4mmolL1，6mmolL1，8mmolL1，10mmolL1；B、E：泳道 16 的内外引物比例：1：1，2：1，4：1，6：1；8：1；10：1；C、F：泳道的13dNTPs 浓度：1mmolL1，1.2mmolL1，1.4mmolL1;M：DLMarker2000；N：空白对照Notes:A:OptimizationofMg2+concentrationforLAMPsystemofM.medusae;B:OptimizationofratioofinternalprimertoexternalprimerforLAMPsystemofM.medusae;C:OptimizationofdNTPsconcentrationforLAMPsystemofM.medusae;D:OptimizationofMg2+concentrationforLAMP system of M.larici-populina;E:Optimization of ratio of internal primer to external primer for LAMP system of M.larici-populina;F:OptimizationofdNTPsconcentrationforLAMPsystemofM.larici-populina;A、D:Lane15Mg2+concentration:2mmolL1,4mmolL1,6mmolL1,8mmolL1,10mmolL1;B、E:Lane16ratioofinternalprimertoexternalprimer:1:1,2:1,4:1,6:1,8:1,10:1;C、F:Lane13dNTPsconcentration,1mmolL1,1.2mmolL1,1.4mmolL1;M,DLMarker2000;N,theblank图3反应体系优化Fig.3Reactionsystemoptimization144林业科学研究第36卷道、图 3-F 第 1 泳道中梯状条带最为清晰明亮，因此确定 25LM.larici-populina 体系最佳 Mg2浓度为 4mmolL1，最佳内外引物比例为 61，最佳 dNTPs 浓度为 1mmolL1。图 4-A 左 PCR 管中溶液呈蓝色为阳性，对应图 4-B 左泳道出现典型的梯状条带；图 4-A 右PCR 管中溶液呈紫色为阴性，对应图 4-B 右泳道无任何条带，显色结果与电泳结果相互印证，不同结果颜色区分明显。A+BM2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp注：A：显色检测B：电泳检测；“”：阳性，“”：阴性；M：DLMarker2000Notes:A,Products detection by hydroxynaphthol blue dye;B,Products detection by agarose gel electrophoresis;“”,Positivesample;“”,Negativesample;M,DLMarker2000图4可视化体系建立Fig.4Establishmentofvisualizationsystem2.4反应条件优化图 5-A 中 14 号 PCR 管中溶液呈明显蓝色为阳性结果，表明 M.medusae 体系在 61、63、65、67 的温度条件下均能发生扩增反 应 且 最 低 温 度 为 61；图 5-C 中 1 4 号PCR 管中溶液呈明显蓝色为阳性结果，表明温度为 61 时，M.medusae 体 系 在 30 min、40min、50min、60min 的时间条件下均能充分扩增且最短时间为 30min。图 5-B 中 13 号 PCR 管中溶液呈明显蓝色为阳性结果，4 号 PCR 管中溶液呈紫色为阴性结果，表明温度为 67 时不利于 M.larici-populina体系进行扩增，因此能够保证 M.larici-populina 体系发生扩增的反应温度为 61、63、65，最低温度为 61；图 5-D 中 1 号 PCR 管中溶液呈紫色为阴性结果，24 号 PCR 管中溶液呈明显蓝色，为阳性结果，表明在温度为 61，反应时间为 30min 时，M.larici-populina 体系由于时间过短无法充分扩增而导致 HNB 显色不佳，因此能够保证 M.larici-populina 体系充分反应的时间为40min、50min、60min，最短时间为 40min。最终得到体系和反应条件如表 5 所示。2.5灵敏度检测图 6-A 所示 17 管呈现蓝色为阳性，其余呈紫色为阴性，即将出现颜色分化时对应的最低浓度梯度为 34fgL1。图 6-B 所示 17 管呈现蓝色为阳性，其余呈紫色为阴性，即将出现颜色分化时对应的最低浓度梯度为 60fgL1。因此 M.medusae反应体系灵敏度可达 34fgL1，M.larici-populina反应体系灵敏度可达 60fgL1。3讨论一直以来，松杨栅锈菌和北美栅锈菌引起的杨树叶锈病困扰着杨树产业发展，建立快速的杨树叶锈病分子检测方法在口岸检疫、产地检疫及锈病流行监测等方面具有重要意义。2019 年，陆红艳以松杨栅锈菌 HMJAU85 核糖体 RNA 基因为靶序列设计了 LAMP 特异性引物，在试剂盒的基础上建立了基于钙黄绿素-Mn2显色的松杨栅锈菌可视化检测体系，在 65 下反应 50min 即可观察结果，为青杨锈病的检测提供了重要的技术支持23。但在栅锈菌属的鉴别上，特别是北美栅锈菌的鉴别上，国内外均缺乏相关研究。本研究建立了能够相互区别的北美栅锈菌和松杨栅锈菌的 LAMP 检测ABCD4321N4321N4321N4321N注：A：M.medusae 体系温度优化；B：M.larici-populina 体系温度优化；C：M.medusae 体系时间优化；D：M.larici-populina 体系时间优化 A、B:14 温度：61，63，65，67；C、D：14 时间：30min，40min，50min，60min；N：空白对照Notes:A,TemperatureoptimizationforLAMPsystemofM.medusae;B,Temperature optimization for LAMP system of M.larici-populina;C,Time optimization for LAMP system of M.medusae;D,TimeoptimizationforLAMPsystemofM.larici-populina;A、B:Tube14oftemperature:61,63,65,67;C、D:Tube14oftime:30min,40min,50min,60min;N,theblank图5反应条件优化Fig.5Theoptimizationofreactionconditions第5期蓝燕，等：北美栅锈菌和松杨栅锈菌可视化检测体系建立145体系并且可以实现对这两种锈菌的鉴定。与陆红艳的研究相比，本研究中 LAMP 检测的灵敏度略低，为 60fgL1，但在显色剂的选择、反应条件、检测成本 3 个方面均有所改进。首先，钙黄绿素作为 LAMP 常用显色剂之一，与 MnCl2搭配使用，二者之间的配比要极为精细才有明显效果，因此需要深入研究离子配比；有研究表明，Mn2会降低 LAMP 反应效率，使 BstDNA 聚合酶的错配率达 0.8%10,24，本研究使用的显色剂为羟基萘酚蓝，具有颜色区分度好、配置方便，无需优化离子配比等优势，且对 LAMP 反应过程无影响；在配置体系时最后加入 Mg2并混匀，可得到更好的显色效果。其次，本研究将松杨栅锈菌的检测温度降低至 61，检测时间缩短至 40min，在反应温度和时间上得以进一步优化，也可以降低发生非特异性扩增的概率。最后，以试剂盒为基础建立的反应体系将导致检测经济成本提高，本研究通过自配试剂并探索最佳检测体系及反应条件，在降低检测成本的同时也保证了引物和各组分间的高效配合。具有特异性的有效引物是建立检测体系的关键。LAMP 引物设计难度较高，引物序列长，一般需要通过实验检验其特异性。大多数 LAMP 体系建立过程中，往往先建立好最优体系，再进行特异性检测。若最终检测结果表明引物无特异性，则需要重新设计引物，这会导致人力、物力及时间的浪费。因此本研究将引物特异性检测放至建立体系之前，先用通用试剂盒建立的稳定体系对引物进行筛选及特异性检测，若引物不具备特异性，则可以直A789654321N789654321NB注：A：M.medusae 体 系 灵 敏 度 检 测，1 9DNA 浓 度：34ngL1 340 agL1；B：M.larici-populina 体 系 灵 敏 度 检 测，19DNA 浓度：60ngL1600agL1，N：空白对照;注：A：M.medusae 体系灵敏度检测，19DNA 浓度分别为：34ngL1，3.4ngL1，340 pgL1，34 pgL1，3.4 pgL1，340 fgL1，34fgL1，3.4fgL1，340agL1；B：M.larici-populina 体系灵敏度检测，19DNA 浓度分别为：60ngL1，6ngL1，600pgL1，60 pgL1，6 pgL1，600 fgL1，60 fgL1，6 fgL1，600agL1；N：空白对照Notes:A,SensitivitydetectionforLAMPsystemofM.medusae,tube19DNAconcentrationis34ngL1,3.4ngL1,340pgL1,34pgL1,3.4 pgL1,340 fgL1,34 fgL1,3.4 fgL1 and 340agL1,respectively;B,SensitivitydetectionforLAMPsystemofM.larici-populina,tube19DNAconcentrationis60ngL1,6ngL1,600pgL1,60pgL1,6pgL1,600fgL1,60fgL1,6fgL1and600agL1,respectively;N,theblank图6LAMP 灵敏度检测Fig.6SensitivitydetectionofLAMP表5最终体系及反应条件Table5Terminaloptimizationofreactionsystemandreactionconditions组分及浓度ComponentsandConcentrations体积/LVolumeM.medusaeM.larici-populina10Buffer2.52.5Mg2+(100mmolL1)1.00.5dNTPs(10mmolL1each)3.02.5FIP(10molL1)4.03.0BIP(10molL1)4.03.0F3(10molL1)0.50.5B3(10molL1)0.50.5模板template1.51.5BstDNA聚合酶(8000Uml1)BstDNApolymerase0.50.5羟基萘酚蓝(2mmolL1)Hydroxynaphtholblue2.02.0ddH2O补至25L反应条件Reactionconditions61水浴30min后80水浴10minWaterbathat61for30minfollowed80for10min61水浴40min后80水浴10minWaterbathat61for40minfollowed80for10min146林业科学研究第36卷接排除，从而提高了引物筛选效率。LAMP 因其特异性强、灵敏度高、操作简易而备受关注；同时，LAMP 技术也存在一定的局限性。LAMP 扩增的产物量大，如有操作不慎，极易造成气溶胶污染，导致假阳性结果。有研究表明，建立 UDG-dUTP 反应系统可有效解决气溶胶污染问题，可尝试在本研究建立的体系基础上加入UDG 酶以及 dUTP，以增强反应特异性25。为了将 LAMP 检测技术应用于现场快速检测，本研究可以结合锈菌夏孢子快速提取 DNA 技术26，建立更高效的杨树叶锈病 LAMP 检测技术，为病害的检疫和防控争取更多的主动性。4结论本研究通过环介导等温扩增技术（LAMP）建立了特异性强、灵敏度高的可视化检测体系，实现了北美栅锈菌和松杨栅锈菌快速、准确的鉴定及区分。本研究设计的两组引物可特异性识别相应的靶基因序列。在体系中加入 160M 羟基萘酚蓝后可以直观地对供试的病原菌进行鉴别，极大地克服了传统电泳检测的弊端，并且检测体系灵敏度分别达到了 34fgL1和 60fgL1。基于本研究建立的可视化体系，在 61 恒温条件下，分别反应 30min与 40min 后即可观察结果，可达到快速检测的目的。参考文献：曾伟生,陈新云,杨学云,等.我国人工杨树生物量建模和生产力分析J.林业科学,2019,55（11）：1-8.1 何经纬,张伊莹,田呈明,等.区域景观格局对杨树锈病为害流行的影响以北京延庆地区银白杨为例J.林业科学,2020,56（4）：99-108.2 BOUTIGNYAL,GUINETC,VIALLEA,et al.Asensitivereal-timePCRassayforthedetectionofthetwoMelampsora medu-saeformaespecialesoninfectedpoplarleavesJ.EuropeanJournalofPlantPathology,2013,136（3）:433-441.3 ZHENGW,NEWCOMBEG,HUD,et al.ThefirstrecordofanorthAmericanpoplarleafrustfungus,Melampsora medusae,inChinaJ.Forests,2019,10（2）:182.4 王云飞,张昊,杨美欣,等.南方镰孢Fusarium meridionale特异性PCR检测方法的建立与应用J.植物保护,2022,48（2）：162-166,172.5 杨玉文,乔培,刘德华,等.基于多重PCR技术的西瓜噬酸菌分组检测方法及其应用J.植物保护,2022,48（4）：211-219.6 陈鑫源.木材腐朽菌的DNA提取及PCR检测研究D.哈尔滨:东北林业大学,2019.7 NAGAMINEK,HASET,NOTOMIT.Acceleratedreactionbyloop-mediatedisothermalamplificationusingloopprimersJ.MolecularandCellularProbes,2002,16（3）:223-229.8 NOTOMIT,OKAYAMAH,MASUBUCHIH,et al.Loop-medi-ated isothermal amplification of DNAJ.NucleicAcids Re-search,2000,28（12）:e63.9 GOTOM,HONDAE,OGURAA,et al.Colorimetricdetectionofloop-mediatedisothermal amplification reaction by using hy-droxynaphtholblueJ.Biotechniques,2009,46（3）:167-172.10ZHOU S,HUANG Q,YU M,et al.Rapid visual detection o