氨氮降解菌Paraburkholderia fungorum Gan-35的基因组分析.pdf

基金项目:广东省普通高校青年创新人才类项目()广东省普通高校重点领域专项()广东省公益研究与能力建设专项()广东省海洋资源与近岸工程重点实验室开放基金资助项目()江门市基础与理论科学研究类科技计划项目()作者简介:洪跃辉 男副教授博士 研究方向为微生物组学:.冯爱娟 女副教授博士 研究方向为微生物学:.洪跃辉与冯爱娟为并列第一作者 通讯作者 男教授博士博士生导师 研究方向为微生物油气勘探、海洋环境微生物学:.收稿日期:氨氮降解菌 的基因组分析洪跃辉 冯爱娟 张洪瑕 吕锦慧 梁建林 王江海(.广东江门中医药职业学院 江门市中药成份及其作用机制重点实验室广东 江门.广东轻工职业技术学院 食品与生物技术学院广东 广州.广东江门中医药职业学院 护理临床学院广东 江门.中山大学 海洋科学学院广东 珠海.中山大学 广东省海洋资源与近岸工程重点实验室广东 珠海)摘 要 为揭示赣南稀土矿山废弃地氨氮降解菌 的遗传背景采用 测序技术和生物信息学方法对 的基因组进行分析 获得了 的基因组草图序列 序列组装后得到 个 包含两条质粒序列基因组大小为.含量为.含有 个基因这些基因在 注释中主要富集于“”“”等 注释显示“”富集的基因最多 在 基因组中预测出 条串联重复序列、个 基因和 个 基因包括与硒代半胱氨酸对应的 基因 与 具有良好的基因组共线性关系 基因组与其他基因组比较有少量 分类富集的基因数目出现显著差异 基于分析结果将 的物种名称重新确定为 从 基因组中鉴定出反硝化脱氮途径的硝酸盐还原酶基因和亚硝酸盐还原酶基因并进行了验证 此外还鉴定出氨同化作用的关键酶基因但未找到硝化途径的主要酶基因 对 基因组的全面分析有助于后续深入研究氨氮降解机制和解决水产养殖中的氨氮污染问题关键词 氨氮 基因组 稀土 赣南 氨同化 硝酸盐还原酶 亚硝酸盐还原酶中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.)微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .近年来国内水产养殖带来的经济效益显著然而水产养殖也会造成严重的环境污染水产养殖的生物排泄物等使水中的氨氮浓度升高对水生生物的健康产生严重威胁因而造成较大经济损失而且严重破坏生态平衡 水体中高浓度氨氮还会造成水生生物的氨氮累积当氨氮转化成亚硝氮时 会对生物体产生毒性 显然从环境保护、经济效益和食品安全的角度来看水产养殖中的氨氮污染处置是亟需解决的问题 目前氨氮污染的处置方法包括物理化学法和生物法前者具有成本较高、操作复杂、易造成二次污染等弊端因而在实际应用中受到较多限制 生物法主要是利用微生物来降解氨氮具有成本低、操作简单、不易造成二次污染等优点是水产养殖中常用的氨氮污染处置方法 目前已经有不少关于生物法处置氨氮污染的研究报道多数关注氨氮降解特性研究或者通过在水体中加入生物制剂研究处置效果 例如 等将复合益生菌添加到鲫鱼养殖水中 周后发现添加复合益生菌的养殖水中的氨氮和亚硝酸盐处于动态平衡鱼的生长性能也优于对照组 然而目前氨氮污染处置尚需改善处置效果和降低处置成本 构建出高效降解氨氮和环境适应性更强的工程菌是解决这些问题的重要途径因为工程菌能按预期设想携带多种必需的遗传特性使其高效地去除污染物 阐明氨氮降解菌的遗传背景有助于工程菌的构建是目前氨氮污染处置研究热点之一 目前氨氮降解机制仍未被完全研究清楚 过去认为脱氮途径包括好氧硝化和厌氧反硝化两种方式微生物通常只含其中一种途径 然而近年来发现某些微生物可同时含有异养硝化和好氧反硝化途径 目前被发现的与氨氮降解相关的酶主要包括氨单加氧酶()、羟胺氧化酶()、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、亚硝酸盐氧化还原酶()、一氧化氮还原酶()等 除硝化和反硝化脱氮途径外微生物对氨氮的代谢还包括氨同化作用用于合成氨基酸等物质谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、丙氨酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶是氨同化作用的主要关键酶 本研究前期从赣南稀土矿山废弃地分离出伯克霍尔德菌 具有十分罕见的氨氮降解能力隶属于伯克霍尔德菌属()室内优化条件下(.接种量 温度 碳氮比为 培养时间 )对高浓度氨氮(/)的平均降解率为.在降解过程中检测到的 和 的浓度很低 本研究对 进行基因组测序全面剖析其遗传背景有助于构建出合适的工程菌为氨氮污染的环境修复提供参考 微 生 物 学 杂 志 卷 材料与方法.材料.菌株菌株 保存于中国典型培养物保藏中心菌株编号为“”.培养基()液体培养基(/):胰蛋白胨 酵母提取物 超纯水溶解定容至 灭菌 .主要试剂与仪器设备(天津市大茂化学试剂厂)胰蛋白胨(英国)酵母提取物(英国)琼脂糖(西班牙)引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)(生工生物)建库试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)柱式细菌基因组 抽提试剂盒(生工生物)柱式 胶回收试剂盒(生工生物)高速冷冻离心机(中科中佳科学仪器公司)凝胶成像分析系统(杭州朗基科学仪器有限公司)超微量分光光度计(美国)电泳仪(南京驰顺科技发展有限公司)仪(美国)单门双层小容量恒温培养振荡器(上海苏坤).方法.基因组 提取与检测 将 在 培养基中 、/培养至对数生长期 /离心 收集菌体 采用酚/氯仿法提取基因组 使用超微量分光光度计对 浓度和纯度进行测定用.琼脂糖凝胶电泳检测 的完整性.基因组测序与数据质控采用 建库试剂盒构建 测序文库插入片断大小为 采用 平台进行 双端测序 然后对原始数据进行质量控制:去掉接头序列弃掉含 的数量超过一定比例的序列(默认 设为 )去掉低质量碱基()数目连续达到一定程度的序列.基因组数据 分析和序列组装利用测序所得序列选择中间高质量的序列区域逐个碱基取 片段记录各 的深度和各深度的频数所占比例 采用 对质控后的 进行序列组装.基因预测和功能注释 利用 从组装结果中获得基因序列在、等数据库中进行功能注释(值).串联重复序列预测 使用 预测串联重复序列.和 基因预测 将序列在 数据库中进行比对使用.搜索基因序列 采用 预测 基因.基因组比较 在 数据库中查找其他 的基因组信息与 的基因组进行基本特征比较 以 的基因组为参考基因组 采用进行基因组共线性分析 获得 功能注释后采用 精确检验评估 与 ()数据库中其他基因组之间 功能分类的差异.氨氮降解基因的验证根据基因组测序得到的硝酸盐还原酶 亚基和亚硝酸盐还原酶的基因序列采用 .设计引物(表)委托生工生物合成引物 采用基因组 抽提试剂盒从 中提取基因组 按照说明书进行操作然后利用 琼脂糖凝胶电泳检测 的完整性用超微量分光光度计测定其浓度和纯度 检测合格后利用引物分别对硝酸盐还原酶基因和亚硝酸盐还原酶基因进行 扩增 反应体系:模板 上、下游引物(/)各 (/.()酶(/)加 入 无 菌将反应体系补至 以不加模板 的反应体系作为阴性对照 在 仪上进行扩增 反应条件:预变性 变性 (每循环降.)退火 延伸 循环 次 变性 退火 延伸 循环 次 延伸 保温 扩增后采用 琼脂糖凝胶电泳检测 产物然后将目的电泳条带切胶回收按照 柱式 胶回收试剂盒的说明书进行操作 将胶回收样品送至生工生物进行测序分析 将 测序所得序列分别在 中进行 比对然后与相似度较高的 期 洪跃辉 等:氨氮降解菌 的基因组分析 基因序列一起构建系统进化树(参考.描述的方法)表 引物 验证基因引物序列()产物大小/硝酸盐还原酶基因上游引物:下游引物:亚硝酸盐还原酶基因上游引物:下游引物:.基因的系统进化树构建 将 的 基因序列(编号.)在 中进行 比对比对时选择/数据库在比对结果中选择下载 基因序列采用近邻相接法利用.构建系统进化树 参数设置为 结果与分析.基因组 检测对 的基因组 样品进行.琼脂糖凝胶电泳结果显示 条带清晰无明显降解(图)说明 完整 经超微量分光光度 计 检 测 得 知 浓 度 为././.说明 的纯度和浓度均达到测序建库的要求.数据质控统计测序后对原始数据进行了质量控制(表)不符合分析要求的序列所占比例(移除率)较低说明大部分序列达到分析要求 分析报告也显示序列经过质量控制后达到下游数据分析的要求 测序得到的 已被提交至 ()数据库数据编号为表 数据质控统计 原始序列总碱基数/对数目/高质量序列总碱基数/对数目/移除率/.注:保留了两位小数 去除的低质量序列所占的比例.分析在不考虑测序错误率、基因组的杂合度和重复度的情况下逐个碱基取 的分布应符合泊松分布 分析结果如图 所示 分布图出现单个主峰表明基因组的纯度较高不存在杂菌污染.基因组组装概况和串联重复序列经过序列组装后得到 的基因组草图序列 数目为(最长的 长度为 )包含两条质粒序列 的基因组大小为.基因组完整性为.含量为.将基因组测序获得的 图 基因组 琼脂糖凝胶电泳()和 分析().()()微 生 物 学 杂 志 卷基因序列在 数据库中进行 比对最相近的物种是 (相似度 .)在 基因组中预测出 条串联重复序列有 条串联重复序列的长度为 最长为 大部分重复 次.非编码 在 基因组中预测出 个 基因其中 基因有 个拷贝 基因和 基因均有 个拷贝 预测出 个基因(表)大部分氨基酸有 个 与其对应其中与亮氨酸()对应的 基因数目最多(个)需要注意的是在 基因组中发现有硒代半胱氨酸()的 基因存在 以往关于 的研究报道均未提及 的()并非存在于所有生物中被称为第 种氨基酸通常作为活性中心存在于含硒酶中 与其他 相比最明显的不同之处在于它含有特殊的接收茎、一个长可变臂和几个高度保守碱基的替换 在翻译过程中的作用机制也不同于其他 表 的 类型和数目 氨基酸反密码子:注:冒号后面的数字表示对应的 数目 没有冒号和数字表示无相应 存在.基因预测和功能注释在 基因组中预测出 个蛋白质编码基因 平均长度为 拼接序列在、数据库中获得注释的 基 因 数 目 分 别 为 (.)、()、(.)、(.)将预测基因在 数据库中比对时发现菌株 与 最 相 似 有 (.)个基因分入 其中有 个基因分入 (比例最高)注释显示 基因组序列在“细胞成分”“分子功能”和“生物过程”都有分布“生物过程”含有的基因较多 基因主要富集于“”“”“”“”“”“”等(图)有 个基因获得 注释编号注释比例.具体注释统计见图 一级分类中注释为“代谢”的基因最多(个)其次是“表征不充分的”(个)二级分类中注释为、和 类的基因数目较多分别为、和 在 二级分类中“代谢”“遗传信息加工”“环境信息加工”和“细胞过程”都有基因获得注释(图)“代谢”富集的基因最多 表明有较多基因与代谢相关 对具体分类来说“”“”和“”含有的基因较多 在 三级分类中“”含有的基因最多(图)在 基因组中共鉴定出 个参与氮代谢途径()的基因(有些基因序列注释为同一个基因)主要包括参与“”()“”(/、/、/、/、)“”(/、/、/、/)和“”(/、/)的基因基因注释时在 基因组中未找到氨氮硝化途径的主要酶基因 包括氨单加氧酶()、羟胺氧化酶()和亚硝酸盐氧化还原酶()的编码基因及其同源序列 在氨氮反硝化途径中只注释到硝酸盐还原酶()和亚硝酸盐还原酶()的基因未找到一氧化氮还原酶()和氧化亚氮还原酶()的编码基 期 洪跃辉 等:氨氮降解菌 的基因组分析 因 将 的序列在 注释时找到与氨同化作用相关的基因包括谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、丙氨酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的编码基因图 注释.:细胞:细胞部分:包膜:胞外区:胞外区部分:大分子复合物:膜附着腔:细胞器:细胞器部分:抗氧化剂:结合:催化剂:电子载体:酶调节器:金属伴侣:分子传感器:营养库:结构分子:转录调节因子:翻译调节因子:转运蛋白:解剖结构形成:生物附着:生物调节:细胞组分生物合成:细胞组分组织:细胞过程:死亡:发育过程:局部构建:定位:代谢过程:多生物过程:多细胞生物过程:色素淀积:繁殖:繁殖过程:应激反应:图 注释.:细胞周期控制、细胞分裂和染色体分区:防御机制:信号转导机制:细胞壁/膜/包膜生物发生:细胞运动:细胞外结构:细胞骨架:翻译后修饰、蛋白质更新和分子伴侣:翻译 核糖体结构和生物发生:复制、重组和修复:染色质结构和动力学:加工和修饰:转录:能量产生与转换:碳水化合物运输和代谢:氨基酸转运和代谢:核苷酸转运和代谢:辅酶运输和代谢:脂质运输和代谢:无机离子运输和代谢:次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢:功能未知:一般功能预测:/:微 生 物 学 杂 志 卷图 代谢途径的二级()和三级()分类.()():氨基酸代谢:其他次生代谢产物的生物合成:碳水化合物代谢:能量代谢:聚糖生物合成和代谢:脂质代谢:辅助因子和维生素的代谢:其他氨基酸代谢:萜类化合物和聚酮类化合物代谢:核苷酸代谢:概览:外源物质生物降解和代谢:折叠、分类和降解:复制和修复:转录:翻译:膜运输:信号转导:细胞生长和死亡:细胞运动:运输和分解代谢:转运蛋白:碳代谢:氨基酸生物合成:双组分系统:嘌呤代谢:乙醛酸和二羧酸代谢:氧化磷酸化:丙酮酸代谢:苯丙氨酸代谢:缬氨酸 亮氨酸和异亮氨酸降解:脂肪酸代谢:丁酸甲酯代谢:脂肪酸降解:甘氨酸 丝氨酸和苏氨酸代谢:苯甲酸酯降解:嘧啶代谢:细菌分泌系统:芳香族化合物降解:色氨酸代谢:核糖体:.基因组比较由表 可知前三株细菌的基因组大小、含量和 基因数目的差别不大均含有 个质粒 的 基因数量明显较少 的蛋白质编码基因最多 是 其中一个分化枝的细菌(详见讨论部分)(洋葱伯克霍尔德菌)是典型的 细菌 的质粒数目为 而目前在 数据库中显示共有 株 含有质粒(各含 个)的 含量最高 数据库收录的已完成测序的 的 含量都在 以上而已完成测序的 的 含量都不超过 以 的基因组为参考基因组进行了基因组共线性分析 图 的上半部分从左下角至右上角的线条表示两个基因组的匹配情况图 的下半部分以散点图的形式表示在所有核苷酸位置两个基因组的相似度底部不连续的线条表示 基因组对于参考基因组的覆盖度线条断开处表示 期 洪跃辉 等:氨氮降解菌 的基因组分析 基因组缺少的区域 显然 基因组与 基因组呈现出良好的共线性关系表 基因组基本特征的比较 基本特征 组装水平完整染色体完整基因组大小/.含量.蛋白质编码基因数目 基因数目 基因数目 数目质粒数目图 基因组共线性分析.图 中 比值比(/)的值大于 时表示 含有相应 分类的基因较多小于 则相反 与 数据库的其他基因组比较 有较多基因富集于以下 分类(有统计学意义):“”“”“”“”“”在 中有 个 分类包含的基因相对较少.氨氮降解基因的验证图 是用于氨氮降解基因验证的基因组 电泳结果基因组 条带清晰无明显降解说明 完整 产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示阴性对照组未出现基因扩增条带(图)说明实验试剂和实验过程均无污染 分别针对硝酸盐还原酶基因和亚硝酸盐还原酶基因的 扩增均出现了特异电泳条带扩增片段大小与预期基本一致 分别对目的条带进行了切胶回收然后进行了 测序验证 结果显示测序所得序列与用于引物设计的基因序列的比对匹配度均为 将 测序所得序列分别在 中进行 比对两条序列分别比对上硝酸盐还原酶基因和亚硝酸盐还原酶基因(最高相似度分别为.和.)与相似度较高的序列一起构建了系统进化树 图 显示 的硝酸盐还原酶基因()与 的硝酸盐还原酶基因的亲缘关系最近 的亚硝酸盐还原酶基因()与 的亲缘关系最近 这些结果说明 扩增产物即为上述两种基因片段也表明 含有硝酸盐还原酶基因和亚硝酸盐还原酶基因.基因的系统进化树系统进化树结果显示 与所有参与建树的 聚在一起形成一个相对独立的分支(图)说明 与 的进化距离较近 微 生 物 学 杂 志 卷图 基因组的 基因富集与 数据库中其他基因组的差异.表示具有显著差异:染色质结构和动力学:翻译 核糖体结构和生物发生:转录:复制、重组和修复:细胞周期控制、细胞分裂和染色体分区:细胞壁/膜/包膜生物发生:细胞运动:翻译后修饰、蛋白质更新和分子伴侣:信号转导机制:细胞内转运、分泌和囊泡运输:防御机制:能量产生与转换:氨基酸转运和代谢:核苷酸转运和代谢:碳水化合物运输和代谢:辅酶运输和代谢:脂质运输和代谢:无机离子运输和代谢:次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢:一般功能预测:功能未知 :/:图 基因组 ()和 产物()电泳.()():基因组 :分子量标准():硝酸盐还原酶基因片段:亚硝酸盐还原酶基因片段:阴性对照(图中的条带为引物片段):分子量标准():():():()期 洪跃辉 等:氨氮降解菌 的基因组分析 图 硝酸盐还原酶基因()和亚硝酸盐还原酶基因()的系统进化树.()()在其他菌株名称后面的括号中冒号前面的是基因组序列编号冒号后面的是比对到的基因序列在基因组上的跨度范围 图 基于 基因序列的系统进化树分析.微 生 物 学 杂 志 卷 讨 论 属于革兰阴性菌是一个在形态、代谢和生态方面具有多样性的 菌 属 等首次将 分为 个菌属(分化枝 和)分化枝 包含临床相关菌种(如)和植物致病性菌种分化枝由来源于各种环境的 组成分化枝 的名称保留为 而分化枝命名为 这种划分与菌种来源有一定关系 目前这些观点已经被广泛接受并逐渐将大多数 重新界定更准确的名称 例如 已经被广泛重新命名为 包括菌株 已经由原来的 改名为 分离自赣南稀土矿山废弃地属于环境来源菌种之前的研究基于形态学、生理生化和 基因系统进化分析将其鉴定为 按照学者广泛接受的观点理应将其重新命名为 本研究将基因组测序得到的 基因序列在 数据库中进行比对与 最相近的物种是 (相似度 .)它们具有良好的基因组共线性关系(图)在基因注释方面将预测基因在 数据库进行比对时与 匹配的基因所占比例是最高的 将之前 测序获得的 的 基因序列(编号.)重新在 中进行 相似度排在前面的均为 比对最高得分为 来源于菌株 (的模式菌株之一)序列覆盖度为 值.相似度为.系统进化树显示(图)与 聚类在一起的均为 未与其他 聚在一起并且与 的进化距离相对较远 含量是细菌分类学的标准之一表 显示 与 、的 含量较接近而与 的 含量差异较大 基于这些分析本研究将 的名称由原来的 重新命名为更准确的 前期研究发现 能降解高浓度氨氮(/)是一种十分罕见的具有高效降解氨氮能力的 在氨氮污染修复方面具有良好的应用前景 本研究从 基因组中鉴定出反硝化途径的主要酶基因包括硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的编码基因并通过 和 测序对它们进行了验证 硝酸盐还原酶是反硝化途径的关键酶催化硝酸盐转化为亚硝酸盐这是反硝化的限速反应 亚硝酸盐还原酶主要在好氧反硝化途径中发挥重要作用可催化亚硝酸盐转变成 硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶催化的反应是反硝化途径的主要步骤 注释显示 含有异化型硝酸盐还原酶 的完整基因簇包括/、/、/和/分别编码 的、和 亚基 在 基因组中未找到同化型硝酸盐还原酶的编码基因 至于亚硝酸盐还原酶()鉴定出 和 分别编码 的大、小亚基 然而未找到硝化途径的主要酶基因包括、和 的编码基因及其同源序列 这种情况与前人的某些研究类似 例如林燕等在异养硝化菌 .和 .中也未鉴定出 及其同源序列 在硝化途径中一种常见的方式是首先由 催化氨氮生成羟胺然后由 催化羟胺生成亚硝酸盐 将亚硝酸盐转变成硝酸盐 生成的硝酸盐可通过反硝化途径进行分解 在反硝化途径中起重要作用可将 转变成 在 基因组中未鉴定出 的编码基因 氧化亚氮还原酶()催化反硝化中的 转变成 在 基因组中也未发现相应基因的存在此外在 基因组中鉴定出谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、丙氨酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的编码基因这些酶都是氨同化过程中的关键酶 谷氨酸脱氢酶途径和谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶复合酶系途径是多数微生物氨同化的主要途径也是以氨氮从头合成氨基酸的典型方 期 洪跃辉 等:氨氮降解菌 的基因组分析 式 谷氨酸脱氢酶是谷氨酸合成的关键酶当有、酮戊二酸和辅酶存在时该酶可催化酮戊二酸与氨生成谷氨酸 谷氨酸和 在谷氨酰胺合成酶催化下生成谷氨酰胺谷氨酰胺和酮戊二酸又可在谷氨酸合成酶催化下生成两个谷氨酸 丙氨酸脱氢酶能以 类似物作为辅酶进行脱氨反应和氨同化丙氨酸脱氢酶途径是氨同化的另一条重要途径 此外有学者提出天冬酰胺合成酶途径可能也是细菌氨同化的重要途径 然而本研究的基因组测序未鉴定出天冬酰胺合成酶的编码基因在 基因组中氨同化作用的基因较齐全故推测氨同化作用在 的氨氮降解中可能更重要 从基因组测序层面来看 不含硝化途径的基因反硝化途径不完整(只鉴定出 和 的编码基因)然而不能排除一种可能性即由于 来源于特殊环境含有的其他反硝化基因(甚至是硝化途径的基因)与已知基因的同源性较低因此基因注释时未识别出具有类似功能的基因 这一推测与前人提出的某些观点相符例如不同菌株的氨单加氧酶基因通常存在很大差异 后续可通过更加系统和深入的研究(如氨氮降解基因的表达量分析和酶活性检测等)来完全阐明 降解氨氮的机制本研究获得了菌株 的基因组草图序列全面剖析了其遗传背景将其物种名称重新确定为 鉴定出与氨氮降解相关的基因(包括氨同化基因和部分反硝化基因)并推测了可能的氨氮降解途径有助于后续深入研究氨氮降解机制和设计出有效方法修复氨氮污染的环境如构建出氨氮降解能力和环境适应性更强的工程菌来解决水产养殖中的氨氮污染问题不仅可显著提高水产养殖的经济效益而且还有利于保护养殖环境 研究结果还有助于深化认识 的遗传背景为其他微生物的组学研究提供重要的参考信息参考文献:孙娟 杨德利.我国海水养殖业的可持续发展研究.山西农业科学 ():.():.赵学付 朱健玲.离子型稀土矿削减氨氮污染问题的对策.世界有色金属():.王越.嗜碱盐单胞菌菌株 的氮代谢相关功能基因的研究.上海:上海海洋大学.():.:.():.戚文静 李怀京 葛惟晨 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