γ-氨基丁酸B型受体活性对慢性应激大鼠下丘脑神经元超微结构的影响.pdf

神经解剖学杂志2023,39(5):575 579Chinese Journal of Neuroanatomy-氨基丁酸B型受体活性对慢性应激大鼠下丘脑神经元超微结构的影响范雅丽，王苗霞，张宏1*，金玉祥2（1石家庄医学高等专科学校解教研室，石家庄0 50 59 9；2 白求恩军医学院解剖教研室，石家庄0 50 0 8 1）【摘要目的：观察-氨基丁酸B型受体(GABAR)活性对慢性应激大鼠下丘脑神经元超微结构的影响。方法：Wistar大鼠6 0 只，分为对照组（control）、应激组（stress）、应激结合2-羟基萨氯酚（2-0 H-saclofen）给药组（s t r e s s+2-O H-s a c l o f e n）、应激结合氯苯氨丁酸（baclofen）给药组（stress+baclofen）。采用间歇低频电击大鼠足底并联合噪声的方式建立应激大鼠模型,同时2-羟基萨氯酚（10 0 g/kg）或氯苯氨丁酸（0.0 4g/kg）分别经大鼠腹腔注射。应激40 d后，对处于不同应激阶段的大鼠进行取材。在透射电镜下观察下丘脑神经元超微结构的变化;用高效液相色谱法(HPLC)检测大鼠下丘脑内NE和DA含量的变化。结果：在透射电镜下观察发现，单纯应激组、应激结合氯苯氨丁酸给药组与正常对照组相比较，大鼠下丘脑神经元的超微结构出现不同程度的退行性变化；相反应激结合2-羟基萨氯酚给药组下丘脑神经元超微结构则未出现退行性改变。用（HPLC)检测大鼠下丘脑内NE和DA含量发现，与正常对照组相比，单纯应激组NE含量明显升高但呈现下降趋势,DA含量则呈上升趋势（P0.05）。应激结合氯苯氨丁酸给药组NE和DA含量呈上升趋势(P0.05）。应激结合2-羟基萨氯酚给药组NE和DA含量却接近正常水平。结论：GABAB受体抑制剂2-羟基萨氯酚对慢性应激大鼠下丘脑神经元有保护作用，而GABA受体激动剂氯苯氨丁酸则有损害作用。【关键词-氨基丁酸B型受体；2-羟基萨氯酚；氯苯氨丁酸；超微结构；慢性应激；大鼠D0I:10.16557/ki.1000-7547.2023.05.012The effects of -aminobutyric acid B-type receptor activity on theultrastructure of hypothalamic neurons in chronic stress ratsFAN Yalil,WANG Miaoxia,ZHANG Hong,JIN Yuxiang(1.Department of Anatomy,Shijiazhuang Medical College,Shijiazhuang 050599;2.Department of AnatomyBethune Military Medical College,Shijiazhuang 050081,China)Abstract Objective:To observe the effects of-aminobutyric acid B-type receptor(GABAgR)activity on the ul-trastructure of hypothalamic neurons in chronic stress rats.Methods:Sixty Wistar rats were divided into a controlgroup,a stress group,a stress-combined 2-OH-saclofen administration group(stress+2-OH-saclofen),and a stress-combined baclofen administration group(stress+baclofen).A stress rat model was established by intermittent low-fre-quency electric shock to the soles of rats combined with noise,and at the same time,20H-saclofen(100 g/kg)or ba-clofen(0.04 g/kg)were injected intraperitoneally into rats,respectively.After 40 days of stress,samples were takenfrom rats at different stress stages.The ultrastructural changes of hypothalamus neurons was observed under transmissionelectron microscopy.The change contents of NE and DA in the hypothalamus of rats was detected using electrochemicalmethods by high-performance liquid chromatography(HPLC).Results:Under transmission electron microscopy,it was基金项目：全军医学科学技术研究“十五 计划基金重点课题资助项目（0 1Z093）*通信作者：张宏电话：[phone]，E-mail：j i n g s h u i 19 8 0 16 3.c o m576observed that the ultrastructure of hypothalamic neurons in rats showed varying degrees of degeneratives changes in thesimple stress group and the stress combined with baclofen administration group compared with the normal control group.On the contrary,ultrastructure of hypothalamic neurons did not show any degenerative changes in the stress combination2-OH-saclofen administration group.The detection of NE and DA content in the hypothalamus of rats using HPLC re-vealed that the NE content in the simple stress group significantly increased,but NE content showed a downward trend,while the DA content showed an upward trend compared with the control group(P0.05).The NE and DA levelsshowed an upward trend in the stress combined with baclofen administration group(P0.05).The NE and DA levelswere close to normal levels in the stress combined with 2-OH-saclofen administration group.Conclusion:2-OH-saclofen,as GABAg receptor inhibitor,has a protective effect on hypothalamic neurons in chronic stress rats,while ba-clofen of agonist GABAg receptor has a damaging effect.Key words-aminobutyric acid B-type receptor(GABApR);2-OH-saclofen;baclofen;ultrastructure;chronic应激是生物体在受到内、外环境等有害因素刺激时而引起的以神经内分泌变化为主要特征的全身性非特异性适应反应 。下丘脑、垂体、肾上腺皮质三者共同构成的神经内分泌轴是机体应激反应的核心，即下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（hypothalamus-pi-tuitary-adrenal cortex axis，H PA），做为该轴的关键脑区,下丘脑在应激反应中起主要作用2 4。下丘脑内有抑制性神经递质-氨基丁酸（gam-ma-aminobutyric acid，G A BA）可对HPA轴进行中枢控制5。GABA受体调节剂在认知、行为与情绪领域起着重要的影响作用,GABA受体激动剂或拮抗剂可以改变患者6 或大、小鼠等动物的记忆、运动与焦虑样行为7.8 。有研究证明，在大鼠下丘脑、视上核、室旁核具有大量的GABA受体结合位点5。2-羟基萨氯酚(2-OH-saclofen）为GABA受体抑制剂，氯苯氨丁酸（baclofen）为GABA受体激动剂,均可通过血脑屏障作用于中枢。有研究表明 GABA,R激动剂能导致学习和记忆获得障碍，而拮抗剂具有增强大鼠学习和记忆的作用9 。但2-羟基萨氯酚和氯苯氨丁酸在慢性应激过程中对下丘脑神经元超微结构的影响目前还没有研究报道。本实验在成功建立应激大鼠模型的基础上，分别经大鼠腹腔注射GABAB受体抑制剂2-羟基萨氯酚和激动剂氯苯氨丁酸,研究在慢性应激过程中2-羟基萨氯酚和氯苯氨丁酸对大鼠下丘脑神经元超微结构的影响。材料和方法1.材料1.1实验动物由河北中医学院实验动物中心提供Wistar系雄性健康大鼠6 0 只，体质量为18 5 2 15神经解剖学杂志，2 0 2 3年9 月第39 卷第5期stress;rat度2 5 2 6。1.2主要药物、试剂及仪器实验药物及试剂购于美国Sigma公司，主要有：肾上腺素（epinephrine，E）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、多巴胺（d o p a mi n e，D A）、四辛基溴化胺（tetraoctylammoniumbromide，T BA）、二苯基硼酸-二氨基乙酯（2-amin-oethyldiphenylborinate，D PB）、色谱用离子对试剂1-辛基磺酸钠（sodium 1-octanesulfonate，O SA）。枸橡酸、NaOH、Na,H PO 4、乙底酸二钠（ethylenediaminetet-raacetic acid sodium salt,EDTA），NH,C l 及 HCL 分析纯。甲醇为色谱纯。实验仪器有Waters1500高效液相色谱仪、2 46 5电化学检测器均购自美国Wa-ters公司。2.方法2.1动物分组及模型制备将雄性健康Wistar系大鼠6 0 只随机分成对照组、单纯应激组、应激结合2-羟基萨氯酚给药组、应激结合氯苯氨丁酸给药组。间断、低频电击大鼠足底并结合噪声的方法制备应激模型。具体方法：将大鼠置于自制的应激装置内，应激装置下面为间距10 mm铜栅，铜栅通电电压为70150V,电流强度2 4mA,通电间隔2 0 30 s，通电时长50 10 0 ms，由48 6 微机程序随机控制。每日上午和下午分别应激2 h。2.2电镜观察、取材各组大鼠在应激40 d后次日进行取材。首先，对实验大鼠进行腹腔注射麻醉，采用3%戊巴比妥钠(0.0 4g/kg)体重。之后对各组大鼠经腹主动脉灌流3%多聚甲醛和1.2 5%戊二醛,灌流时长不低于0.5h。灌注毕即刻对大鼠进行断头开颅取脑，并放置在3%的戊二醛溶液内进行固定5 6 h后切取下丘脑。依据透射电镜生物样%。实验大鼠饲养条件：湿度为40%6 0%、室内温范雅丽：-氨基丁酸B型受体活性对慢性应激大鼠下丘脑神经元超微结构的影响品处理步骤，对下丘脑组织进行脱水、包埋、固定、切片等处理。处理后的脑组织切片用透射电镜进行观察，且电子束加速电压8 0 kV。2.3下丘脑内神经递质含量的测定对处于不同应激时段的大鼠,腹腔注射麻醉剂3%戊巴比妥钠(0.04g/kg）。断头开颅切取下丘脑，匀浆、离心。使用高效液相色谱仪和电化学检测器来检测大鼠下丘脑内NE和DA含量的变化。色谱条件：Waters1500高效液相色谱仪，Atlantis色谱柱（C18,1504.6mml.D.5m）,流动相为2.5%甲醇、10.5g/L枸橡酸、0.0 2 g/LEDTA及0.0 2 g/L离子对试剂OSA组成,用1 mol/L NaOH 调至 pH 3.0,流速为 1ml/min。2 46 5电化学检测器，检测电位+0.7 2 V,灵敏度1nA/V,温度设置30。Breeze色谱分析软件进行结果分析。2.4统计学处理利用统计软件SPSS20对实验结果进行分析,用均数标准差（xs)表示去甲肾上腺素、多巴胺的含量。各组间数据对比使用t检验。P0.05被视为具有显著差异。577结果1.2-羟基萨氯酚损害对慢性应激大鼠下丘脑神经元超微结构对照组大鼠下丘脑神经元核膜明显、核内有大而圆的核仁,线粒体清晰,胞浆内可见发达的粗面内质网，髓鞘可见清晰的明暗相间的板层样结构。应激组大鼠下丘脑神经元超微结构与对照组相比较出现了显著的退行性变化,神经核体积缩小,核膜皱缩,染色质浓缩,线粒体出现断裂，粗面内质网结构模糊,胞浆内可见空泡样变性，髓鞘变形等。应激结合氯苯氨丁酸给药组对比应激组发现,大鼠下丘脑内神经元超微结构的退行性变化却更为严重，出现了核膜溶解，髓鞘缺失等。应激结合2-羟基萨氯酚给药组对比正常对照组发现，大鼠下丘脑神经元超微结构却无显著的退行性变化,核膜完整，髓鞘完整,胞浆内结构清晰可见（Fig.1）。NucleusNervefiberssa.nsFig.1 The ultrastructure of rat hypothalamic neurons,The black arrows indicate mitochondria;The open arrows indicate nuclei;Theblack triangles indicate nucleoli;The white triangles indicate myelin sheaths.Bar=4 m.5782.2-羟基萨氯酚可使应激大鼠下丘脑内NE和 DA含量下降至正常水平，而氯苯氨丁酸却使其含量升高如表1所示,大鼠下丘脑内 NE 和DA含量与正常对照组相比,单纯应激组NE含量显著增高，随着表1在不同应激时段各组大鼠下丘脑内NE/DA含量(ng/g）的变化(n=6，s)去甲肾上腺素多巴胺组别1对照组0.54 0.40应激组4.41 1.21a应激+2-羟基萨氯酚组0.98 0.05应激+氯苯氨丁酸组0.61 0.71ap0.05us对照组;bP0.05us对照组.讨论应激可致机体全身性的内分泌改变,其中HPA轴在机体的应激反应中起核心作用。而下丘脑作为神经和内分泌的整合中枢10 ,与大脑的边缘系统及脑桥蓝斑之间具有广泛的纤维联系。应激时下丘脑室旁核分泌的促肾上腺皮质激素释放激素（corti-cotropin releasing hormone，CRH)即可通过垂体门脉系统进人腺垂体而激活HPA轴，又可通过与脑桥蓝斑的联系而促进蓝斑-交感-肾上腺髓质系统的活动。从而使HPA轴与蓝斑-交感-肾上腺髓质轴发挥交互作用 。使血液中儿茶酚胺及糖皮质激素分泌增加12 ,本课题前期实验研究也表明,应激使大鼠血清儿茶酚胺及糖皮质激素水平明显增高,表明HPA轴与蓝斑-交感-肾上腺髓质轴被激活，提高了机体抵御外部刺激的能力，进而维持机体内环境的平衡13。如果应激持续存在抑或应激强度过高，可致HPA轴亢进,引发激素级联反应,导致一系列的分子的变化和大脑损伤14。从而对机体产生一定的损害,甚至引起中枢神经系统的功能障碍出现抑郁、焦虑等1,15。有研究证实应激可导致大鼠下丘脑神经细胞出现损伤甚至变性死亡16 。本实验结果也证实,在慢性应激过程中下丘脑神经元的超微结构发生了变性改变。该损伤可能与血中高水平的糖皮质激素及儿茶酚胺含量有关，糖皮质激素对儿茶酚胺具有允许作用,致使小动脉持续收缩，血压升高，血液粘滞度升高，使器官的血液灌注受到影响，从而对下丘脑的形态和功能造成一定的损害。有研究表明由于心理应激而产生紧张、愤怒而神经解剖学杂志，2 0 2 3年9 月第39 卷第5期610.18 0.083.02 0.70a1.94 1.09a0.75 0.260.58 0.061.48 0.64b1.99 0.18h攻击性增强的人们脑内NE和DA增加明显并常伴有血浆儿茶酚胺浓度升高17 。本实验研究结果显示,与正常对照组相比,单纯应激组NE含量显著增高,随着应激时间的延长NE含量逐渐降低,而DA含量则呈上升趋势。可能是因为应激初期NE合成和释放速率大于再摄取速率18 ,导致中枢NE 蓄积，随着应激时间的延长机体能量大量消耗NE合成受到影响故而 NE含量逐渐降低。DA水平升高可能是由于中枢神经系统内 DA 能和 NE 能这两大神经系统相互制约，DA水平升高可进一步抑制NE活性,从而加重抑郁形成19 。应激结合2-羟基萨氯酚给药组大鼠下丘脑内NE和DA含量逐渐降低接近正常对照组水平。说明GABAg受体抑制剂2-羟基萨氯酚可能增加了脑内GABA的合成和释放,从而升高了抑制性神经递质GABA的浓度2 0 ,且下丘脑GABA能神经支配可直接抑制下丘脑室旁核(hypo-thalamic paraventricular nucleus，PVN）中 CRH 的分泌,从而降低了HPA轴的活性，使儿茶酚胺含量恢复至接近正常水平,进而对下丘脑神经元的超微结构起到了保护作用。应激结合氯苯氨丁酸给药组大鼠下丘脑内NE和DA含量与对照组相比均呈明显的上升趋势。说明GABAB受体激动剂氯苯氨丁酸激活了GABAR使其介导缓慢、持续较长的抑制性效应,抑制了GABA本身的释放，使GABA浓度降低2 1,PVN内GABA 能神经支配降低,进而降低了GABA对于 CRH神经元的抑制作用,使 HPA轴激活2 2 ,致儿茶酚胺水平升高，从而使下丘脑神经元超微结构发生变性坏死。也有实验研究证实,GAB-AB受体激动剂氯苯氨丁酸可导致抑郁，且海马内应激时间的延长NE含量逐渐降低；而DA含量则呈上升趋势。应激结合2-羟基萨氯酚给药组大鼠下丘脑内NE和DA含量逐渐降低接近正常对照组水平。应激结合氯苯氨丁酸给药组大鼠下丘脑内NE和DA含量与对照组相比均呈明显的升高态势。150.36 0.0740.23 0.040.24 0.03 a60.42 0.15a0.17 0.050.34 0.06 a150.57 0.25a0.19 0.160.48 0.37a范雅丽：-氨基丁酸B型受体活性对慢性应激大鼠下丘脑神经元超微结构的影响GABA浓度明显降低,而 GABA受体拮抗剂反而可以显著的缓解慢性不可预测的温和应激（Chronicunpredictable mild stress，CU M S)引发的抑郁行为,且海马中GABA的含量有所升高2 3。研究还发现GA-BA受体GABABi亚单位敲除小鼠表现出抗抑郁样行为2 4,因此，GABAB受体拮抗剂可能作为新型抗抑郁药的潜在靶点，为抑郁失眠症的治疗提供新思路12 5。参考文献1易善勇应激大鼠下丘脑神经细胞损伤的内质网应激机制D.石家庄：河北医科大学，2 0 2 0.DOI：10.2 7 111/d.c n k i.g h y k u.2020.001096.2 Lu MH,Zhao XY,Xu DE,et al.Transplantation of GABAergic in-terneuron progenitor attenuates cognitive deficits of Alzheimers dis-ease model mice J.J Alzheimers Dis,2020,75(1):245-260.D0I:10.3233/JAD-200010.3王玉露，王月月，贾，等，天王补心丸对慢性不可预知应激抑郁模型小鼠行为学,HPA轴，海马GSK3磷酸化及BDNF表达的影响J：中国实验方剂学杂志，2 0 2 0，2 6（2 1）：55-6 1.D0I:10.13422/ki.syfjx.20201864.【4】林俊言，何金霞，郑千姿，等电针干预慢性炎性痛及其焦虑情绪与海马不同区域GABA相关机制研究J.浙江中医药大学学报,2 0 2 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