P3肽抑制RAW264.7巨噬细胞泡沫化的分子机制.pdf

网络出版时间：网络出版地址：肽抑制 巨噬细胞泡沫化的分子机制李佳慧，蒋宇恒，王承瑾，江林，邓艳，张礼林，许庆忠，李红梅（贵州医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，贵州 贵阳 ）收稿日期：，修回日期：基金项目：贵州省科学技术基金资助项目（黔科合基础 一般 ）；贵州省卫生健康委科学基金资助项 目（）；大学生创新创业训练计划项目资助（）作者简介：李佳慧（），女，硕士生，研究方向：小肽在心血管疾病中的作用，：；李红梅（），女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：小肽在心血管疾病中的作用，通信作者，：文献标志码：文章编号：（）中国 图 书 分 类 号：；摘要：目的观察 肽对 巨噬细胞脂质沉积的影响，并探讨其作用机制。方法采用 法筛选 肽及氧化低密度脂蛋白（，）的作用浓度，并用 的 诱导 细胞形成泡沫细胞；分别采用油红 染色和总胆固醇含量测定试剂盒，检测细胞内脂质沉积及总胆固醇含量；实时荧光定量 （，）及 检测三磷酸腺苷结合盒转运体 （，）、三磷酸腺苷结合盒转运体 （，）的 和蛋白表达变化；分别应用肝 受体（，）的激动剂 、，以及 抑制剂 进一步验证 肽调控 、表达的作用机制。结果 肽明显减少 细胞内脂质沉积，降低细胞内总胆固醇含量，上调 、和蛋白表达；肽上调 、的作用与 激动剂 、相似；加入抑制 基因转录的抑制剂 后，肽对 、的基因表达无上调作用。结论 肽可减少 巨噬细胞内脂质积聚，抑制泡沫细胞的形成，其作用机制可能与激活 通路有关。关键词：肽；细胞；脂质沉积；泡沫细胞；三磷酸腺苷结合盒转运体 ；三磷酸腺苷结合盒转运体 ；肝 受体开放科学（资源服务）标识码（）：动脉粥样硬化（，）是一种血管慢性炎症性疾病，是心脑血管疾病和外周血管疾病的病理基础。病理斑块主要由脂质、纤维和细胞组成。巨噬细胞和 细胞是参与动脉硬化斑块形成与发展的主要细胞类型 。的起因是血浆中含有载脂蛋白 （，）的脂蛋白被吸收并沉积在动脉内膜上，脂蛋白中的低密度脂蛋白（，）可被氧化或通过其他修饰而诱导动脉内膜上的内皮细胞活化，活化的内皮细胞募集单核细胞。一方面，单核细胞分化成促炎巨噬细胞，局部放大炎症反应；另一方面，巨噬细胞吞噬修饰的 ，形成泡沫细胞。动脉内膜泡沫细胞的出现是 斑块形成中不可缺少的一步，通常被认为是 的早期表现之一。泡沫细胞的形成主要是巨噬细胞摄取过量修饰的 或巨噬细胞内胆固醇流出障碍所致，因此，抑制巨噬细胞对胆固醇的摄取、促进巨噬细胞内胆固醇的流出，可减少巨噬细胞内胆固醇的沉积，防止泡沫细胞的形成，对于干预早期 具有重要意义 。在巨噬细胞中，三磷酸腺苷结合盒转运体 （，）和三磷酸腺苷结合盒转运体 （，）负责介导巨噬细胞内胆固醇流出。和 基因表达上调可促进巨噬细胞内胆固醇流出，抑制泡沫细胞的形成 。苦荞是蓼科（）荞麦属（）的一年生草本植物，分布于亚洲、欧洲及美洲，在中国主要种植在高寒的西北和西南山区。苦荞营养价值丰富，中国一直有将苦荞粉作为功能性食品或常规饮食，用于治疗心血管疾病和糖尿病的传统。苦荞中的苦荞蛋白，也具有预防高脂血症的作用。有研究发现，苦荞蛋白可明显降低仓鼠血浆总胆固醇水平，其效果优于大米蛋白和小麦蛋白 。肽来源于苦荞清蛋白，是课题组前期采用碱性蛋白酶酶解苦荞清蛋白，分离鉴定出的生物活性肽，具有抗氧化及调节炎症的作用，其氨基酸序列为 ，分子量为 。本研究以巨噬中国药理学通报 ；（）：细胞 为研究对象，采用氧化低密度脂蛋白（，）诱导泡沫细胞形成，观察 肽对巨噬细胞中脂质沉积的影响，并探讨其潜在作用机制，从而为寻找 肽的作用靶点及其应用开发提供实验依据。材料 细胞株 巨噬细胞，购自美国典型培养物保藏中心（，）。试剂 肽（纯度 ），由上海淘普生物科技有限公司合成；培养基、胎牛血清、胰蛋白酶，均购自美国 公司；、二甲基亚砜（，）、苯甲基磺酰氟（，）、油红 染料、蛋白浓度测定试剂盒，均购自索莱宝公司；肝 受体（，）激动剂 、，抑制剂 ，均购自 公司；购自广州奕源生物科技有限公司；青霉素 链霉素双抗购自 公司；总胆固醇（，）测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；聚合酶链式反应（，）引物，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；逆转录试剂盒、试剂盒，购自 公司；抗 兔多克隆抗体，购自 公司；抗 兔多克隆抗体、抗 小鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗，均购自武汉三鹰生物技术有限公司；化学发光液，购自上海碧云天生物技术有限公司。仪器 洁净工作台（江苏市金净净化设备科技有限公司）；二氧化碳培养箱（日本松下公司）；多功能酶标仪（美国 公司）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；扩增仪、凝胶成像仪（美国 公司）；超微量紫外分光光度计（公司）；台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）。方法 细胞培养 细胞常规培养于 高糖培养基（含 胎牛血清和 青 链霉素双抗）中，置于 、培养箱中培养。每天换液 次，待细胞融合度约为 时，使用胰酶消化、传代。细胞活力检测采用 法测定细胞活力。先观察 肽、对细胞增殖的影响，根据 结果筛选出 肽和 的最佳作用浓度，而后在相应的浓度范围内，检测 肽对 诱导 细胞活力的影响。将处于对数生长期的 细胞传代，调整细胞密度为 ，将细胞接种于 孔板。确定 肽和 作用浓度后，分组如下：空白组不接种细胞，不加 和 肽；对照组接种细胞，不加 和 肽处理；模型组接种细胞，并加入 的 ；肽组接种细胞，加入浓度分别为 、的 肽，以及 的 。于培养箱中孵育 后，弃培养基，每孔加入 ，继续孵育 后，弃上清，每孔加入 ，培养箱中孵育 后，使用酶标仪在波长 测定各孔的吸光度（，）值，计算细胞存活率：细胞存活率 （实验组 空白组）（对照组 空白组）。油红 染色取对数生长期的细胞，以 浓度接种于 孔板，培养 细胞贴壁后，参照文献 将细胞分为 组：对照组、模型组、肽低浓度组、肽高浓度组。对照组加入含 胎牛血清的 培养基，后换成无血清 培养基继续培养 ；模型组加入含 胎牛血清的 培养基培养 后，在无血清 培养基中加入 刺激 ；肽低浓度组和 肽高浓度组在含 胎牛血清的 培养基中分别加入 、的 肽干预 后，在无血清 培养基中加入 刺激 。培养结束后，弃培养液，用预冷的 洗 次，每孔加入 多聚甲醛固定 后，弃多聚甲醛，每孔加入 洗 次。然后每孔加入约 油红 染色工作液（油红 基液 ）染色 ，洗次，在光学显微镜下观察细胞脂质被油红 染色情况。细胞内 含量检测按照“”对细胞进行分组处理后，弃培养液，用预冷 洗 次，每孔加入 吹打细胞，使细胞充分脱落，并将细胞悬液收集于预先做好标记的 管中，离心 ，弃上清并留沉淀待用。细胞沉淀按照试剂盒说明书操作，测定各组 含量。、表达测定 按照“”对细胞进行分组处理后，弃培养液，用预冷中国药理学通报 ；（）洗 次，每孔加入 裂解细胞，并收集至 无 酶 管中，按照试剂盒说明书进行各组样品 提取、逆转录和定量检测。为实时荧光定量 引物序列，以 为内参基因，采用 法计算各组细胞 、的相对表达量：（目的基因 ）实验组（目的基因 ）对照组。（）（）：、蛋白表达的测定取对数生长期的细胞，以 的密度接种于 孔板中，培养 待细胞贴壁后，分为 组：对照组、模型组、肽低浓度组、肽高浓度组、激动剂 组、激动剂 组、抑制剂 组。对照组、模型组、肽低浓度组、肽高浓度组的处理方式同“”。激动剂 组与 激动剂 组在含 胎牛血清的 培养基中分别加入 和 作 用 ；抑 制 剂 组在含 胎牛血清的 培养基中加入 和 肽作用 ，然后组在无血清 培养基中加入 作用 ，收集细胞。激动剂和抑制剂的浓度参考文献 。各组细胞加入细胞裂解液（），冰上裂解 ，、离心 ，取上清液备用。蛋白质量浓度测定试剂盒检测各组蛋白浓度，制备 的分离胶和 浓缩胶，总蛋白 煮沸 后，进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿法转膜，牛血清白蛋白室温封闭 ，一抗 孵育过夜，二抗室温孵育 ，试剂盒显影。软件分析各条带的灰度值，以 为内参蛋白，目标蛋白的相对表达量 目标蛋白的灰度值 的灰度值。统计学分析所有实验均重复 次，各组实验数据以珋 表示。采用 软件进行统计学分析，通过单因素方差分析对多组数据之间的差异进行显著性检验，为差异具有显著性。利用 软件进行绘图。结果 肽、最佳浓度的选择及 肽对 诱导 细胞活力的影响采用 法检测 肽对 细胞活力的影响，如 所示，与对照组相比，、的 肽作用 细胞 后，各组细胞存活率无明显变化。提示 肽在 范围内，对细胞无明显毒性，可用于后续实验。如 所示，与对照组相比，、的 对细胞活力无明显影响；、的 可明显抑制 细胞活力（）。因此，选取 的 进行后续实验。（）（）（珋 ，）分别将 、的 肽与 （）共孵育后，与对照组相比，肽（、）可明显逆转 对 细胞的损伤（），细胞存活率可恢复至 以上（），说明 肽对 诱导的细胞损伤具有保护作用。因此，选用 、的 肽作为后续实验的浓度。肽对 诱导的 细胞脂质中国药理学通报 ；（）积聚的影响为了观察 肽是否会影响细胞脂质的沉积，采用 （）诱导 细胞形成泡沫细胞，并将 肽（、）与 共孵育，油红 染色法和 测定试剂盒检测细胞内脂质沉积情况。结果显示（），与对照组相比，与细胞共孵育后可明显增加细胞内 脂 质 沉 积，形 成 泡 沫 细 胞，肽 可 改 善 细胞内的脂质沉积，抑制泡沫细胞形成。各组细胞内 检测结果如 所示，与对照组 （珋 ，）；（珋 ，）：（）；：；，相比，诱导后可明显增加细胞内 的含量（），而 肽能明显降低细胞内 含量（，）。提示 肽可减少巨噬细胞的脂质沉积，抑制泡沫细胞的形成。肽对 诱导的 细胞 、表达的影响 和 介导的胆固醇流出减少是导致巨噬细胞脂质堆积的主要原因。为了揭示 肽抑制脂质堆积的潜在机制，检测了各组细胞中 、和蛋白表达。如 ，所示，与对照组相比，模型组 、表达明显降低（，）；与模型组相比，肽可明显上调 、表达（，）。，结果显示，肽能明显上调 和 蛋白表达。提示 肽可能通过上调 、的表达，促进胆固醇的流出，从而抑制 细胞内的脂质积聚。肽与 激动剂、抑制剂对 细胞 、表达的影响 和 是 的靶基因，其表达可被 激动剂调控。为进一步探究 肽调节 、基因表达的 机 制，分 别 采 用 激 动 剂 、及 抑制剂 与细胞共孵育。如 所示，与 模型组相比，肽与 激动剂 、均能明显上调 、和蛋白的表达（，）；而加入抑制 基因转录的抑制剂 后，肽不能上调 、和蛋白的表达。这些结果提示 肽可能是通过激活 ，从而上调 、的基因表达，但其具体的机制还需要进一步研究。讨论由于高脂饮食和不健康的生活方式，以血浆胆固醇增高为特点的高胆固醇血症的发生率在全世界内持续上升。血浆胆固醇，特别是 的增高是 发生的主要原因。食物胆固醇的摄取吸收、胆固醇的体内合成，以及胆固醇的分泌都会影响血浆胆固醇的水平。目前，已报道的降胆固醇肽的作用机制主要是减少外源性胆固醇的吸收、抑制体内胆固醇的生物合成及促进胆固醇转变成胆汁酸等 。在 形成的早期阶段，活化的内皮细胞募集单核细胞到内膜下，分化为巨噬细胞，巨噬细胞吞噬 引起细胞内脂质沉积，导致泡沫细胞形成。泡沫细胞形成的过程与巨噬细胞内胆固醇代谢密切相中国药理学通报 ；（）（珋 ，）：；：；：，；，（珋 ，）：；：；：，：；：；：；：；：；：；，；，中国药理学通报 ；（）关，其中，胆固醇从巨噬细胞内流出是调节巨噬细胞胆固醇动态平衡的关键环节之一，对减少细胞内胆固醇沉积、防止泡沫细胞形成、预防 具有重要意义。研究发现，减少巨噬细胞内脂质沉积可在早期干预 的 发 生 。本 研 究 通 过 诱 导 细胞形成泡沫细胞，发现 肽可以减少巨噬细胞内脂质的沉积，降低细胞内的 含量，说明 肽具有抑制泡沫细胞形成的作用。泡沫细胞的形成主要是由于细胞摄取胆固醇异常，或巨噬细胞胆固醇流出受损所致 。和 是一类膜蛋白，是 结合盒转运体（，）超家族中一员，可利用 水解释放的能量来转运底物，两者相互配合，共同完成巨噬细胞胆固醇的流出。的作用是将胆固醇和磷脂酰胆碱从巨噬细胞中转出，流向贫脂的载脂蛋白 ，生成新生高密度脂蛋白（，），而 则介导胆固醇、磷脂酰胆碱和鞘磷脂流向新生和成熟 。和 表达减少或功能丧失，促进泡沫细胞形成和 发生，而一些黄酮类物质，如二氢杨梅素可通过诱导 、的表达抑制泡沫细胞的形成 。本研究中，肽可明显上调 和 的基因表达，提示 肽降低 诱导的 细胞中胆固醇含量，可能是通过诱导 和 的表达，进而促进胆固醇从巨噬细胞流出。有 和 两种亚型，是类固醇激活的转录因子，属于类固醇 甲状腺激素核受体超家族成员。调控一系列涉及胆固醇吸收、转运和转化的基因转录，被称为胆固醇感受器。的转录调控功能需要与类视黄醇 受体（，）结合，形成 异二聚体才能发挥。无配体时，该异二聚体与核受体阻遏因子结合，抑制基因表达；当配体与之结合后，会导致异二聚体构象发生改变，释放出阻遏因子，并募集辅激活因子，与靶基因启动子区域内的特定 序列，即 反应元件结合，调节下游靶基因的转录 。在巨噬细胞中高表达，和 是 在巨噬细胞中的靶基因，调节胆固醇从巨噬细胞流出 。研究认为，激活 可增加外周胆固醇流出、促进胆固醇向肝转运及转变成胆汁酸、促进胆汁酸分泌等，从而降低血浆胆固醇水平，发挥抗 作用 。激活剂 通过氢键与 结合，募集 和辅激活因子结合，进而激活 ，对 和 均有激活作用；选择性与 结合，进而激活 。本研究结果发现，肽单独与巨噬细胞作用时，与 、一样，可明显上调 和 的表达，但先用 抑制 基因转录后，再与 肽作用，发现 肽对 、的上调作用消失，提示 肽可能是 的潜在激活剂，但其与 的具体作用机制还需要进一步研究。综上，肽可减少 诱导的 巨噬细胞的脂质积聚，减少细胞内的 含量，抑制泡沫细胞的形成，其机制可能是通过激活 ，上调 和 的表达介导的。本研究结果可为 肽的应用开发提供实验依据。参考文献：，（）：，：，：，（）：，（）：，（），（）：肖怡，左婕，邓艳，等苦荞蛋白源肽 对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的影响 食品科学，（）：，（）：，（）：，（），（）：，中国药理学通报 ；（），：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：，（），（）：杨安宁，王磊，周龙霞，等 、甲基化在 致 单核源性泡沫细胞胆固醇流出中作用研究 中国药理学通报，（）：，（）：，（）：，（）：，（，）：（），（）（）（）（），：；中国药理学通报 ；（）