贝莱斯芽孢杆菌12-5B的石油烃降解特性研究.pdf

年月J o u r n a l o fG r e e nS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y第 卷第 期收稿日期:基金项目:中国石油化工股份有限公司科技开发项目(编号:)作者简介:王岽(),男,博士,高级工程师,研究方向为土壤与地下水污染修复.贝贝莱莱斯斯芽芽孢孢杆杆菌菌 BB的的石石油油烃烃降降解解特特性性研研究究王 岽,王 亭,黄素秀,李昕卉(中石化(北京)化工研究院有限公司,北京 )摘要:由北京某加油站柴油污染土壤中筛选出一株高效石油烃降解菌 B,经 Sr D NA序列对比分析,鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bv e l e z e n s i s).在目标污染物正十六烷或柴油初始浓度约为 m g/L的无机盐培养基中,贝莱斯芽孢杆菌 B对上述种石油烃污染物均具有较好的降解能力,d去除率达到 以上.其最佳培养条件为温度 、p H和外加有机氮源.贝莱斯芽孢杆菌 B可在L B培养基中快速生长,高营养培养后可保持较高的石油烃降解能力,具备开展现场微生物修复的潜力.关键词:贝莱斯芽孢杆菌;石油烃;土壤;微生物修复中图分类号:X 文献标识码:A文章编号:()S t u d yo nP e t r o l e u mH y d r o c a r b o nD e g r a d a t i o nC h a r a c t e r i s t i c so fBv e l e z e n s i s BW a n gD o n g,W a n gT i n g,H u a n gS u x i u,L iX i n h u i(S I NO P E C(B e i j i n g)R e s e a r c hI n s t i t u t eo fC h e m i c a l I n d u s t r yC oL t d,B e i j i n g ,C h i n a)A b s t r a c t:Ah i g h l ye f f e c t i v ep e t r o l e u mh y d r o c a r b o nd e g r a d i n gb a c t e r i u ms t r a i n Bw a s i s o l a t e d f r o mad i e s e l c o n t a m i n a t e ds o i l s a m p l eo f g a s s t a t i o n i nB e i j i n g T h e s t r a i nw a s i d e n t i f i e da sBv e l e z e n s i sb y Sr R NAg e n es e q u e n c ea n a l y s i s I th a sg o o da b i l i t yo nd e g r a d i n gp e t r o l e u mh y d r o c a r b o nw i t ham o r et h a n r e m o v a l e f f i c i e n c y i nd a y s i na n i n o r g a n i cs a l tm e d i u m w i t ha ni n i t i a l c o n c e n t r a t i o no f t a r g e tc o n t a m i n a n t(n h e x a d e c a n eo rd i e s e l)a t a b o u t m g/L T h eb e s tc u l t u r ec o n d i t i o n so fBv e l e z e n s i s Bw e r e t h e t e m p e r a t u r eo f ;t h ep Ho fa n dd o s i n go r g a n i cn i t r o g e ns o u r c e Bv e l e z e n s i s Bg r e wq u i t e f a s t i na nL Bc u l t u r e,a n dm a i n t a i n e di t sh i g hp e t r o l e u mh y d r o c a r b o nd e g r a d i n ga b i l i t ya f t e rc u l t u r i n gw i t hg o o dc a r b o ns o u r c e s I t h a s t h ep o t e n t i a l t ob eu s e d i n t h eb i o r e m e d i a t i o no f p e t r o l e u mh y d r o c a r b o n c o n t a m i n a t e ds i t e K e yw o r d s:Bv e l e z e n s i s;p e t r o l e u mh y d r o c a r b o n;s o i l;b i o r e m e d i a t i o n 引言石油烃是土壤环境中最普遍的有机污染物,通常包括各类脂肪烃、芳香烃,及少量含有O、S、N等元素衍生物,主要来自化石能源相关的开采、生产和使用过程.常见的来源有原油、汽油、煤油、柴油、润滑油、石蜡、沥青等,不同馏分的石油烃会给生态环境和人体健康带来不同的危害,.主要表现在,附着在植物根系表面形成黏膜,阻碍植物根系正常呼吸和养分吸收;造成土壤团聚和营养成分流失,影响农作物生长;具有一定毒性,易随食物链累积,危害各类动物和人体健康.石油烃污染土壤的修复方法通常可分为物理法、化学法和生物法.近年来,随着环保观念的日益普及,土壤修复技术也开始向绿色、可持续方向发展,微生物修复技术受到了更广泛的关注.目前,土壤微生物修复技术还存在可用菌种数量少、修复效率较低、微生物修复应用案例和经验少等缺陷,亟待提升高效菌种的工程化应用数量.芽孢杆菌(B a c i l l u s)是土壤中的常见菌属,已知有不少种对石油烃有降解作用,但对于贝莱斯芽孢杆菌(Bv e l e z e n s i s)在石油烃降解方面的报道很王岽,等:贝莱斯芽孢杆菌 B的石油烃降解特性研究绿色创新研究:工程与技术少.Bv e l e z e n s i s是B a c i l l u s属的一个新种,在农业上具有促进植物生长和抑制植物病原菌的作用,具有很大的用作生防制剂的潜力.Bv e l e z e n s i s含有丰富的蛋白酶和纤维素酶,在饲料添加剂、洗涤剂和造纸行业具有良好的应用前景.在生物医学方面,Bv e l e z e n s i s及其胞外多糖对改善机体免疫力和抗癌细胞增殖上有显著作用,.本文从来自加油站的柴油污染土壤中筛选出株Bv e l e z e n s i s,并对其石油烃降解特性进行了研究,以期为石油烃污染土壤的微生物修复提供菌种材料及基础数据支撑.材料与方法 实验材料实验菌种提取自北京某加油站柴油污染土壤.实验目标污染物:正十六烷,分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;柴油,取自北京某加油,比重 g/m L.其他实验试剂均为分析纯.实验仪器:HY GC型多功能摇床,太仓市实验设备厂;L XB L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器,合肥华泰医疗设备有限公司;B C V F D型洁净工作台,上海一恒科学仪器有限公司;R O T I NA R型离心机,德国H e t t i c h科学仪器公司;P H S C型p H计,上 海 盛 磁 仪 器 有 限 公 司;N型气相色谱仪,美国安捷伦公司.培养基无机盐培养基:NHC l,g;N a NO,g;M g S O HO,g;C a C l,g;KH P O HO,g;KHP O,g;F e C l HO,g;去离子水,L;p H值 .牛肉膏蛋白胨培养基:N a C l,g;蛋白胨,g;牛肉膏,g;琼脂,g;去离子水,L;p H值 .L B培养基:N a C l,g;胰蛋白胨,g;酵母提取物,g;去离子水,L;p H值 .实验方法 菌种筛选与鉴定将g实验土壤加入到 m L含正十六烷的无机盐培养基中,在 、r/m i n条件下振荡培养d,按转接,富集培养代.取富集后的培养液m L稀释涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上,恒温培养,待平板长出菌落,挑取不同形态的单菌落,重新接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上划线纯化,重复以上步骤次.观察菌落的生长状况和形态特征,通过扫描电子显微镜下观察菌株的菌体形态.采用 Sr D NA序列分析方法鉴定菌株.菌株石油烃降解性能评价将分离纯化后的菌株在L B液体培养基中培养 h;菌液于 r/m i n下离心m i n,弃去上清液;菌体以同体积无菌生理盐水洗涤次,配制成菌悬液.按接种量加入含目标污染物的无机盐培养基中,初始O D 控制在 左右.调节培养基p H值至,在 、r/m i n条件下振荡培养,观察记录菌株生长情况,定期检测菌液的石油烃(C C)浓度和O D .分析方法以正己烷萃取菌液中的石油烃,萃取液经脱水、浓缩、净化后,做气相色谱仪检测.气相色谱条件为:进样口温度 ,不分流进样;柱温初始温度 保持m i n,以 /m i n速率升至 ,再以 /m i n速率升至 保持 m i n;高纯氮气流量 m L/m i n,氢气流量 m L/m i n,空气流量 m L/m i n;检测器温度 ;进样量 L.结果与讨论 菌株鉴定结果自污染土壤中分离筛选出石油烃降解菌多株.如图(a)所示,命名为 B的菌株在固体培养基平板上的菌落形态规则,呈白色,布满长鞭毛,菌落表面干燥粗糙,不透明.图(b)和图(c)为 B在扫描电镜和透射电镜下的微观形态,细胞大小约为m.图石油烃降解菌 B的形态 年月绿 色 科 技(J o u r n a l o fG r e e nS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y)第 期将 菌株 B的 Sr D NA测 序 结 果 进 行N C B I B L A S T比对,使用ME GA X进行序列同源性分析并绘制系统发育树,结果见图.图石油烃降解菌 B的系统发育树如图所 示,石 油 烃 降 解 菌 B与Bv e l e z e n s i s 同源性最高.根据 Sr DNA序列分析结果,结合形态及生理生化特性,将石油烃降 解 菌 B鉴 定 为 贝 莱 斯 芽 孢 杆 菌(Bv e l e z e n s i s).芽孢杆菌属中有不少种可降解石油烃,如枯草芽孢杆菌(Bs u b t i l i s),、解淀粉芽孢杆 菌(Ba m y l o l i q u e f a c i e n s)等,但 对Bv e l e z e n s i s降解石油烃的报道较少.U l l a h等 从港口鱼类中分离出株Bv e l e z e n s i s,发现其对原油组分C 的降解效果很好,对其他组分也有一定降解效果.李宸榕等 由油泥中分离出株Bv e l e z e n s i s,几乎可将原油组分中的C、C 和C 完全降解,对于其他C C 的长碳链组分降解率也达到,但对CC 组分的降解能力很低.说明Bv e l e z e n s i s对于长碳链原油组分具备较高的降解潜力.本研究从菌株来源入手,着重考察了Bv e l e z e n s i s对柴油及其主要组分的降解能力.石油烃降解效率以正十六烷和柴油为目标污染物,考察了Bv e l e z e n s i s B对石油烃的降解效果.实验温度为,p H值控制在左右,培养基中正十六烷的初始浓度为 m g/L,柴油初始浓度为 m g/L,结果见图.图Bv e l e z e n s i s B对石油烃的降解效果由图(a)可以看出,Bv e l e z e n s i s B在前d对正十六烷的降解速度较慢,第d时降解率不足 ,随后降解速率大幅提升,至第d达到 以上;而O D 增长则呈现相反的态势,在第d到第天增长较快,随后生长速度下降,至第dO D 达到 .由图(b)可以看出,当柴油初始浓度为 m g/L时,Bv e l e z e n s i s B在前d对柴油的降解速度较快,第d时降解率已达 以上,随后降解速率大幅提升,至第d达到 ;而O D 仅在第d增长较快,其余时间上升较慢,至第dO D 不足 .石油烃降解条件优化 温度温度通过影响酶活性和改变培养基理化性质直接或间接影响微生物对石油烃的降解效果,不同微生物对石油烃降解的最佳温度范围也不同.以正十 六 烷 和 柴 油 为 目 标 污 染 物,考 察 了Bv e l e z e n s i s B在不同温度下的石油烃降解效果,实验时间为d,目标污染物初始浓度及其他实验条件与 节相同,结果见图.图温度对Bv e l e z e n s i s B降解石油烃效果的影响王岽,等:贝莱斯芽孢杆菌 B的石油烃降解特性研究绿色创新研究:工程与技术由图(a)可以看出,当温度为 时,Bv e l e z e n s i s B对正十六烷的降解效率很高,去除率达到;当温度为 、和 时,正十六烷去除率较低;O D 在温度为 时正十六烷去除率远高于其他温度.由图(b)可以看出,当温度为 时,Bv e l e z e n s i s B对柴油的降解效率最高,去除率达到 以上;在、和 时,对柴油的去除效果也很好;仅当温度继续上升至 时,柴油去除率较下降;O D 变化与柴油去除率变化呈相同趋势.p H值环境p H值变化会影响酶的活性和营养物质的吸收,从而影响微生物的生长及其对污染物的降解能力.多数菌种在p H值中性条件下生长良好,不同菌株对p H值的适应范围有一定差别.以正十六烷和柴油为目标污染物,考察了Bv e l e z e n s i s B在不同温度下的石油烃降解效果,实验时间为d,目标污染物初始浓度及其他实验条件与 节相同,结果见图.图p H值对B v e l e z e n s i s B降解石油烃效果的影响由图(a)可以看出,当p H时,Bv e l e z e n s i s B对正十六烷的降解效率最高,去除率达到 以上;其余p H值条件下,对正十六烷降解效果均不理想.由图(b)可以看出,当p H值为 时,Bv e l e z e n s i s B对柴油的降解效果较好,去除率达到 以上;当p H值降至时,柴油去除率仅为;说明酸性环境对 B降解柴油有一定抑制作用.氮源以正十六烷和柴油为目标污染物,选择了氯化铵、尿素、硝酸钠、蛋白胨和酵母膏种氮源,以等量增加氮源用量的方式,考察了无机盐培养基中不同氮源对Bv e l e z e n s i s B石油烃降解效果的影响,氮源投加量(以N计)为 g/L,实验时间为 d,目标污染物初始浓度及其他实验条件与 节相同,结果见图.图不同氮源对Bv e l e z e n s i s B降解石油烃效果的影响从图(a)可以看出,不同氮源对Bv e l e z e n s i s B降解正十六烷的效果有一定影响.与空白相比,增投氯化铵和硝酸钠对正十六烷去除率影响不大;增投有机氮源蛋白胨和酵母可提升正十六烷的降解效果,且O D 更高,可能是有机氮源中的氮素和其他有机成分更易为Bv e l e z e n s i s B所利用;而增投尿素对Bv e l e z e n s i s B的生长有抑制作用,正十六烷去除率小于.从图(b)可以看出,除硝酸钠外其他氮源对柴油的降解均有促进作用,仍以增投有机氮源时的柴油的去除效果为最好.增投尿素并未抑制Bv e l e z e n s i s B的生长及其对柴油的降解,说明针对不同碳源,对氮源种类和用量的选择可能会有所不同.扩大化培养潜力在土壤生物强化修复中,菌剂的制备及制备后菌种的活性保持是确保修复成功的关键环节.为明确由Bv e l e z e n s i s B大规模制备菌剂的可行性,以L B培养基考察了Bv e l e z e n s i s B的 年月绿 色 科 技(J o u r n a l o fG r e e nS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y)第 期扩大化培养潜力,其生长曲线见图.图Bv e l e z e n s i s B在L B培养基中的生长曲线由图可 以 看 出,在 开 始 的 h左 右,Bv e l e z e n s i s B的生长速度有一定延迟;经历适应期后Bv e l e z e n s i s B开始迅速生长,至 h菌株均达到 以上的最大O D 值.其后,随着培养基中的营养物质快速耗尽,O D 呈缓慢下降趋势.可以预见,若能及时补充足量营养物质,菌株当可继续快速生长,说明Bv e l e z e n s i s B具有良好的扩大化培养和菌剂制备潜力.将以L B培养基培养后的Bv e l e z e n s i s B多次重复为期 d的柴油降解实验,柴油去除率均可达到 以上,表明Bv e l e z e n s i s B具备扩培后开展现场微生物修复的可行性.结论()从柴油污染土壤中分离筛选得到石油烃降解菌株 B,经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B a c i l l u sv e l e z e n s i s).()Bv e l e z e n s i s B对正十六烷和柴油均具有较好降解能力,d去除菌率达到 以上;Bv e l e z e n s i s B生长和对石油烃降解的最佳条件为温度、p H和外加有机氮源.()Bv e l e z e n s i s B在L B培养基中的生长速度较快,具有良好的扩大化培养潜力;高营养培养后可保持较高的石油烃降解能力,具备后续开展现场微生物修复的可行性.参考文献:曹云者,施烈焰,李丽和,等石油烃污染场地环境风险评价与风险管理J生态毒理学报,():张皓辉,史俊祥,姜永海,等某污染场地地下水石油烃的健康风险评估及其微生物群落分析J环境科学研究,():申家宁,晏井春,高卫国,等多相抽提技术在化工污染地块修复中的应用潜力J环境工程学报,():赵小航,戈丹妮,向修传,等气相抽提技术在炼化土壤修复中的工程试验研究J当代化工,():陈思莉,易仲源,王骥,等淋洗抽提技术修复柴油污染土壤及地下水案例分析J环境工程,():郑嘉如,方战强,易云强,等基于化学氧化法修复石油烃污染土壤研究进展J环境化学,():章生卫,程小谷,于李罡,等石油烃污染地下水原位化学氧化修复研究J环境科学与技术,(S):任军贤,徐佰青,单广波,等热活化过硫酸盐氧化污染土壤中的石油烃J土壤,():钟磊,卿晋武,陈红云,等微生物修复石油烃土壤污染技术研究进展J生物工程学报,():Y a n gY,Z h a n gZ W,L i uR X,e ta l R e s e a r c hp r o g r e s si nb i o r e m e d i a t i o no fp e t r o l e u mp o l l u t i o nJE n v i r o n m e n t a lS c i e n c ea n dP o l l u t i o nR e s e a r c h,:F e n gLY,J i a n gXP,H u a n gYN,e t a l P e t r o l e u mh y d r o c a r b o nc o n t a m i n a t e d s o i l b i o r e m e d i a t i o na s s i s t e db y i s o l a t e db a c t e r i a l c o n s o r t i u ma n ds o p h o r o l i p i dJE n v i r o n m e n t a lP o l l u t i o n,():D i k eCC,H a k e e mIG,R a n iA,e t a l T h e c o a p p l i c a t i o no fb i o c h a rw i t hb i o r e m e d i a t i o nf o rt h er e m o v a lo fp e t r o l e u mh y d r o c a r b o n sf r o mc o n t a m i n a t e ds o i lJS c i e n c eo ft h eT o t a lE n v i r o n m e n t,():H o uDY S u s t a i n a b l eR e m e d i a t i o n i nC h i n a:E l i m i n a t i o n,I m m o b i l i z a t i o n,o rD i l u t i o nJ E n v i r o n m e n t a l S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y,():D e v i S,K i e s e w a l t e rH T,K o v c sR,e ta l D e p i c t i o no fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e sa n da n t i f u n g a l a c t i v i t yo fB a c i l l u s v e l e z e n s i sD TU J S y n t h e t i ca n dS y s t e m sB i o t e c h n o l o g y,():M a h g o u bA M,M a h m o u dM G,S e l i m M,e ta l E x o p o l y s a c c h a r i d e f r o m m a r i n eB a c i l l u s v e l e z e n s i sMHM i n d u c e sa p o p t o s i so fh u m a nb r e a s tc a n c e rMC Fc e l l st h r o u g ham i t o c h o n d r i a lp a t h w a yJ A s i a nP a c i f i c J o u r n a l o fC a n c e rP r e v e n t i o n,():R e h m a nNU,A b e dR M M,H u s s a i nH,e t a l A n t i p r o l i f e r a t i v ep o t e n t i a l o fc y c l o t e t r a p e p t i d e sf r o mB a c i l l u s v e l e z e n s i sRA a n dt h e i rm o l e c u l a rd o c k i n go nGp r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o r sJM i c r o b i a lP a t h o g e n e s i s,:国家环境保护部水质 可萃取性石油烃(C C)的测定 气相色谱法:H J S北京:国家环境保护部,董丁,卢彦珍,唐美华,等一株石油烃高效降解菌的筛选及降解性能研究J南京工业大学学报(自然科学版),():,牛志睿,山宝琴,刘羽响应面法优化石油降解菌性能的研究J环境工程学报,():S h a r m aR,S i n g hJ a g d i s h,V e r m aN e e l a m P r o d u c t i o n,c h a r a c t e r i z a t i o n a n d e n v i r o n m e n t a la p p l i c a t i o n s o f b i o s u r f a c t a n t sf r o mB a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n sa n dB a c i l l u s s u b t i l i sJ B i o c a t a l y s i s a n dA g r i c u l t u r a lB i o t e c h n o l o g y,:U l l a hS,A l iN,D a w a rFU,e t a l B i o d e g r a d a t i o no f p e t r o l e u mb yb a c t e r i a i s o l a t e df r o mf i s h e so fI n d i a nO c e a nJB r a z i l i a nJ o u r n a l o fB i o l o g y,(e ):李宸榕,周皓杰,宋天顺,等石油降解菌的筛选与菌群构建J南 京 工 业 大 学 学 报(自 然 科 学 版),():