北疆地区马链球菌分离鉴定及耐药性和毒力基因分析.pdf

研究论文Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为了解新疆北疆地区马匹感染链球菌的种类及耐药性及毒力基因携带情况，本实验在昌吉及伊犁马场共采集132份马鼻拭子样品进行链球菌的分离培养，采用标准K-B纸片扩散法进行药敏实验；设计14对引物，对6个耐药基因检测；用特异性PCR检测链球菌相关的7个毒力基因。结果显示，共分离出24株链球菌，其中肺炎链球菌2株，马链球菌马亚种9株，经过药敏实验，分离菌株对青霉素耐药率为72.41%，对头孢他啶、四环素、强力霉素等种药的耐药率超过50%以上。耐药基因blaTEM、qnrA阳性率分别为66.7%、12.5%；毒力基因fneB、lytA、ply的阳性率分别为37.5%、33.3%、12.5%。本实验中发现1株链球菌（HW5-1-2）和1株马链球菌（Y1）为多重耐药菌株，同时携带耐药基因qnrA和blaTEM，其中Y1同时携带毒力基因fneB。3株马链球菌马亚种D1、D2、D3同时携带毒力基因ply，lytA及fneB。研究结果表明，北疆地区马链球菌分离株的耐药性及多重耐药较严重，耐药基因和毒力基因分布较广泛。关键词：链球菌分离鉴定；马链球菌马亚种；耐药基因；毒力基因中图分类号：S852.61 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）03-0034-07Isolation,Identifi cation,Drug Resistance and Virulence Genes of Streptococcal Strains from Northern Xinjiang收稿日期：2021-04-08基金项目：国家自然科学基金青年项目（32002322）作者简介：孙丹岚，女，硕士研究生，兽医临床学专业；买占海，男，博士研究生，临床兽医学专业通信作者：况玲，E-mail：北疆地区马链球菌分离鉴定及耐药性和毒力基因分析孙丹岚，买占海，佟盼盼，陈见兴，罗 洁，张 磊，布阿依夏木吾斯曼，况 玲（新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052）2023,31(3):34-40Abstract:The objective of the present study was to understand the species,drug resistance and virulence genes of streptococcal strain in Northern Xinjiang.Total 132 nasal swabs were collected from horses on Changji and Yili farms for streptococcal isolation.As a result,24 streptococcal strains were isolated,including 2 strains of Streptococcus pneumoniae and 9 strains of Streptococcus equi.These strains were tested for drug resistance using standard Kmurb disk diffusion method.The results showed that 72.41%stains were resistant to penicillin,over 50%strains to ceftazidime,tetracycline,doxycycline and other drugs.Furthermore,14 pairs of primers were designed to detect 6 drug resistance genes.The positive rates of drug resistance genes blaTEM and qnrA were 66.7%and 12.5%,respectively.Seven virulence genes related to Streptococci were detected by specifi c PCR.The positive rates of virulence genes fneB,lytA and ply were 37.5%,33.3%and 12.5%,respectively.In this experiment,one strain of Streptococcus(HW5-1-2)and one strain of Streptococcus equi(Y1)were found multidrug resistant.HW5-1-2 strain carried drug resistance genes qnrA and blaTEM and Y1 strain carried virulence gene fneB.Three Streptococcus equi strains D1,D2 and D3 carried virulence genes ply,lytA and fneB.These results showed that Streptococcus equi isolates from Northern Xinjiang were drug resistant and the drug resistance genes and virulence genes were widely distributed.Key words:Streptococcus;Streptococcus equi;drug resistance gene;virulence genesSUN Danlan,MAI Zhanhai,TONG Panpan,CHEN Jianxing,LUO Jie,ZHANG Lei,BUAYIXIAMUWusman,KUANG Ling(College of Veterinary Medicine Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)35 孙丹岚等：北疆地区马链球菌分离鉴定及耐药性和毒力基因分析第 31 卷第 3 期链球菌种类繁多，有的属于动物正常菌群，而有的是致病菌，如化脓性链球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌等，可引起动物的肺炎、败血症、脑膜炎、乳腺炎等，给畜牧养殖业和公共卫生造成严重威胁。肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,SP）发现于1881年，是各种感染如社区获得性肺炎、中耳炎、脑膜炎、脓肿、败血症等的主要致病菌之一，尤其对于婴幼儿和老年人，其中肺炎、败血症和脑膜炎致死率较高1。SP有超过90种血清型，且目前的疫苗不能完全覆盖2-3。SP携带多种毒力基因，其导致各种感染疾病的具体机制有待明确，毒力基因在此过程中可能具有重要作用，这种作用可能体现在毒力基因的有无和表达水平两个方面4-6。马链球菌（Streptococcus equi,S.equi）属于兰氏分群的C群溶血链球菌，包括兽疫亚种（Streptococcus equi subspecies zooepidemicus,SEZ）、马亚种（Streptococcus equi subspecies equi,SEE）和类马亚种（Streptococcus equi subspecies ruminatorum,SER）三个不同的亚种7。马腺疫（Strangles）是一种散发性或地方流行性的马属动物接触性传染病，该病以发热、上呼吸道黏膜炎症、颌下淋巴结肿胀化脓为典型特征8。带菌马已被认为是维持病原体长期存在和暴发感染的重要因素9。其发病率可达100%，死亡率达10%10。病菌随病马喷鼻、咳嗽及脓肿破溃排出体外，经消化道、上呼吸道黏膜、扁桃体或受损皮肤感染健康马匹11。患病幼驹也可因吮乳，将细菌传染给母马，引起马乳房炎，甚至引发败血症12。马链球菌的致病性和耐药性研究在国内研究较少，常见的毒力基因有fneB13，临床常用青霉素、四环素和磺胺类药物等进行治疗14，同时，耐药链球菌的出现也导致基层马场遭受很大经济损失，临床用药亟需新的思路。本实验通过对马场采集样品进行细菌分离培养，利用药敏实验和PCR检测，测定并分析马链球菌及其他链球菌的耐药性和毒力基因，从而为基层马场临床用药提供参考。1 材料与方法1.1 菌种来源 24株链球菌分离自2019年9月至2020年4月昌吉及伊犁马场的132份健康及患病马匹马鼻拭子样本。1.2 主要试剂 THB培养基购自青岛高科技工业医海博生物技术有限公司；革兰氏染色试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司；药敏纸片：青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢他啶、头孢噻肟、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、强力霉素、恩诺沙星、磺胺甲基异恶唑购自杭州滨和生物公司。1.3 细菌分离培养与纯化 无菌状态下吸取采集的马鼻拭子样品1 mL加入到3 mL THB液体培养基中，在37、160 rpm的摇床中震荡培养1224 h，进行增菌培养。用接种环沾取菌液在THB固体培养基上进行平板划线接种，倒置于37的恒温培养箱中过夜培养，观察菌落形态，挑取针尖大小的菌落继续培养。一般需要提纯3次或3次以上，直到培养基菌落单一、稳定为止。1.4 菌株的形态观察 显微镜观察挑取纯化的单菌落进行革兰氏染色，在油镜（100）下观察其形态特征。1.5 菌株的PCR鉴定及测序 以提取的分离菌株基因组DNA为模板，用16S RNA通用引物，进行PCR扩增。PCR反应体系（50 L）为：上、下游引物各2 L，DNA模板2 L，2 Taq PCR Green Mix 25 L，ddH2O补至50 L。用凝胶成像分析系统观察结果。扩增条件为：95预变性5 min；95变性30 s，49退火30 s，72延伸30 s，共35个循环。目标条带大小为197 bp。将鉴定有目标条带的PCR产物测序。1.6 药敏实验 采用标准K-B纸片扩散法，检测分离菌株对青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢他啶、头孢噻肟、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、强力霉素、恩诺沙星、磺胺甲基异恶唑12种抗生素的敏感性。1.7 菌株耐药基因及毒力基因的检测 通过PCR和琼脂糖凝胶电泳分析从链球菌中提取的DNA，确定是否存在耐药基因或毒力基因。根据相关文献报道和现有研究，选取流行率较高的基因15-17。耐药基因分别为：耐-内酰胺类（blaTEM、blaCTX-M）、耐四环素类（tetA）、耐磺胺类（SulI）、耐喹 36 中国动物传染病学报2023 年 6 月诺酮类（qnrA、aac(6)）。以上6个耐药基因PCR扩增引物序列和反应运行参数见表2。毒力基因分别为：ply、pspA、nanA、psaA、lytA、seM、fneB。以上7个毒力基因PCR扩增引物序列和反应运行参数见表2。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系（20 L）为：2 Taq PCR Green Mix 10 L，上、下游引物1 L，DNA模板1 L，ddH2O补至20 L。用凝胶成像分析系统观察结果，胶回收产物于-20保存备用。表 1 PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences for PCR基因Genes引物序列（5-3）Primer sequences(5-3)退火温度（）Annealing temperature()片段大小（bp）Length(bp)blaTEMF：ATGAGTATTCAACATTTCCGT56861R：TTACCAATGCTTAATCAGTGAblaCTX-MF：ATGTGCAGYACCAGTAARGT59593R：TGGGTRAARTARGTSACCAGAtetAF：GCTACATCCTGCTTGCCTTC60210R：CATAGATCGCCGTGAAGAGGsulIF：CGGCGTGGGCTACCTGAACG69433R：GCCGATCGCGTGAAGTTCCGqnrAF：ATTTCTCACGCCAGGATTTG54516R：GATCGGCAAAGGTTAGGTCAaac(6)F：CCCGCTTTCTCGTAGCA48482R：TTAGGCATCACTGCGTCTTCplyF：CCCACTCTTCTTGCGGTTGA55209R：TGAGCCGTTATTTTTCATACTGpspAF：CATAGACTAGAACAAGAGCTCAAA551200R：CTACATTATTGTTTTCTTCAGCAGnanAF：CAGTGATAGAAAAAGAAGATGTTG55500R：ATTATTGTAAACTGCCATAGTGAApsaAF：CTTTCTGCAATCATTCTTG52838R：GCCTTCTTTACCTTGTTCTGClytAF：TGAAGCGGGATTATCACTGGC50273R：GCTAAACTCCCTGTATCAAGCGfneBF：TTTAGGAGCGTCATCATCGTTAGG49435R：TCAGGTGGCAAGGAAGAGGTCseMF：TTTGGATCCAAATCTCAACAAGAAATGCTT51201R：AAAGTCGACTTACATCTTAGCTGCTTTTTCTTT16S RNAF：AGAGTTTGATCCTGGCTAG49197R：GGTTACCTTGTTACGACTT2 结果2.1 培养结果 链球菌在THB固体培养基平板上培养，直径0.11.0 mm，灰白色，表面光滑，边缘整齐的小菌落。马链球菌在绵羊血平板上长出针尖大小白色菌落，有溶血环（图1）。2.2 镜检结果 菌体呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌，直径0.61.0 m。菌体似矛头状排列单个或多个排列成链状，无芽孢、无菌毛（图2）。图 1 马链球菌马亚种在绵羊血培养基上的菌落形态Fig.1 Colony morphology of Equi on sheep blood 37 孙丹岚等：北疆地区马链球菌分离鉴定及耐药性和毒力基因分析第 31 卷第 3 期2.3 PCR结果 根据目的条带显示，对采集样品进行PCR鉴定，共得到24株链球菌。图3为其中两株菌的结果。1 2 3 M19720001000750500250100bp图 3 链球菌 16S PCR 扩增结果Fig.3 Amplifi cation results of Streptococcus 16S PCRM:DNA相对分子质量标准(DL2000);12:样品;3:阴性对照M:DL2000 DNA marker;1-2:Samples;3:Negative control2.4 测序结果 对在197 bp目的条带下的11株菌进行测序，通过测序确定9株马链球菌马亚种（Y1、Y2、Y3、D1、D2、D3、L1、L2、L3），两株肺炎链球菌（0-1，35-61）。2.5 药敏结果 24株链球菌对12种抗菌药物的耐药情况由表2和表3可见，本实验所分离的肺炎链球菌对强力霉素、青霉素的耐药率很高，对四环素、头孢他啶的耐药率也较高，对磺胺甲基异恶唑、恩诺沙星、氨苄西林、氯霉素都较为敏感。所分离的马链球菌对磺胺甲基异恶唑耐药性较高，对氨苄西林、头孢噻肟、四环素的耐药性也超过半数，对氯霉素、头孢氨苄、头孢他啶、庆大霉素、强力霉素的耐药性较低，对红霉素、恩诺沙星敏感。表 2 链球菌对常见菌药敏实验结果Table 2 Results of drug sensitivity test of Streptococcus to common bacteria菌株编号Strains耐药表型Resistant phenotype33-2DO-ERY-TE-CN-CTX-SAM-PEN696SXT-DO-TE-PEN68/12DO-TE-PEN168-1-2-11 CAZY526-1-2CAZZ72-2SXT-CAZHW5-1-2SXT-CN-SAM-PEN1482-2-2SXT-DO-TE-CN-CTX-CAZ-PEN4081-1-2-2 SXT-ENR-DO-CN-ERY-CHL-TE-CTX-CAZ-PEN6917-2SXT-DO-CN-TE-CAZ-PEN1482-2-1SXT-DO-TE-CN-CAZ-PEN4081-1-2-1 SXT-DO-ERY-CHL-TE-PEN35-61DO0-1/3082-2-2SXT-DO-CN-ERY-CHL-TE-CTX-CAZ-PEN表 3 马链球菌对常见菌药敏实验结果Table 3 Drug sensitivity test results of Streptococcus equi to common bacteria菌株编号Strains耐药表型Resistant phenotypeL1SXT-DO-CN-CHL-TE-CTX-SAM-PENL2TE-CTX-SAM-PENL3TED1SXT-CN-CHL-TED2SXTD3/Y1SXT-CTX-SAM-PENY2SXT-CTX-CAZ-SAM-PENY3SXT-CHL-TE-CN-CTX2.6 耐药基因检测结果 对鉴定出的24株链球菌分离株进行6种耐药基因检测，检测结果如表4所示，除blaCTX-M、tetA、SulI和aac(6)基因外，其余2种耐药基因均有检测到。其中blaTEM基因在17个菌株中均被检出，对各菌株耐药基因组合分布进行统计，含有2个以上耐药基因的菌株有2株（8.3%），其余7株菌未检测出任何耐药基因（表4）。部分阳性结果见图4、图5。图 2 链球菌革兰氏染色镜检结果（100）Fig.2 Microscopic examination of Streptococcus by Gram staining(100)38 中国动物传染病学报2023 年 6 月2.7 毒力基因检测结果 对鉴定出的24株链球菌分离株进行7种毒力基因检测，检测结果可知，除pspA、nanA、psaA和seM基因外，其余3种毒力基因均有检测到。其中lytA和fneB基因分别在8个和9个菌株中均被检出，对各菌株毒力基因组合分布进行统计，含有3个以上毒力基因的菌株有3株（12.5%），其余10株菌未携带毒力基因（表5）。部分阳性结果见图68。3 讨论马亚种马链球菌是马腺疫的主要病原，在马和驴的脓肿淋巴结中也曾分离出，马链球菌的致病性耐药性研究在国内研究较少，本研究分离出的链球菌中，有9株马链球菌，其中D1、D2、D3、L1、L2、L3 6株马链球菌来自昌吉某马场，Y1、Y2、Y3 3株菌来自伊犁某马场，Neamat-Allah等17认为马腺疫全年发病，但在春季发病率较高，Radostits等18研究得出马腺疫多发生于寒冷季节的结论，本研究的样品为秋季和春季末采集。本实验分离出的肺炎链球菌和马链球菌马亚种，样品均采样自昌吉某马场。分离出的马链球菌马亚种中有1株对庆大霉素、氯霉素耐药；有5株对四环素耐药；有5株对头孢噻肟耐药；有1株对头孢他啶耐药；有4株对氨苄西林耐药。根据耐药基因的结果，24株菌株中，有17株携带-内酰胺类耐药基因blaTEM，说明在链球菌中blaTEM基因有较高携带几率，其中1株链球菌（HW5-1-2）和1株马链球菌（Y1）同时携带了喹诺酮类耐药基因qnrA，为多重耐药菌株。经过耐药表型和耐药基因数据的对照可知，耐药表型与耐药基因表 4 不同菌株的耐药基因检测情况Table 4 Detection of drug resistance genes耐药基因Resistance genes菌株编号Strains菌种数Number of strainsblaTEM33-2、696、68/12、168-1-2-11、Y526-1-2、1482-2-2、4081-1-2-2、6917-2、1482-2-1、4081-1-2-1、35-61、0-1、3082-2-2、Y2、Y315qnrAblaTEMHW5-1-2、Y12/Z72-2、L1、L2、L3、D1、D2、D37“/”表示未检测出耐药基因“/”means no resistance genes have been detected图 4 blaTEM基因检测结果Fig.4 blaTEM gene detection resultsM:DNA相对分子质量标准(DL2000)1:阴性对照;2:阳性对照;35:样品M:DL2000 DNA marker1:Negative control;2:Positive controt;3-5:Samples图 5 qnrA基因检测结果Fig.5 qnrA gene detection resultsM:DNA相对分子质量标准(DL2000)1:阴性对照;2:阳性对照;3:样品M:DL2000 DNA marker 1:Negative control;2:Positive controt;3:SamplesM 1 2 3 4 520001000750500250100861bpM 1 2 320001000750500250100516bp 39 孙丹岚等：北疆地区马链球菌分离鉴定及耐药性和毒力基因分析第 31 卷第 3 期表 5 不同菌株的毒力基因检测情况Table 5 Detection of virulence genes毒力基因Virulence genes菌株编号Strains菌种数Number of strainslytA68/12、HW5-1-2、1482-2-1、35-61、0-15fneBL1、L2、L3、Y1、Y2、Y36lytA fneB plyD1、D2、D33/33-2、696、168-1-2-11、Y526-1-2、Z72-2、1482-2-2、4081-1-2-2、6917-2、4081-1-2-1、3082-2-210图 8 fneB基因检测结果Fig.8 fneB gene detection results M:DNA相对分子质量标准(DL2000)1:阴性对照;2:阳性对照;34:样品M:DL2000 DNA marker1:Negative control;2:Positive control;3-4:Sample图 7 lytA基因检测结果Fig.7 lytA gene detection resultsM:DNA相对分子质量标准(DL2000);1:阴性对照;2:阳性对照;3:样品M:DL2000 DNA marker 1:Negative control;2:Positive control;3:Sample 图 6 ply基因检测结果Fig.6 ply gene detection resultsM:DNA相对分子质量标准(DL2000);1:阴性对照:2:阳性对照;34;样品M:DL2000 DNA marker 1:Negative control;2:Positive control;3-4:Sample并不完全相符，如马链球菌和其他链球菌对四环素类药物的耐药率均较高，马链球菌5株，其他链球菌10株，但因为只检测了一种四环素类耐药基因（tetA），并没有检测出相关耐药基因的存在，可能是菌株DNA中还有没发现的其他耐药基因存在，本次实验没有检测到。根据毒力基因的结果来看，有5株链球菌携带lytA基因，9株马链球菌均携带fneB基因，值得关注的是，有3株马链球菌同时携带3个毒力基因，分别为ply基因，lytA基因及FneB基因。根据耐药性结果和毒力基因结果综合分析，马链球菌（Y1），同时携带两种耐药基因（blaTEM基因和qnrA基因）及一种毒力基因（fneB基因）。在临床用药中应尽量避免在对马链球菌引起的疾病中用-内酰胺类药物进行治疗。通过本次实验可知，北疆地区马源链球菌对常见药物有较高的耐药率，提示该地区耐药情况比较严重；应重视由耐药菌株引起的链球菌病在马场中传播的严峻形势。综上所述，应做到抗生素轮换使用并谨慎选择，避免因滥用抗生素出现大量耐药菌。参考文献1 高兵,张洪波,张弛,等.171株临床分离的肺炎链球菌毒力基因携带状况的研究J.华西医学,2019,34(9):1042-1046.2 World Health Organization.Antimicrobial resistance:global report on surveillanceEB/OL.2019-06-03.https:/www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en/.3 Feldman C,Anderson R.Review:current and new generation pneumococcal vaccinesJ.J Infect,2014,69(4):309-325.M 1 2 3 4M 1 2 3M 1 2 3 4200020002000100010001000750750750500500500250250250100100100209273435bpbpbp 40 中国动物传染病学报2023 年 6 月4 Weiser I N,Ferreira D M,Paton J C.Streptococcus 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