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山 东 科 学 第 卷 第 期 年 月出版.:./.【农业微生物】收稿日期:基金项目:浙江大学山东(临沂)现代农业研究院服务地方经济发展项目()年山东省青创团队项目()作者简介:孙立娇()女研究方向为中药学:.通信作者赵志龙男副教授研究方向为中药微生物天然产物:.不同液体培养基对茶藨子叶状层菌生长代谢的影响孙立娇孙迪程显好史晓委赵志龙(.临沂大学 医学院山东 临沂.浙江大学 山东(临沂)现代农业研究院山东 临沂 鲁东大学 农学院山东 烟台)摘要:茶藨子叶状层菌()是一种寄生于 年以上金银花活体根茎韧皮部的药食两用真菌具有抗炎、抗病毒等作用 采用 种液体培养基对茶藨子叶状层菌进行人工培养并探究不同培养基对生物量、三萜、多糖及腺苷含量的影响 结果表明:茶藨子叶状层菌在马铃薯液体培养基和忍冬马铃薯液体培养基中多糖含量较高分别为./和./在忍冬麦麸培养基中生物量为./、三萜为./、腺苷为./含量均高于其他三种培养基 本研究为大规模人工培养茶藨子叶状层菌提供参考关键词:茶藨子叶状层菌液体培养忍冬代谢产物中图分类号:文献标志码:文章编号:()开放科学(资源服务)标志码():(.().).().(././)./././.山 东 科 学 年 茶藨子叶状层菌()属于锈革孔菌科()叶状层菌属()是一种寄生于 年以上忍冬科植物金银花活体根茎韧皮部的药食两用真菌 该菌含有甾醇、有机酸、多糖、三萜和苯乙烯基吡喃酮等化学成分其中化合物 、及核苷类成分等具有显著的抗炎、抗病毒活性多糖类化合物具有抗肿瘤、促进免疫调节等药理作用且毒理研究表明其安全无毒 作为新资源食品以及民间常用药广泛用于防治咽炎、扁桃体炎等口腔炎症在医疗保健方面展现出重要的开发价值应用前景广阔 茶藨子叶状层孔菌作为非腐生类真菌对生长条件要求严苛野生菌稀少严重限制了茶藨子叶状层孔菌的深入开发 因此茶藨子叶状层菌的人工培养是对其开发利用具有重要意义近年来国内学者对于该菌的人工培养已展开初步相应研究陈蒙蒙等采用 种固体培养基人工培养发现该菌在麦芽汁固体培养基中生长速度最快在麦麸固体培养基中色素积累明显较多且生物量最高而在 培养基(葡萄糖蛋白胨酵母膏培养基)中培养 左右三萜含量最高 周丽思等通过添加不同生药量忍冬茎水提取物对茶藨子叶状层菌发酵的影响进行了探究忍冬茎水提物可显著提高菌丝体中麦角甾醇、总多糖等含量 因此基于茶藨子叶状层菌的生长习性以及其他真菌的人工培养研究基础本文采用 种不同液体培养基对该菌进行人工液体培养探究不同液体培养基对茶藨子叶状层菌代谢的影响为茶藨子叶状层菌的人工培养提供思路 材料与方法.实验仪器 超净工作台(苏州净化)、高压灭菌锅(上海博讯)、恒温振荡培养箱(天津欧诺)、计、旋转蒸发仪、高效液相色谱仪(华普仪器)、色谱柱、紫外分光光度计(上海康华)、超声波清洗机.实验材料供试菌株鲁东大学提供经 序列鉴定为茶藨子叶状层菌()菌丝体培养试剂:培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)、葡萄糖、麸皮、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、忍冬藤多糖含量检测剂:葡萄糖、苯酚、硫酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、无水乙醇、丙酮、乙醚三萜含量检测剂:齐墩果酸标准品(上海源叶生物科技有限公司)、乙醇(体积分数)、香草醛冰醋酸溶液(体积分数)、高氯酸、冰醋酸腺苷含量检测剂:腺苷标准品(上海源叶生物科技有限公司)、甲醇(体积分数)、甲醇(分析纯、色谱纯).培养基及其制备方法茶藨子叶状层菌液体培养基配方见表 表 茶藨子叶状层菌液体培养基配方 培养基编号培养基名称培养基成分马铃薯液体培养基()马铃薯 葡萄糖忍冬马铃薯液体培养基()马铃薯 葡萄糖忍冬枝叶 麦麸液体培养基()麸皮 蛋白胨 葡萄糖.磷酸二氢钾.硫酸镁忍冬麦麸液体培养基()麸皮 蛋白胨 葡萄糖.磷酸二氢钾.硫酸镁忍冬枝叶 注:为煮汁处理加入 去离子水蒸煮过滤汁液定容至 液体培养基按上述配方准确称重搅拌均匀后以 /瓶分装至 的锥形瓶中 灭菌 第 期孙立娇等:不同液体培养基对茶藨子叶状层菌生长代谢的影响.实验方法.菌种的制备菌种的活化:取 保藏的茶藨子叶状层菌接种至(马铃薯固体培养基)培养基中置于恒温培养箱 培养 一级摇瓶种子制备:活化菌种生长直径至 时无菌打孔器制备茶藨子叶状层菌菌块挑取菌块接种至 培养基中置于恒温振荡培养箱中/培养 二级摇瓶种子制备:取 一级种子培养液接种于二级摇瓶种子 培养基中/培养 测试培养基的接种与培养:取 二级摇瓶种子培养液接种于不同培养基中/培养.生物量的测定采用滤纸过滤法定期测定各培养基中茶藨子叶状层菌菌丝体生物量 发酵结束后发酵液离心弃上清沉淀物置于烘箱中 烘干至恒重 蒸馏水洗涤沉淀 次 烘干至恒重获得菌丝生物量.的测定以 计对发酵液 进行测定具体方法依照 水质 值的测定玻璃电极法规定方法同一样品重复测定 次.三萜含量测定采用香草醛冰醋酸法测定忍冬茶藨子叶状层孔菌三萜含量 收集菌丝烘干至恒重后研磨称取.菌丝粉末置于 试管中加入 乙醇溶液(体积分数)用超声波()室温提取.收集上清液沉淀继续用 乙醇根据以上条件重复提取 次合并 次提取液 /离心 取上清液乙醇定容至 即得醇提样液.多糖含量测定采用硫酸苯酚法测定忍冬茶藨子叶状层孔菌多糖含量 称取.菌丝体粉末加水 沸腾 浸泡过夜纱布过滤后残渣重复上述步骤两次合并滤液将所获得滤液加热浓缩至原体积的/再向其中缓慢加入 倍浓缩液体积的无水乙醇置于 冰箱中过夜醇沉 /离心后倾去上清液得到沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后再用蒸馏水溶解最后在 容量瓶中定容即得多糖样品溶液.腺苷含量测定采用高效液相色谱法测定茶藨子叶状层菌腺苷含量 取 支 具塞试管分别精确称取四种茶藨子叶状层菌菌丝粉末.分别加入 的 的甲醇溶液超声()震荡溶解 后收集上清液 收集沉淀物重复提取 次合并 次提取液 /离心 取上清液 旋干后加入甲醇 溶解压滤获得腺苷样品液 色谱柱为 (.)流动相为甲醇水(体积比为)流速为 /检测波长为 进样量 .数据分析采用 软件和 软件进行数据分析和标准差分析 所有试验重复 次结果为(平均值标准差)表示 结果与分析.不同培养基对茶藨子叶状层菌菌丝体生长的影响在同等培养条件下在不同培养基中生长的茶藨子叶状层菌菌丝生长特性及生物量具有明显差别(表)培养基的菌丝生物量最高达到.其他依次为 培养基、培养基和 培养基 同时通过检测各培养基的发酵液 发现茶藨子叶状层菌的适宜 在.之间山 东 科 学 年表 不同培养基对茶藨子叶状层菌菌丝体生长的影响 培养基菌丝体特征形态变化色泽发酵液特征色泽气味生物量/内呈球状直径约 后渐呈丝絮状浅黄色黄褐色无清香.内呈球状直径约 后渐呈丝絮状黄褐色浅褐色清香.内呈球状直径约 后渐呈丝絮状浅黄色黄色无清香.内呈球状直径约 后渐呈丝絮状褐色褐色清香.不同培养基对茶藨子叶状层菌三萜含量的影响在三萜含量比较中经 培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝三萜含量最高三萜含量达到./其次是 培养基和 培养基分别为./和./经培养基 培养的忍冬茶藨子叶状层孔菌虽然生物量较高但三萜成分含量最低仅有./在茶藨子叶状层菌三萜产量方面产量从高到低依次为培养基、培养基、培养基、培养基 在所有培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝中经培养基 培养的茶藨子叶状层菌菌丝三萜产量最高 发酵液中达到.与其余三种培养基相比具有显著差异(.)三萜产量最低的是 培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝 以茶藨子叶状层菌三萜为目标产物时应首选培养基 培养基作为茶藨子叶状层菌菌丝发酵培养基表 茶藨子叶状层菌在不同培养基中的三萜产量与含量 培养基每 发酵液三萜产量/.三萜含量/().不同培养基对茶藨子叶状层菌腺苷含量和产量的影响在腺苷含量比较中经 培养基培养的茶藨子叶状层孔菌菌丝腺苷含量最高达到./腺苷含量由高到低依次为 培养基、培养基、培养基分别为.、.、./在茶藨子叶状层菌腺苷产量方面产量从高到低依次为 培养、培养、培养基、培养基在所有培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝中 培养中茶藨子叶状层菌菌丝腺苷产量最高 发酵液中达到.与其余 种培养基相比具有显著差异(.)腺苷产量最低的是经 培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝 以高产茶藨子叶状层菌腺苷为目标产物时应首选 培养基作为茶藨子叶状层菌菌丝发酵培养基表 茶藨子叶状层菌在不同培养基中的腺苷产量与含量 项目培养基每 发酵液腺苷产量/.腺苷含量/().第 期孙立娇等:不同液体培养基对茶藨子叶状层菌生长代谢的影响.不同培养基对茶藨子叶状层菌多糖含量和产量的影响不同培养基对茶藨子叶状层菌多糖的含量和产量影响见表 在多糖含量比较中经 培养基培养的忍冬茶藨子叶状层孔菌菌丝多糖含量最高高达./培养 中的忍冬茶藨子叶状层孔菌菌丝多糖含量为./培养基 中的忍冬茶藨子叶状层孔菌菌丝多糖含量为./经培养 培养的忍冬茶藨子叶状层孔菌菌丝生物量、三萜含量以及腺苷含量均最高但其多糖含量仅有./相较其他培养基多糖含量最低在茶藨子叶状层菌多糖产量方面产量从高到低依次为培养基、培养基、培养基、培养基 在所有培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝中培养基 中茶藨子叶状层菌菌丝多糖产量最高 发酵液中达到.与培养基 中的菌丝相比差异不明显不具有统计学意义与培养基、培养基 相比具有显著差异(.)多糖产量最低的是经 培养基培养的茶藨子叶状层菌菌丝 以高产茶藨子叶状层菌多糖为目标产物时应首选培养基 培养基作为茶藨子叶状层菌菌丝发酵培养基表 不同培养基对茶藨子叶状层菌多糖产量与含量的影响 项目培养基每 发酵液多糖产量/.多糖含量/().讨论综上实验结果发现添加忍冬茎叶水提液的培养基更适合茶藨子叶状层菌的发酵培养 与 培养基中菌丝体生物量明显增加其菌丝疏松有利于菌丝高效利用发酵液中的营养物质与溶解氧从而生长速度提高 同等条件下培养 培养基产出的菌丝生物量、腺苷含量以及三萜含量最高菌丝干重高达.三萜含量高达.是 培养基的.倍左右腺苷含量高达.综合生物量、三萜、多糖以及腺苷等多个指标来看适宜茶藨子叶状层菌发酵的培养基由高到低依次为、虽然人工菌丝培养取得一定进展但茶藨子叶状层菌的产量较低仍未达到大规模生产的要求还需要进一步探索参考文献:张小青戴玉成.中国真菌志第二十九卷 锈革孔菌科.北京:科学出版社:.陈蒙蒙 程显好 孙磊 等.茶藨子叶状层菌固体培养特性.食用菌学报 ():.:./.范轶欧 陈敏 周雯 等.茶藨子叶状层菌研究概况及开发利用.辽宁中医药大学学报 ():.:./.刘玉红 徐凌川 王建平 等.茶藨子叶孔菌化学成分的研究.中药材 ():.:./.于秀玲 白丽君 李琳 等.茶藨子叶状层菌化学成分及其体外抗病毒活性.中成药 ():.:./.牟玥静 方磊 李佳 等.茶藨子叶状层菌的化学成分及抗肿瘤活性研究进展.中国药房 ():.王薪.环棱褐孔菌水溶性提取物的化学成分研究.济南:山东中医药大学:.山 东 科 学 年():.:./.卢连华 姚文环 徐凌川 等.茶藨子叶孔菌(金芝)的急性毒性和遗传毒性研究.环境与健康杂志 ():.:./.卢连华 姚文环 谢玮 等.茶藨子叶孔菌大鼠 喂养试验研究.毒理学杂志 ():.:./.周丽思 陈彤垚 曾旭 等.不同生药量忍冬茎水提物对茶藨子叶状层菌发酵菌丝体生长和代谢产物的影响.食用菌学报 ():.:./.韩树张云王俊儒.栽培忍冬茎叶活性成分含量测定及其抑菌活性研究.河 南 农 业 科 学():.韩树.忍冬茎叶化学成分及其抑菌活性的研究.杨凌:西北农林科技大学.鲁思爱.忍冬藤的化学成分及其药理应用研究进展.临沂大学学报 ():.:./.秦国培.茶藨子叶状层菌的深层发酵及其菌丝质量标准研究.济南:山东中医药大学.侯晓梅 陈敏青 张慧蕾 等.中药提取物对灰树花深层发酵的影响.食品科技 ():.:./.景思佳 张蕾 刘洋 等.种樟科树枝水提物对樟芝液体培养的比较.浙江林业科技 ():.:./.胡彩香.阿魏提取物对阿魏菇菌丝生长及生物活性影响的研究.乌鲁木齐:新疆农业大学.吴红娟 鲁耀邦 肖锦仁 等.松根液对发酵茯苓菌丝产量和多糖成分的影响.中国中医药信息杂志 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