SNHG6靶向miR-101_TGFBR1促进AMI小鼠左心室心肌纤维化.pdf

张梦伟,赵忠帅,杨林,等.SNHG6 靶向 miR-101/TGFBR1 促进 AMI 小鼠左心室心肌纤维化J.中南医学科学杂志,2023,51(5):640-644.收稿日期 2022-08-28修回日期 2023-08-08基金项目 山东省医药卫生发展计划项目(20203011333)作者简介 张梦伟,硕士,主治医师,研究方向为心肌梗死的发生机制,E-mail 为 896613017 。通信作者王倩,硕士,主治医师,研究方向为心肌梗死的发生机制,E-mail 为 343514769 。基础医学DOI:10.15972/ki.43-1509/r.2023.05.004SNHG6 靶向 miR-101/TGFBR1 促进 AMI 小鼠左心室心肌纤维化张梦伟1,赵忠帅1,杨林2,王明1,杨雪飞1,王倩11.山东大学齐鲁医院德州医院心脏康复医学科,山东德州 253000;2.德州市立医院老年医学科,山东德州 253000摘 要 目的 探讨 SNHG6 对急性心肌梗死(AMI)小鼠左心室心肌的影响。方法 将 30 只雄性 C57/BL6 小鼠构建成 AMI 小鼠后随机均分为 AMI 组、AMI+SNHG6 组、AMI+miR-101-3p 组、AMI+SNHG6+miR-101-3p 组、AMI+miR-101-3p+TGFBR1 组,另设正常小鼠 6 只为假手术组。qRT-PCR 检测 AMI 小鼠 SNHG6、miR-101-3p 表达水平。心脏彩超检测各组小鼠左室射血分数(LVEF);马松和天狼星红染色法以及免疫组化分析各组小鼠左心室心肌纤维化变化。将 H9C2 细胞株分为阴性对照组(转染空质粒)、SNHG6 组(转染质粒 SNHG6)、miR-101-3p 组(转染质粒 miR-101-3p)。Western blotting 检测各组 TGFBR1 蛋白表达;采用双荧光素酶报告基因法预测并验证 SNHG6/miR-101-3p/TGFBR1 荧光素酶活性及调控机制。结果AMI 小鼠较假手术组 SNHG6 表达显著增加,miR-101-3p降低(P0.05)。与 AMI 组比较,AMI+SNHG6 组小鼠 LVEF 降低,心肌纤维化程度加重(P0.05);AMI+miR-101-3p 组 LVEF 升高,心肌纤维化程度减轻(P0.05)。AMI+SNHG6+miR-101-3p 组较 AMI+SNHG6 组 LVEF 升高、心肌纤维化程度减轻(P0.05),而 AMI+miR-101-3p+TGFBR1 组较 AMI+miR-101-3p 组 LVEF 降低、心肌纤维化程度加重(P0.05)。双荧光素酶报告基因法验证显示,miR-101-3p 组 SNHG6、TGFBR1 野生型质粒的荧光素酶活性较阴性对照组明显降低(P0.05)。结论 SNHG6 抑制 miR-101-3p 上调 TGFBR1 加重 AMI 小鼠左心室心肌纤维化。关键词 AMI;lncRNA SNHG6;miR-101-3p;TGFBR1;H9C2;心肌纤维化中图分类号 R542.22文献标识码 ASNHG6 targets miR-101/TGFBR1 to promote left ventricular myocardial fibrosis inAMI miceZHANG Mengwei1,ZHAO Zhongshuai1,YANG Lin2,WANG Ming1,YANG Xuefei1,WANG Qian11.Department of Cardiac Rehabilitation Medicine,Dezhou Hospital,Qilu Hospital of Shandong University,Dezhou 253000,Shandong,China;2.Department of Geriatrics,Dezhou Municiple Hospital,Dezhou 253000,Shandong,ChinaABSTRACT Aim To investigate the effects of the SNHG6 on the left ventricular myocardium in acute myocardialinfarction(AMI)mice.Methods To establish a mouse model of AMI,male C57/BL6 mice(n=30)were randomlydivided into five groups:AMI group,AMI+SNHG6 group,AMI+miR-101-3p group,AMI+SNHG6+miR-101-3p group,AMI+miR-101-3p+TGFBR1 group,and another six normal mice were used as the sham-operation group.The expressionlevels of SNHG6 and miR-101-3p in AMI mice were detected by qRT-PCR.Left ventricular ejection fraction(LVEF)was detected by cardiac color Doppler ultrasound.Masson and Sirius red staining and immunohistochemistry were used toanalyze the changes of left ventricular myocardial fibrosis in each group.The H9C2 cell line was divided into threegroups:negative control group(transfected with empty plasmid),SNHG6 group(transfected with plasmid SNHG6),miR-101-3p group(transfected with plasmid miR-101-3p).Western blotting was used to detect TGFBR1 protein expression.The fluorescence reporter gene method was used to predict and verify the fluorescence activity and regulatory mechanism ofSNHG6/miR-101-3p/TGFBR1.Results Compared with the sham-operation group,the expression of SNHG6 was sig-nificantly increased,while miR-101-3p was decreased in AMI mice(P0.05).Compared with the AMI group,theLVEF of mice in the AMI+SNHG6 group was reduced,and the degree of myocardial fibrosis aggravated(P0.05);theLVEF of mice in the AMI+miR-101-3p group was increased,and the degree of myocardial fibrosis was alleviated(P046ISSN 2095-1116 Medical Science Journal of Central South China,Vol 51,No 5,20230.05).Compared with the AMI+SNHG6 group,the LVEF of mice in the AMI+SNHG6+miR-101-3p group was in-creased,and the degree of myocardial fibrosis was alleviated(P0.05).However,compared with the AMI+miR-101-3pgroup,the LVEF of mice in the AMI+miR-101-3p+TGFBR1 group was decreased,and the degree of myocardial fibrosiswas aggravated(P0.05).The fluorescence reporter gene method showed that the luciferase activity of SNHG6 and TG-FBR1 wild-type plasmids in the miR-101-3p group was significantly lower than that in the negative control group(P0.05).Conclusion SNHG6 inhibits miR-101-3p to upregulate TGFBR1 and aggravate left ventricular myocardial fi-brosis in AMI mice.KEY WORDS AMI;lncRNA SNHG6;miR-101-3p;TGFBR1;H9C2;myocardial fibrosis急 性 心 肌 梗 死(acute myocardial infarction,AMI)由心肌组织持续严重缺血引起的急性坏死,是全球主要的致命性疾病之一1-2。尽管过去十年来治疗策略有所改进,但 AMI 仍具有高致死率及多种并发症3。因此,寻找诊断、治疗急性心肌梗死的新方法迫在眉睫。长 链 非 编 码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类不具备编码蛋白功能的 RNA,其长度超过 200 个核苷酸4。越来越多的证据表明,心肌缺血再灌注损伤中,lncRNA 起着重要作用5-6。其中 SNHG6 作为一种新型 lncRNA7-8,在急性心肌梗死中的作用尚未被阐明,本研究旨在通过构建AMI 小鼠模型,深入探究 lncRNA SNHG6 在急性心肌梗死中的作用机制。1 材料和方法1.1 主要试剂与仪器雄性 C57/BL6 小鼠购自赛业生物公司;CD31抗体、Col11 抗体、Nppa 抗体、辣根过氧化物酶标记的兔二抗、TGFBR1 抗体、GAPDH 抗体均购于美国 Abcam 公司;所有引物合成购于擎科生物公司;ECL 化学发光底物购于 Bio-Rad 公司;H9C2 细胞购于普拉特泽生物公司;DAB 显色液购于迈新生物公司;苏木精染色液、丽春红酸性复红液、天狼星红染色液、RIPA 裂解液和 PBS 缓冲液均购于赛维尔生物公司。1.2 AMI 小鼠模型的构建及分组雄性 C57/BL6 小鼠 36 只,4 8 周,体质量(18.422.53)g,随机选取 30 只造模成功的 AMI 小鼠,均分为 AMI 组、AMI+SNHG6 组、AMI+miR-101-3p 组、AMI+SNHG6+miR-101-3p 组、AMI+miR-101-3p+TGFBR1 组,另选 6 只小鼠为假手术组。30 只造模小鼠用 2%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉,胸骨左缘第 2 4 肋开胸,识别前降支走行范围,7/0 滑线结扎左前降支,结扎区域颜色变为苍白,并且心电图提示心肌梗死表现时则认定 AMI 小鼠造模成功。假手术组开胸但不结扎左冠状动脉,其他步骤同造模小鼠。AMI 造模结束后,AMI+SNHG6组、AMI+miR-101-3p 组、AMI+SNHG6+miR-101-3p组、AMI+miR-101-3p+TGFBR1 组小鼠尾静脉分别注射 SNHG6、miR-101-3p、SNHG6+miR-101-3p、miR-101-3p+TGFBR1 质粒,每周 2 次,连续 4 周,假手术组、AMI 组尾静脉注射等量生理盐水。1.3 AMI 小鼠模型心脏功能检测末次处理 24 h 后,取各组 6 只小鼠麻醉,采用心脏 彩 超 检 查 各 组 小 鼠 左 室 射 血 分 数(leftventricular ejection fraction,LVEF)。1.4 RNA 提取及实时定量聚合酶链式反应TRIzol 提取小鼠组织总 RNA,紫外分光光度法测定 RNA 含量,琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。利用反转录酶合成 cDNA,并以 cDNA 为模板按照说明书进行 qRT-PCR 扩增。SNHG6 引物序列 F 为 5-TTGAGGTGAAGGTGTATG-3,R 为 5-GGTAACGAAGCAGAAGTA-3;TGFBR1 引物序列 F 为 5-ACGGCGTTACAGTGTTTCTG-3,R 为5-GCACATACAAACGGCCTATCTC-3;GAPDH 引物序列 F 为 5-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3,R 为 5-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3;miR-101-3p 引物序列 F 为 5-ACGGGCGAGCTACAGTACTGTG-3,R 为 5-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3;U6 引物序列 F 为 5-CGCTTCG-GCAGCACATATAC-3,R 为 5-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3。PCR 反应条件 95 2 min,95 15 s,60 20 s,72 20 s,共 40 个循环。分别以 GAP-DH、U6 为 SNHG6、miR-101-3p 的内参计算相对表达量。1.5 马松染色心功能检测后将小鼠麻醉处死,迅速取出心脏,切取小鼠心肌组织,石蜡切片脱蜡至水,用苏木精染液染核10 min,充分水洗后用盐酸酒精分化,再蒸馏水洗。用丽春红酸性复红液 10 min。1%磷钼酸水溶液分化5 min,甩掉磷钼酸后直接用苯胺蓝染146CN 43-1509/R 中南医学科学杂志 2023 年第 51 卷第 5 期5 min,再依次用 95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明、中性树胶封固。1.6 天狼星红染色小鼠心肌组织石蜡切片脱蜡水化,天狼星红染色液染色 10 min,稍微冲洗后用苏木精染色液染色8 min,流水冲洗 10 min。常规梯度乙醇进行脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。1.7 免疫组化染色石蜡切片脱蜡入水,微波加热法修复抗原,94,10 15 min,加入 5%正常羊血清封闭,室温孵育 15 min;随后添加一抗 CD31 抗体(1 100)、Col11 抗体(1 100)、Nppa 抗体(1 100),4 孵化过 夜。加 入 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 兔 二 抗(1 200),37 孵育 30 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37 孵育 30 min。DAB 显色后,苏木精复染 2 min,脱水,封片,正置显微镜观察切片。1.8 细胞培养和分组37、5%CO2条件下用10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和 100 mg/L 链霉素的 DMEM 培养基培养H9C2 细胞株。转染前 24 h 将生长状态良好的细胞按 5105个/孔接种于 6 孔板,随机分为阴性对照组(NC 组)、SNHG6 组、miR-101-3p 组,通 过 Lipo-fectamineTM2000 介导分别转染质粒 SNHG6、miR-101-3p 至 SNHG6 组、miR-101-3p 组,阴性对照组转染空质粒。1.9 Western blotting采用 RIPA 裂解液提取细胞蛋白,遵照 BCA 法测定蛋白水平,加入缓冲液后变性蛋白。每泳道加入 50 g 蛋白,用 12%SDS-PAGE 电泳分离蛋白,然后将蛋白转到 PVDF 膜上,5%脱脂奶粉 37 封闭 1 h,分别加入 TGFBR1(1 500)及兔抗 GAPDH抗体(1 1 000)的抗体稀释液中 4 过夜,TBST 洗3 次,每次 10 min,再放入辣根酶标记山羊抗兔的二抗中室温孵育1 h,TBST 洗3 次,ECL 液暗室发光显影,采集图像并分析。1.10 双荧光素酶报告基因实验构建 SNHG6/TGFBR1 的野生型(wild type,wt)和突变型(mutant,mut)质粒。分别提取 SNHG6/TGFBR1-wt 和 SNHG6/TGFBR1-mut 质粒,与 miR-101-3p mimic 共同转染 H9C2 细胞。转染 48 h 后,倒掉细胞培养液,PBS 清洗,加入 20 L 细胞裂解液裂解细胞,然后上机检测荧光素酶活性。1.11 统计学方法采用 SPSS 22.0 统计软件进行分析。两组数据间比 较 采 用 t 检 验,多 组 间 比 较 采 用 one-wayANOVA。P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1各组小鼠血清 SNHG6 和 miR-101-3p 表达水平的比较AMI 小鼠较假手术小鼠血清 SNHG6 表达水平显著升高(1.670.12)比(1.000.09),P0.05,而 miR-101-3p 表达水平降低(0.47 0.04)比(1.000.11),P0.05。2.2 各组小鼠 LVEF 比较与 AMI 组小鼠比较,AMI+SNHG6 组小鼠 LVEF降低(P0.05),AMI+miR-101-3p 组小鼠 LVEF 升高(P0.05);与 AMI+SNHG6 组比较,AMI+SNHG6+miR-101-3p 组 LVEF 升高(P0.05);与 AMI+miR-101-3p 组比较,AMI+miR-101-3p+TGFBR1 组 LVEF降低(P0.05;图 1)。图 1 各组小鼠 LVEF 比较a 为 P0.05,与假手术组比较;b 为 P0.05,与 AMI 组比较;c 为 P0.05,与 AMI+SNHG6 组比较;d 为 P0.05,与 AMI+miR-101-3p 组比较。2.3 各组小鼠心肌纤维化程度比较与假手术组比较,AMI 组小鼠心肌纤维化加重,CD31 抗体、Col11 抗体及 Nppa 抗体阳性信号增加;与 AMI 组比较,AMI+SNHG6 组纤维化程度加重及以上抗体阳性信号增加,AMI+miR-101-3p 组纤维化程度减轻及以上抗体阳性信号减少;与 AMI+SNHG6 组比较,AMI+SNHG6+miR-101-3p 组心肌纤维化程度减轻及以上抗体阳性信号减少;与 AMI+miR-101-3p 组比较,AMI+miR-101-3p+TGFBR1 组小鼠心肌纤维化程度加重及以上抗体阳性信号增加(图 2)。246ISSN 2095-1116 Medical Science Journal of Central South China,Vol 51,No 5,2023图 2 各组小鼠心肌纤维化程度比较A 为马松染色(200);B 为天狼星红染色(200);C 为免疫组化染色(400)2.4 SNHG6 抑制 miR-101-3p 上调 TGFBR1 表达Western blotting 结 果 显 示,与 NC 组 比 较,SNHG6 组 TGFBR1 蛋白表达明显升高,miR-101-3p组 TGFBR1 蛋白表达降低(P0.05;图 3)。图 3 SNHG6 抑制 miR-101-3p 上调 TGFBR1 表达a 为 P0.05,与 NC 组比较。2.5预测并验证 SNHG6/miR-101-3p/TGFBR1 调控关系TargetScan 预测结果显示,SNHG6 的 3-UTR 存在 miR-101-3p 的 结 合 位 点,而 miR-101-3p 与TGFBR1 也具有潜在的靶向结合关系(图 4A)。双荧光 素 酶 报 告 基 因 实 验 显 示,miR-101-3p 组SNHG6-wt、TGFBR1-wt 质粒荧光素酶活性较 NC 组明显降低(P0.05;图 4B)。图 4 SNHG6 靶向调控 miR-101-3p/TGFBR1 轴A 为生物信息软件预测 SNHG6/miR-101-3p/TGFBR1 结合点位;B 为双荧光素酶报告实验。a 为 P0.05,与 NC 组比较。3 讨 论随着医学的发展,急性心肌梗死诊断和治疗均有了明显提升9,但其仍是中国病例死亡、残疾的346CN 43-1509/R 中南医学科学杂志 2023 年第 51 卷第 5 期主要原因之一10。研究发现,急性心肌梗死发病机制主要为心室重构,因此如何减缓急性心肌梗死后心室重构成为了近十年研究的热点11。近年来,lncRNA 在心血管领域中的作用引起了广泛的关注,SNHG6 在慢性心血管疾病中发挥重要作用,SNHG6 在动脉粥样硬化中通过 miR-135 a-5p/Rock 调节氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞损伤12;但 SNHG6 在 AMI 中的确切机制尚不清楚。本研究首先构建了 AMI 小鼠模型,发现 AMI 小鼠较假手术小鼠血清中 SNHG6 表达显著增加,提示SNHG6 可能参与 AMI 的发生发展。lncRNA 影 响 内 源 性 微 RNA(microRNA,miRNA)的表观遗传修饰,进而影响 miRNA 的靶基因发 挥 相 关 生 物 学 功 能13-15。因 此 为 了 探 究lncRNA SNHG6 在 AMI 中的作用机制,本文预测并验证 miR-101-3p 是 SNHG6 的靶向 miRNA,TGFBR1是 miR-101-3p 的靶基因;提示 SNHG6 可作为竞争性内源 RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),与 miR-101-3p 结合,减弱 miR-101-3p 对 TGFBR1 的调控作用。本文结果显示,与 AMI 组小鼠比较,AMI+SNHG6 组小鼠 LVEF 下降,而加入 miR-101-3p 后,回补了 SNHG6 对 LVEF 的表达水平;同时 AMI+SNHG6 组 AMI 小鼠中 Nppa 抗体的表达水平明显升高,提示 SNHG6 可促进 AMI 小鼠 LVEF 进一步降低,从而促进心肌梗死的发展,而过表达 miR-101-3p可使 AMI 小鼠心肌梗死好转、心功能提升。随后采用马松和天狼星红染色及免疫组化实验,也验证了这一结果。本研究结果显示,miR-101-3p 显著抑制AMI 组小鼠心肌纤维化,而 TGFBR1 逆转了 miR-101-3p 的抑制效果,提 示 在 AMI 小 鼠 模 型 中,SNHG6 可竞争性吸附 miR-101-3p 上调 TGFBR1 表达,从而促进小鼠心肌纤维化程度加重。综上,本研究阐述了 SNHG6 作为 ceRNA,竞争性吸附 miR-101-3p 上调 TGFBR1 导致 AMI 小鼠左心室心肌纤维化增加,心肌梗死程度加重,SNHG6未来可能会成为 AMI 诊断及治疗的新靶点。参考文献1 王永生,韩婉青,张俊伟.急性心肌梗死患者血清 lncRNA p21表达 水 平 及 临 床 意 义 J.安 徽 医 学,2022,43(11):1259-1263.2 郗汇聪,陈礴,候海文.联合检测血清脂肪酸结合蛋白和微小RNA-499 在急性心肌梗死预警中的价值J.中南医学科学杂志,2020,48(3):266-268.3 王心宇,乔树宾.急性心肌梗死合并心源性休克患者的血运重建治疗研究进展 J.中国心血管病研究,2021,19(4):371-376.4 SHU L,ZHANG W,HUANG 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