补肾中药佳蓉片治疗大鼠宫腔粘连的有效性研究.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，实验研究 ：基金项目：陕西省重点研发计划项目产业创新链课题（）作者单位：陕西中医药大学第一临床医学院，陕西 咸阳 ；西安国际医学中心医院，陕西 西安 ；空军军医大学，陕西 西安 通信作者：黄艳红，：补肾中药佳蓉片治疗大鼠宫腔粘连的有效性研究梁宇同王研丁旭李臻师长宏黄艳红，【摘要】目的探讨不同剂量佳蓉片治疗大鼠宫腔粘连（，）的有效性。方法 大鼠行双重损伤法建立 模型，造模成功后将大鼠按随机数字表法分为模型组、雌激素组（于术后 、肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液）以及低、中、高浓度佳蓉片组（分别于术后 开始连续灌胃 、佳蓉片 ），每组各 只。另取 只 大鼠作为对照组（仅查见双侧子宫）。术后 每组取材 只，染色评估宫腔形态、子宫内膜腺体情况，染色评估子宫内膜纤维化程度，测定大鼠血清雌二醇（，）含量，每组剩余的只 大鼠连续合笼一个动情周期，孕 取材观察造模段妊娠情况。结果造模术后 ，模型组见宫腔局部或全部闭塞、纤维粘连带形成，与对照组比较，腺体数量减少、规则形态腺体占比增加、纤维化面积比增加、血清 含量降低，差异有统计学意义（），且妊娠情况明显恶化。雌激素治疗组相较模型组，在子宫纤维化面积比、血清雌激素含量方面有所改善，而各剂量佳蓉片组与模型组比较，宫腔形态、纤维化面积比、血清 含量均有明显改善，差异有统计学意义（），且妊娠情况均有明显改善，中剂量佳蓉片治疗组腺体总数增加，差异有统计学意义（）。结论补肾中药佳蓉片可有效治疗 ，且中剂量佳蓉片的治疗效果最佳。【关键词】宫腔粘连；佳蓉片；子宫内膜纤维化；腺体；雌二醇【中图分类号】【文献标识码】，（，；，；，）【】（），（），（，）（）（）（），（），（），（），（），（），【】；世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，宫腔粘连（，）是由于子宫内膜基质层细胞损伤导致纤维化，进而引起宫腔部分或全部闭塞的疾病 。其病因多为各种宫腔内操作手术创伤及宫腔内感染使子宫内膜基底层受损，子宫内膜细胞和腺体修复障碍，宫腔内皮细胞紧密粘连，成纤维细胞聚集，附着纤维组织，部分或完全取代内膜，局部缺血，进而形成 ，。临床表现为月经异常、不孕、反复流产等，其妊娠成功率仅 ，现已成为继发性不孕症、月经减少等的主要原因。目前，临床治疗以宫腔镜手术为主，辅以雌激素类药物，并在术后放置宫内节育器等预防再粘连 ，但无法修复子宫内膜基底层所受损伤，导致其术后复发率高达 ，。现阶段 治疗效果不尽如人意，传统中医药治疗手法为 的诊治提供了新的方向，并逐渐成为研究热点，但关于补肾中药佳蓉片治疗的相关研究较少。佳蓉片（原名甲蓉片），由六味地黄丸加味而得，其主要成分为熟地黄、倒卵叶五加、菟丝子（制）、枸杞子等 味中药，具有滋阴扶阳、补肾益精的功效 ，适用于肾阳虚、肾阴阳两虚导致的多种疾病 ，。佳蓉片的功效与 中医药治法相契合，故本研究将初步探讨佳蓉片治疗 的效果，以期为 治疗提供新的方向。材料与方法 材料 动物 级雌性 大鼠 只，鼠龄 周，体质量为（），未受孕且动情周期正常，由空军军医大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：（陕），该实验方案已通过空军军医大学动物伦理委员会审核（审批号：）。饲养条件：温度（），相对湿度 ，噪音 分贝以下，氨浓度 以下，通风换气 次 ，光照时间 。自由摄食、摄水，适应性饲养 周。药物与试剂佳蓉片（中成药原药浓缩药粉）由西安博爱制药有限责任公司提供；细菌脂多糖（，）购自吉泰科技生物公司（产品批号：）；三色染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司（产品批号：）；苯甲酸雌二醇注射液购自天津金融药业有限公司（产品批号：）。方法 大鼠 的模型建立参照蔡慧华等 的双重损伤法加以改良建造 动物模型。取动情周期正常的雌性 大鼠，麻醉，置于无菌手术台（布）上，腹部手术区（约腹部正中线尿道口上约 处）备皮，局部碘伏消毒，作长约 的纵向切口，逐层开腹，纱布用生理盐水浸湿后垫于切口附近，寻找并暴露一侧子宫，沿子宫纵轴在子宫中段作约 的纵向切口，使用自制刮宫匙（直径约为 ）刮搔宫腔四周，直至进出子宫切口无突兀感（约 次），生理盐水冲洗宫腔，自子宫切口放入约 的 手术线（总长 ，提前 浸泡于 的 溶液中），缝合子宫切口，将子宫归位，另一侧子宫做相同操作，生理盐水冲洗宫腔，逐层缝合腹部，腹部留 手术线尾丝。后取掉尾丝。分组及处理方法将 只 级 大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、雌激素组、低佳蓉片组、中佳蓉片组、高佳蓉片组，每组 只大鼠。对照组：仅开腹查看双侧子宫；模型组：使用改良双重损伤法建立 动物模型；雌激素组：改良双重损伤法造模，造模后 、后腿内侧肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液；低佳蓉片组：改良双重损伤法造模，造模后 开始灌胃 佳蓉片原药混悬液，连续灌胃 ；中佳蓉片组：改良双重损伤法造模，造模后 开始灌胃 佳蓉片原药混悬液，连续灌胃 ；高佳蓉片组：改良双重损伤法造模，造模后 开始灌胃 佳蓉片原药混悬液，连续灌胃 。不同体质量 大鼠苯甲酸雌二醇注射液、佳蓉片原药混悬液用药剂量根据 药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算 中的“标准体质量动物的由动物 到动物 的 剂量折算表”以及“校正系数”计算。观察指标及方法每组各 只 大鼠于造模术后 ，麻醉大鼠，剔除胸部、下腹部鼠毛，开胸，心尖取血 ，开腹，分离双侧造模段子宫。法测定血清 含量取大鼠血液并离心血清，行常规酶联免疫吸附测定 法（，）（温育、洗涤、加酶、再温育、再洗涤、显色、测定），计算并比较各组血清 含量情况。染色用于观察子宫内膜形态学变化行常规石蜡包埋大鼠子宫造模处组织，并作 石蜡切片，烤片后行 染色（脱蜡、脱水、染 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，核、分色、返蓝、复染、脱水、固定）并封片。切片在 倍镜下拍摄成片，并观察子宫内膜形态学变化及内膜腺体数量。染色用于统计子宫内膜纤维化程度行常规石蜡包埋大鼠子宫造模处组织，并作 石蜡切片，烤片后行 染色（脱蜡、脱水、染核、分色、反蓝、染色、清洗、染色、清洗、脱水、固定）并封片。切片在 倍镜下选取 个视野并拍摄成片，并应用 图像分析软件计算子宫内膜纤维化面积比。妊娠实验评定大鼠受孕能力各组完成治疗后连续合笼（雌雄按 比例）一个动情周期，每天早上观察阴栓，观察到阴栓即记为孕 ，并终止合笼，孕 取双侧连胎子宫，拍摄成片并观察造模段子宫受孕及胚胎存活情况。统计学方法采用 统计学软件进行统计分析，符合正态分布的数据用均数 标准差（）来表示，多组间比较采用单因素方差分析（），多组均数间两两比较方差齐采用 校正的 检验，方差不齐采用 检验。不符合正态分布的计量资料用中位数（四分位数间距）来表示，采用独立样本非参数检验。以 为差异有统计学意义。结果 各组大鼠子宫内膜形态学改变及腺体情况各组子宫组织石蜡切片经 染色后镜下观察，结果表明：对照组子宫结构完整，宫腔形态不规则，多呈类椭圆形、星型或多角形，且宫腔周围有完整柱状上皮细胞整齐紧密排列，子宫内膜腺体丰富，腺体管腔多呈圆形或椭圆形且有完整柱状上皮细胞包裹，如图 ；模型组宫腔狭窄，部分宫腔闭锁，可见多处纤维粘连带，子宫内膜腺体稀疏，且腺体形态多呈不规则（如：葫芦状、月牙状等），宫腔及腺体管腔的上皮细胞呈低柱状，如图 ；雌激素组宫腔整体形态类模型组组织，宫腔狭窄，超 的组织仍可见多处纤维粘连带，但宫腔闭锁情况均有改善，如图 ；各剂量佳蓉片组宫腔整体形态较模型组有明显恢复，无宫腔闭锁情况，各组仅有 个组织内可见少量纤维粘连带，宫腔、腺体管腔周围均可见完整柱状上皮细胞包裹，子宫内膜腺体增加，但腺体形态仍多呈不规则状，不同剂量佳蓉片组之间无明显差别，如图 、。治疗后 各组大鼠子宫内膜腺体情况如图所示，结果表明：与对照组比较，模型组大鼠腺体总数明显减少、非规则形态腺体占比明显增多，差异有统计学意义（）；与模型组比较，中剂量佳蓉片组治疗后腺体总数增加，差异有统计学意义（），雌激素组及低、高剂量佳蓉片组大鼠子宫组织腺体总数无明显改善，且中、高剂量佳蓉片组均恢复至接近于对照组的状态；就非规则形态腺体占比情况而言，雌激素组无明显改善，低、中、高剂量佳蓉片组较模型组明显改善（），非规则形态腺体占比情况均恢复至正常情况。故就大鼠子宫内膜腺体情况而言，双重损伤法成功建立 动物模型，不同剂量佳蓉片治疗后均产生一定疗效，部分组别恢复至正常状态。注：对照组；：模型组；：雌激素组；：低剂量佳蓉片组；：中剂量佳蓉片组；：高剂量佳蓉片组；图中箭头所标注位置为宫腔粘连处图 各组大鼠子宫组织 染色（染色，）各组大鼠子宫内膜纤维化面积比情况各组子宫组织石蜡切片经 染色后拍照观察，结果见图 。治疗后 各组大鼠子宫内膜纤维化面积比的具体情况见图 ，结果表明：与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜纤维化面积占比明显增加，差异有统计学意义（）；与模型组比较，雌激素组子宫内膜纤维化面积占比减少，差异有统计学意义（），低、中、高剂量佳蓉片治疗后子宫内膜纤维化面积占比明显降低，差异有统计学意义（），但各治疗组均尚未恢复至正常状态。故就大鼠子宫内膜纤维化面积占比变化而言，双重损伤法成功建立 动物模型，雌激素及世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，注：与对照组比较，；与模型组比较，图 各组大鼠子宫组织 染色统计图图 各组大鼠子宫组织 染色结果（染色，）不同剂量的佳蓉片治疗均有疗效，且各剂量治疗组的改善情况明显优于雌激素治疗组。注：与对照组比较，；与模型组比较，图 各组大鼠子宫子宫内膜纤维化面积占比比较 各组大鼠血清中 含量情况经 检测后，治疗后 各组大鼠血清 含量具体情况见图 ，结果表明：与对照组比较，模型组 大鼠的 含量明显降低，差异有统计学意义（）；与模型组比较，高剂量佳蓉片组血清含量明显升高，差异有统计学意义（），且恢复至正常状态，而雌激素组、低剂量佳蓉片组、中剂量佳蓉片组与模型组的 大鼠血清 含量比较，差异无统计学意义（）。故大鼠血清含量变化提示，双重损伤法成功建立 动物模型，高剂量佳蓉片治疗有明显疗效，而雌激素、低剂量、中剂量治疗无明显疗效。注：与对照组比较，；与模型组比较，图 各组大鼠血清 含量比较 各组大鼠受孕及胚胎存活情况经大鼠妊娠实验统计妊娠率，孕 连胎子宫观察大鼠造模段（对照组观察段）受孕能力及胚胎存活情况，见图 所示，妊娠率、造模段受孕率及胚胎存活率见表 。结果表明：与对照组比较，模型组大鼠的妊娠率、造模段受孕率及胚胎存活率明显降低，差异有统计学意义（）；与模型组比较，各治疗组的妊娠率均无改善，雌激素及中剂量佳蓉片治疗组造模段受孕率明显改善（，），各剂量佳蓉片治疗组造模段胚胎存活率均较模型组有明显改善（，）。故妊娠实验结果表明，双重损伤法成功建立 动物模型，中剂量佳蓉片治疗可综合改善 受孕及胚胎 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，存活情况，但各治疗组均无法改善大鼠妊娠率。表 各组大鼠受孕能力及胚胎存活情况统计表（）组别妊娠率 造模段受孕率造模段胚胎存活率对照组 模型组 雌激素组 低剂量佳蓉片组 中剂量佳蓉片组 高剂量佳蓉片组 注：与对照组比较，；与模型组比较，图 各组 大鼠妊娠受孕及胚胎存活情况 讨论本研究模拟临床 病因病机，综合子宫内膜机械性损伤与子宫内膜感染双重损伤法加以改良建立大鼠 模型，病理改变基本符合 的临床病理特征，表明成功建立大鼠 模型。本研究使用佳蓉片治疗 ，从形态学、功能学方面对治疗的有效性进行评价。实验研究发现，不同剂量佳蓉片灌胃治疗后，形态规则腺体占比均明显增加，并恢复至正常状态，组织纤维化面积比、造模段胚胎存活率均有明显改善，优于模型组，但尚未恢复至正常状态。中、高剂量佳蓉片灌胃治疗 后，组织腺体总数、血清雌激素含量均明显增加，并达到正常状态，子宫造模段受孕率同样有所改善，但低于对照组，低剂量佳蓉片治疗后较模型组无明显改善。不同剂量佳蓉片治疗后，大鼠的妊娠率无改善。说明佳蓉片可有效治疗 ，但不同剂量佳蓉片的治疗效果之间存在差异，综合各项指标，中、高剂量佳蓉片组的治疗效果最较好，但考虑成本及服用问题，中剂量佳蓉片治疗更加实用，对应成人原药浓缩药粉用量为 ，中成药用量为 片，次 。本研究佳蓉片治疗 的有效性，并于雌激素治疗进行比较，发现雌激素治疗后，组织纤维化面积比、血清雌激素含量、造模段受孕率较模型组有明显改善，但仅有血清雌激素含量恢复至接近正常状态。与各剂量佳蓉片治疗组比较，说明中、高剂量佳蓉片治疗 的效果明显优于雌激素治疗组，与低剂量治疗组无明显差异。就 大鼠的整体妊娠率而言，雌激素及佳蓉片的治疗均无明显疗效，提示佳蓉片可能需要联合其他治疗手段共同改善 妊娠情况。目前，有关 的病因机制尚不明确，但多项研究证实了纤维细胞增殖活跃学说的有效性，即子宫内膜基底层受损造成纤维细胞增生、新生血管形成受阻、上皮细胞和间质细胞再生障碍等，进而导致纤维结缔组织增生 。根据本研究纤维化面积比以及血清 含量的改变可以推测，佳蓉片治疗 的作用机制可能与纤维相关因子（结缔组织生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子等）以及雌激素受体相关联，本课题组将进一步进行相关作用机制的实验研究。综上所述，佳蓉片可有效治疗 ，且中剂量的治疗效果更为明显。参考文献 张海静，范艳艳，韩亚辉，等 宫腔粘连的临床特点、治疗及预防复发研究进展 中国妇幼保健，（）：吴华颖，卢美松，邓锁 干细胞修复宫腔粘连的研究进展 中国计划生育和妇产科，（）：，（）：段华，夏恩兰 宫腔粘连临床诊疗中国专家共识 中华妇产科杂志，（）：，（）：，：，（下转第 页）世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，统计学意义。两组患者随访 个月，治疗组相较对照组中位生存期显著延长；治疗组患者 个月，个月，个月生存率显著高于同期对照组患者。两组患者治疗后，骨髓抑制、恶心呕吐、腹痛、皮疹、发热、肝肾功能、血常规等不良反应发生率比较，差异无统计学意义。本研究结果提示温肾利水法联合腹腔热灌注化疗用于恶性腹水的治疗，可以提高临床总疗效，改善临床症状，提高机体免疫力，最终达到提高患者生存率的目的，同时中西结合治疗并不提高治疗副作用的发生率，具有较高的安全性。因为本研究的样本数较少，且对中西结合治疗的起效机制解释稍显不够，下一步研究应该扩大样本量，同时从蛋白通路、分子靶点等方面多方面展开对中西结合治疗起效机制的研究，更有助于推动中西医结合在恶性腹水治疗领域内的应用。参考文献 于榆林 西妥昔单抗联合铂类药物灌注治疗胃癌致恶性腹水疗效观察 现代肿瘤医学，（）：叶磊，陈文 紫杉醇腹腔灌注化疗治疗晚期胃癌合并恶性腹水的临床疗效观察 重庆医科大学学报，（）：王帅，刘素艳，李艳艳，等 榄香烯联合奈达铂治疗恶性胸腹水临床观察 中华肿瘤防治杂志，（）：张锋利，李平，张梅 龙蝎消水膏外敷联合腹腔热灌注化疗治疗恶性腹水的临床研究 辽宁中医杂志，（）：吴非泽，娄彦妮，贾立群 癌性腹水的中医证候规律分析 中华中医药杂志，（）：葛均波，徐永健 内科学 版 北京：人民卫生出版社，：郑筱萸 中药新药临床研究指导原则 北京：中国医药科技出版社，：王歌，白龙，周跃华，等 针药并举治疗肠癌腹水的临床研究 世界中西医结合杂志，（）：，国家中医药管理局批准发布 中医病证诊断疗效标准 北京：中国医药科技出版社，：谭式辉，雷荣娥，杨显文，等 肝癌恶性腹水患者 细胞的分布及募集至腹腔的机制研究 免疫学杂志，（）：胡南华，何胜利，沈婕，等 中药穴位敷贴联合体外局部热疗治疗恶性腹水疗效观察 时珍国医国药，（）：赵润元，刘小发，李佃贵 国医大师李佃贵论治肝硬化举隅 世界中西医结合杂志，（）：，左小东，崔永安，秦叔逵，等 华蟾素抗肿瘤作用的临床研究进展 临床肿瘤学杂志，（）：陈慧君，沈曼娜，李永浩 中西医结合治疗卵巢癌腹水的 分析 世 界 中 西 医 结 合 杂 志，（）：，吴江，汪宏良 铁蛋白与 联合检测在良、恶性腹水鉴别诊断中的临床意义 中国现代医学杂志，（）：丁平安，杨沛刚，田园，等 腹腔热灌注化疗联合全身系统化疗及阿帕替尼转化治疗对胃癌腹膜转移的疗效 中国肿瘤临床，（）：杨飞，张亚铭，周潮平，等 局部进展期胃癌根治性手术联合腹腔热灌注化疗的安全性及近期疗效 中国普通外科杂志，（）：刘铎，王辉，袁紫旭，等 肿瘤细胞减灭术联合腹腔热灌注化疗能否提高结直肠癌腹膜转移患者生存率的 分析 中华胃肠外科杂志，（）：贺梦媛，丛竹凤，王升光，等 真武汤化学成分、药理作用、临床应用的研究进展及质量标志物的预测分析 中华中医药学刊，（）：冯博，房玉涛，徐瑞山 桂枝汤的现代临床应用及作用机制研究进展 中国中药杂志，（）：乔新荣，蔡静，陈琼 基于网络药理学分析中药半夏的药理作用分子机制 化学试剂，（）：杨颖，魏梦昕，伍耀业，等 白术多糖提取分离、化学组成和药理作用的研究进展 中草药，（）：刘雪枫，乔婧，高建德，等 党参多糖对溃疡性结肠炎大鼠结肠上皮 信号通路的影响 中成药，（）：（收稿日期：）（上接第 页），（）：，（）：（），（）：庞保珍，庞慧卿，李霞，等 中国佳蓉片研究与展望 中国中医药现代远程教育，（）：吴淑芳 佳蓉片联合腹腔镜手术治疗子宫内膜异位症伴不孕 例疗效观察 江西中医药大学学报，（）：田园园，李波男，周海亮，等 佳蓉片对 大鼠睾丸形态结构与功能改善作用研究 中华男科学杂志，（）：蔡慧华，何援利，李慧娟，等 宫腔粘连大鼠模型的建立及其与白细胞介素 的相关性分析 医学研究生学报，（）：黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等 药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算 中国临床药理学与治疗学，（）：（收稿日期：）