丙戊酸和2-己基-4-戊炔酸对乳腺癌易感基因2失活的成纤维细胞放射增敏作用及其机制.pdf

中国药理学与毒理学杂志2023年9月第37卷第9期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 37，No 9，Sep 2023丙戊酸和2-己基-4-戊炔酸对乳腺癌易感基因2失活的成纤维细胞放射增敏作用及其机制韩永涛1，蔡祖超2，3，凤志慧2（山东大学齐鲁医学院 1.齐鲁医院药剂科，2.公共卫生学院职业卫生与职业医学系，山东 济南 250000；3.浙江大学医学院附属口腔医院，浙江 杭州 310000）摘要：目的 研究丙戊酸（VPA）及其衍生物2-己基-4-戊炔酸（HPTA）对乳腺癌易感基因2（BRCA2）失活的成纤维细胞放射敏感性的影响及其机制。方法 取生长良好BRCA2双等位基因失活的EUFA423成纤维细胞，实验分组：电离辐射（IR）0（细胞对照），2，4和6 Gy组，VPA+IR 0，2，4和6 Gy组（VPA 500 molL-1预处理24 h后进行IR）和HPTA+IR 0，2，4和6 Gy组（HPTA 15 molL-1预处理24 h后进行IR）；细胞对照、VPA、HPTA、IR对照、VPA+IR和HPTA+IR组，除IR剂量为8 Gy外，其他处理同。细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力；中性和碱性彗星实验检测细胞核拖尾尾距，并计算DNA双链断裂（DSB）百分率；细胞免疫荧光实验和Western印迹法分别检测磷酸化组蛋白（H2AX）、53BP1、重组酶Rad51和BRCA1蛋白焦点阳性细胞百分率及其蛋白表达。结果 细胞克隆形成实验结果显示，给予EUFA423细胞IR 2，4和6 Gy处理后，与同剂量IR对照组比较，VPA+IR和HPTA+IR组细胞克隆形成率均显著降低（P0.05，P0.01）。中性和碱性彗星实验结果均显示，与同时间IR对照组比较，IR 8 Gy处理后0，30和60 min VPA+IR和HPTA+IR组细胞核拖尾尾距均明显增加，DNA DSB百分率明显增加（P0.01）。细胞免疫荧光实验和Western印迹法结果显示，IR 8 Gy 处理后 6 h，VPA+IR 和 HPTA+IR 组 H2AX 和 53BP1 焦点阳性细胞百分率及H2AX和53BP1蛋白表达水平与IR对照组比较明显增加（P0.01），BRCA1和Rad51焦点阳性细胞百分率及BRCA1和Rad51蛋白表达水平显著降低（P20的细胞为目的蛋白阳性细胞。1.5 Western印迹法检测EUFA423 细胞中 H2AX，53BP1，BRCA1和Rad51蛋白表达水平取生长状态良好的 EUFA423 细胞，按 1.3 分组处理。IR处理结束后6 h，RIPA裂解各组细胞，离心取上清液；BCA法检测蛋白质浓度。每组上样量为 60 g，进行 SDS-PAGE 电泳；转印至 PVDF膜，BSA 封闭后加入对应的一抗（稀释倍数为H2AX：1 500，53BP1：1 1000，BRCA1：1 200，Rad51：1 500，GAPDH：1 2000），4 孵育过夜；TBST洗3次后加入相应二抗（1 2000），室温孵育1 h；TBST再次洗3次后进行ECL显影。用Image J软件分析蛋白条带积分吸光度，以目标蛋白与内参蛋白积分吸光度比值表示目标蛋白相对表达水平。1.6 统计学分析实验结果数据以xs表示，采用SPSS23.0软件进行多样本比较，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或多因素方差分析（two-wayANOVA），组间两两比较采用 LSD 法。P0.05 为差异具有统计学意义。696中国药理学与毒理学杂志2023年9月第37卷第9期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 37，No 9，Sep 20232 结果2.1 VPA和HPTA增加EUFA423细胞放射敏感性细胞克隆形成实验结果（图1）显示，与细胞对照组比较，VPA 和 HPTA 对未照射 EUFA423 细胞生长均无明显影响；给予 EUFA423 细胞 IR 4 和6 Gy处理后，与同剂量IR对照组比较，VPA+IR和HPTA+IR组细胞克隆形成率均显著降低（P0.05，P0.01），但VPA+IR和HPTA+IR两组之间无明显差异。由此表明，VPA 500 molL-1及其衍生物HPTA 15 molL-1对EUFA423细胞具有相似的放射增敏作用，也表明较低浓度的HPTA即能显示显著的放射增敏作用。2.2 VPA和HPTA增加EUFA423细胞中IR诱导的DNA损伤蓄积碱性彗星实验结果（图2A1）提示，与相应未照射组相比，IR各组（IR后0，30和60 min）胞核拖尾长度显著增加，但随时间延长增加的胞核拖尾长度逐渐缩短，表明IR可诱导EUFA423细胞产生明显的DNA DSB损伤。图2A2结果显示，与同时间IR对照组相比，照射后 0，30 和 60 min，VPA+IR 组DNA DSB百分率均显著增加到IR对照组的1.41，1.52和1.83倍（P0.01），HPTA+IR组增加到1.41，1.54和1.87倍（P0.01）。中性彗星实验也观察到相似的结果（图2B）。细胞免疫荧光实验结果（图2C）显示，与相应未照射组相比，IR各组IR后6和24 h EUFA423细胞H2AX和53BP1焦点阳性细胞百分率均显著升高（P0.01）。IR 处理后 6 h，VPA+IR 组 H2AX 和53BP1 焦点阳性细胞百分率较 IR 对照组增加了32.5%和 25.5%（P0.01），HPTA+IR 组 增 加 了33.2%和27.2%（P0.01）。IR处理后24 h，VPA+IR和 HPTA+IR组H2AX和53BP1焦点阳性细胞百分率仍显著高于IR对照组（P0.01）。Western 印迹实验结果（图 2D）显示，IR 结束后6 h，与相应未照射组相比，IR各组EUFA423细胞H2AX和53BP1蛋白表达水平均显著增加（P0.01）。VPA+IR 和 HPTA+IR 组 EUFA423 细胞H2AX 蛋白表达水平较 IR 对照组分别增加了74.3%（P0.01）和34.2%（P0.05），53BP1蛋白表达水平增加了108.8%和52.7%（P0.01）。以上结果表明，VPA 500 molL-1和 HPTA15 molL-1可增加 EUFA423 细胞中 IR 诱导的DNA损伤蓄积。2.3VPA 和 HPTA 抑 制 EUFA423 细 胞 Rad51和BRCA1蛋白表达细胞免疫荧光实验结果（图3A）表明，与相应未照射组相比，IR各组EUFA423细胞Rad51焦点阳性细胞百分率明显增加（P0.01）。与 IR 对照组相 比，IR 处 理 后 6 h，VPA+IR 和 HPTA+IR 组EUFA423细胞Rad51焦点阳性细胞百分率分别显著降低了33.1%和35.8%（P0.01）；IR处理后24 h，VPA+IR和HPTA+IR 组 Rad51焦点阳性细胞百分率亦明显降低（P0.01）。另一个 HR 相关蛋白BRCA1 焦点阳性细胞百分率变化趋势与 Rad51相似。Western印迹实验结果（图3B）显示，IR结束后6 h，与相应未照射组相比，BRCA1蛋白表达水平明显升高（P0.01），Rad51蛋白水平无明显变化；与IR对照组相比，VPA+IR和HPTA+IR组EUFA423细胞 Rad51 和 BRCA1 蛋白表达水平被显著抑制（P0.01）。Fig.1 Effect of valproate（VPA）and 2-hexyl-4-pentynoic acid（HPTA）on radiosensitivity in EUFA423 cells byclone formation assay.The cells were divided into ionizing radiation（IR）0（cell control），2，4 and 6 Gy groups，VPA+IR 0，2，4and 6 Gy groups（cultured with VPA 500 molL-1for 24 h before IR），and HPTA+IR 0，2，4 and 6 Gy groups（cultured with HPTA15 molL-1for 24 h before IR）.B was the quantitative analysis result of A.Colony-forming efficiency（%）=number of clone formation/number of inoculated cells100%.xs，n=3.*P0.05，*P0.01，compared with corresponding dose of IR control group.697中国药理学与毒理学杂志2023年9月第37卷第9期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 37，No 9，Sep 2023Fig.2 Effect of VPA and HPTA on DNA double strand breaks（DSB）in response to radiation in EUFA423 cellsby alkaline comet assay（A），neutral comet assay（B），immunofluorescence assay（C）and Western blotting（D）.See Fig.1 for the cell treatment.IR control，VPA+IR and HPTA+IR groups were treated with IR 8 Gy.Percentage of DNA DSB（%）=Comettailing length in the experimental group/comet tailing length in the cell control group100%.H2AX：phosphorylated histone；IA：integrated absorbance.A2 and B2 were the quantitative analysis results of A1（200）and B1（200），respectively；C2 and C3 were thequantitative analysis results of C1（1000）；D2 and D3 were the semi-quantitative analysis results of D1.xs，n=3.*P0.01，compared with corresponding no IR group；#P0.05，#P0.01，compared with corresponding IR control group.698中国药理学与毒理学杂志2023年9月第37卷第9期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 37，No 9，Sep 2023上述结果提示，VPA 和 HPTA 对 EUFA423 细胞的放射增敏作用与其抑制DNA修复蛋白Rad51和BRCA1表达有关。3 讨论本课题组前期应用多种肿瘤细胞（如乳腺癌MCF7和骨肉瘤U2OS细胞）以及乳腺癌大鼠模型研究表明，VPA及其衍生物HPTA作为DNA损伤修复抑制剂，在细胞和动物水平上可通过抑制HR机制中关键蛋白BRCA1和Rad51活性，对肿瘤组织或细胞发挥放射增敏作用2-4，8，10。本研究进一步发现，VPA 和 HPTA 还可显著增强 BRCA2双等位基因失活EUFA423成纤维细胞对放射的敏感性，其机制亦与靶向抑制BRCA1介导的HR修复通路有关。由此提示，VPA和HPTA可下调HR通路增强 BRCA2 功能失活 EUFA423 细胞对放射的敏感性。EUFA423细胞由 Alan D DAndrea研究小组首次报道和建立16，来源于范氏贫血（Fanconianemia，FA）患者的成纤维细胞。该细胞中BRCA2基因（也称为 FANCD1，Fanconi anemia complementation group D1，FA互补组基因D1）发生双等位基因突变（7691 insAT和9900 insA）引起移码突变，从而编码 C 端截短的 BRCA2 蛋白。因此，EUFA423细胞所携带的BRCA2双等位基因失活，该基因失活可能导致类似于在 BRCA1 或 BRCA2突变家族中观察到的癌症风险。EUFA423细胞是Fig.3 Effect of VPA and HPTA on DNA repair proteins in response to IR-induced DNA DSB in EUFA423 cells byimmunofluorescence assay（A）and Western blotting（B）.See Fig.2 for the cell treatment.BRCA1：breast cancer susceptibility gene 1.A2 and A3 were the quantitative analysis results of A1（1000）；B2 and B3 were the semi-quantitative analysis results of B1.xs，n=3.*P0.01，compared with corresponding no IR group；#P0.01，compared with corresponding IR control group.699中国药理学与毒理学杂志2023年9月第37卷第9期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 37，No 9，Sep 2023目 前 被 普 遍 认 可 的 BRCA2 缺 失 细 胞，常 用 于BRCA2相关功能研究15-17。BRCA2是HR修复过程中的关键蛋白，可直接调控Rad51活性，在DNA DSB修复中发挥重要作用11。研究报道，BRCA2缺失的EUFA423细胞对放射敏感性增强17。本研究结果表明，VPA 和HPTA可进一步增强其放射敏感性。由此推测，在BRCA2 失活的 EUFA423 细胞中还存在着不依赖于BRCA2调控的HR修复通路，BRCA1和Rad51可能参与其调控。本课题组既往研究表明，在哺乳动物细胞中有2条独立的调控Rad51-HR修复通路，它们分别由 BRCA2 和 Rad52 所介导15；换言之，在BRCA2缺失细胞中还存在着Rad52/Rad51调控的HR修复通路，它不依赖于BRCA2 15，提示靶向抑制 Rad52 介导 HR 修复通路可进一步增强BRCA2缺失细胞对放射的敏感性，导致细胞合成致死性。本研究结果表明，在应答DNA损伤反应中，BRCA1和Rad51表达增加；VPA和HPTA可显著抑制IR导致增加的BRCA1和Rad51表达，提示在 BRCA2 失活的 EUFA423 细胞中 BRCA1 和Rad51还可发挥DNA损伤修复作用。由上述结果推测，VPA 和 HPTA 作为 DNA 损伤修复抑制剂，有可能通过 BRCA1 抑制 Rad52/Rad51 通路，对EUFA423 细胞发挥放射增敏作用，但两者的细胞放射增敏作用是否与其抑制Rad52功能有关还需深入探讨。此外，本研究结果还需应用另一种BRCA2失活Capan-1细胞对VPA和HPTA放射增敏作用进行验证。本研究选择的 VPA浓度 500 molL-1为临床上治疗癫痫病的血药浓度；同时基于VPA和HPTA抑制组蛋白去乙酰化酶活性，推算HPTA用于临床治疗的血药浓度可能为15 molL-1 1-2。本研究选用VPA和HPTA的临床使用剂量，研究结果更具有实际临床意义。同时，在HPTA浓度远低于VPA浓度时，即显示出与高浓度 VPA 相似的放射增敏作用，提示HPTA可能是更加高效的VPA替代物。本研究结果可为VPA及其衍生物应用于肿瘤患者放射增敏治疗提供一定的理论和实验依据。参考文献：1 Ding W,Lim D,Wang Z,et al.2-Hexyl-4-pentynoicacid,a potential therapeutic for breast carcinoma byinfluencingRPA2hyperphosphorylation-mediatedDNA repairJ/OL.DNA Repair(Amst),2020,95:102940(2020-07-28)2022-06-09.https:/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32795962/.DOI:10.1016/j.dnarep.2020.102940.2 Cai Z,Lim D,Liu G,et al.Valproic acid-like compounds enhance and prolong the radiotherapy effecton breast cancer by activating and maintaining anti-tumor immune functionJ/OL.Front Immunol,2021,12:646384(2021-05-12)2022-06-09.https:/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34054811/.DOI:10.3389/fimmu.2021.646384.3 Luo Y,Wang H,Zhao X,et al.Valproic acid causesradiosensitivity of breast cancer cells via disruptingthe DNA repair pathwayJ.Toxicol Res(Camb),2016,5(3):859-870.4 Liu G,Wang H,Zhang F,et al.The effect of VPA onincreasingradiosensitivityinosteosarcomacellsand primary-culture cells from chemical carcinogen-induced breast cancer in ratsJ/OL.Int J Mol Sci,2017,18(5):1027(2017-05-10)2022-06-09.https:/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28489060/.DOI:10.3390/ijms18051027.5 Tian Y,Liu G,Wang H,et al.Valproic acid sensitizesbreast cancer cells to hydroxyurea through inhibitingRPA2 hyperphosphorylation-mediated DNA repairpathway J.DNA Repair(Amst),2017,58:1-12.6 Peng J,Cai Z,Zhao R,et al.The intervention of valproicacid on the tumorigenesis induced by an environmental carcinogen of PAHsJ.Toxicol Res(Camb),2020,9(5):609-621.7 Su B,Lim D,Tian Z,et al.Valproic acid regulatesHR and cell cycle through MUS81-pRPA2 pathwayin response to hydroxyureaJ/OL.Front Oncol,2021,11:681278(2021-08-27)2022-06-09.https:/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34513672/.DOI:10.3389/fonc.2021.681278.8 Liu G,Lim D,Cai Z,et al.The valproate mediatesradio-bidirectional regulation through RFWD3-dependent ubiquitination on Rad51J/OL.Front Oncol,2021,11:646256(2021-05-25)2022-06-09.https:/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33842359/.DOI:10.3389/fonc.2021.646256.9 赵锡鹏,张凤梅,凤志慧.乳腺癌易感基因1在DNA损伤修复中作用的研究进展J.中国药理学与毒理学杂志(Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology),2014,28(4):606-611.10 田竹筠,杨春旺,蔡祖超,等.丙戊酸对乳腺癌MCF7细胞的放射增敏性依赖于抑癌基因p53J.中国药理学与毒理学杂志(Chinese Journal of Pharmacologyand Toxicology),2019,33(4):257-264.700中国药理学与毒理学杂志2023年9月第37卷第9期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 37，No 9，Sep 202311 Zhang J,Gurusaran M,Fujiwara Y,et al.TheBRCA2-MEILB2-BRME1 complex governs meioticrecombinationandimpairsthemitoticBRCA2-RAD51 function in cancer cellsJ/OL.Nat Commun,2020,11(1):2055(2020-04-28)2022-06-09.https:/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32345962/.DOI:10.1038/s41467-020-15954-x.12 Sidhu A,Grosbart M,Sanchez H,et al.Conformational flexibility and oligomerization of BRCA2 regionsinduced by RAD51 interactionJ.Nucleic Acids Res,2020,48(17):9649-9659.13Zhao W,Steinfeld J B,Liang F,et al.BRCA1-BARD1promotesRAD51-mediatedhomologousDNA pairingJ.Nature,2017,550(7676):360-365.14 Yilmaz D,Furst A,Meaburn K,et al.Activation ofhomologous recombination in G1 preserves centromeric integrityJ.Nature,2021,600(7890):748-753.15 Feng Z,Scott SP,Bussen W,et al.Rad52 inactivation is synthetically lethal with BRCA2 deficiencyJ.Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(2):686-691.16 Howlett,NG,Taniguchi T,Olson S,et al.Biallelic inactivation of BRCA2 in Fanconi anemiaJ.Science,2002,297:606-609.17 Treszezamsky,A,Kachnic L,Feng Z,et al.BRCA1-and BRCA2-deficient cells are sensitive to etoposide-induced DNA double-strand breaks via topoisomerase J.Cancer Res,2007,67:7078-7081.Effects of valproic acid and 2-hexyl-4-pentyne acid on radiosensitization of breast cancer susceptibility gene 2 deficient fibroblastcells and its mechanismHAN Yongtao1,CAI Zuchao2,3,FENG Zhihui2(1.Department of Pharmacy,Qilu Hospital,2.Department of Occupational Health and OccupationalMedicine,School of Public Health,Cheeloo College of Medicine,Shandong University,Jinan 250000,China;3.Stomatology Hospital,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310000,China)Abstract:OBJECTIVE To study the effect of valproic acid(VPA)and its derivative 2-hexyl-4-pentyneacid(HPTA)on radiosensitivity of breast cancer susceptibility gene 2(BRCA2)deficient fibroblast cellsand the mechanism.METHODS EUFA423 cells with BRCA2 deficiency were divided into the followingexperimental groups:Ionizing radiation(IR)0(cell control),2,4 and 6 Gy groups,VPA+IR 0,2,4and 6 Gy groups(VPA 500 molL-1pretreated for 24 h before IR)and HPTA+IR 0,2,4 and 6 Gygroups(HPTA 15 molL-1pretreated for 24 h before IR);cell control,VPA,HPTA,IR control,VPA+IR and HPTA+IR groups,except for the IR dose of 8 Gy,other treatments were the same as in.Cellproliferation ability was detected by cell clone formation assay.Neutral and alkaline comet assays wereused to detect the tailing distance of nuclei and calculate the percentage of DNA double strand breaks(DSB).The percentage of cells containing focus formation and the expression levels of phosphorylatedhistone(H2AX),53BP1,recombinase Rad51 and BRCA1 were detected by immunofluorescence assayand Western blotting.RESULTS The results of cell clone formation assay showed that compared withthe IR group,the colony-forming efficiency of EUFA423 cells in VPA+IR and HPTA+IR groups decreasedsignificantly(P0.05,P0.01)after EUFA423 cells were treated with IR 4 and 6 Gy.The results of neutraland alkaline comet assays showed that compared with the IR group,the tailing distance of nuclei inVPA+IR and HPTA+IR groups increased significantly at 0,30 and 60 min after IR 8 Gy treatment(P0.01),so did the percentage of DNA DSB(P0.01).The results of immunofluorescence assay andWestern blotting showed that at 6 h after IR 8 Gy treatment,the percentage of cells containing focusformation and the expression levels of H2AX and 53BP1 proteins in VPA+IR and HPTA+IR groupswere significantly increased compared with the IR control group(P0.01),but the percentage of cells 701中国药理学与毒理学杂志2023年9月第37卷第9期Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 37，No 9，Sep 2023containing focus formation and the expression levels of Rad51 and BRCA1 proteins were significantlydecreased(P0.01).There was no significant difference in the above indicators between VPA+IR andHPTA+IR groups.CONCLUSION Both VPA and HPTA can radiosensitize BRCA2-deficient fibroblastcells.VPA 500 molL-1and HPTA 15 molL-1have a similiar radiosensitizing effect on EUFA423 cells.Key words:valproic acid;2-hexyl-4-pentyne acid;radiosensitization;DNA damage;breast cancersusceptibility gene 2Foundation item:National Natural Science Foundation of China(82173460);Natural Science Foundation of ShandongProvince(ZR2020MH330);Basic Public Welfare Research Program of Zhejiang Province(Q23H140011);and Preferential Funding for Postdoctoral Research Projects of Zhejiang Province(ZJ2022076)Corresponding author:FENG Zhihui,E-mail:（收稿日期：2022-06-09接受日期：2022-09-02）（本文编辑：齐春会）中国药理学与毒理学杂志 对图表的要求1.论文中的病理照片、电泳图及化学结构式图等要求以“插入”“图片”方式插入word文档，不要使用复制粘贴。病理照片必须加标尺，并以箭头指示典型病变位置。除照片外，其他图尽量不用彩色。2.统计的数据图表（包括线图和柱图等）一般通过“插入”“图表”方式插入word文档，双击该图即可直接进入此图的作图软件，看到作图数据。3.双栏图大小：宽与高的比为3 2，宽7.5 cm；通栏图大小为：宽15 cm；横、纵坐标字体为Arial，字号为8或9磅。4.论著中的图表（包括图表题和图表注）全部使用英文，要求图表自明。图表注内容包括分组设计、药物浓度、给药顺序、作用时间、指标测试时间、各种缩写的解释说明、对观察内容必要的描述和统计方法等。5.线图图例依次使用 等，柱图按组别顺序依次用空心、左斜线、右斜线和网格线填充。图例字体用Arial，字号为6磅。6.论著中的数据统计图表，应该首先进行一级比较，如模型组与正常对照组比较，结果用“*”表示；各给药组与模型组比较，为二级比较，用“#”表示；待测药各组组间比较或者与阳性对照组比较，为三级比较，用“”表示。统计学分析结果分 P0.05和P0.01两个水平给出即可。7.综述中的图表全部使用中文。702