资源描述
自由基与免疫系统
(Free Radical and Immunity)
一、 概 述
自由基对动物机体的作用，在国内外，均是一个很活跃的研究领域。在机体正常物质代谢过程中，自由基的产生、利用和消除之间，存在着动态平衡。自由基一方面参与免疫调节，以及ATP、前列腺素的合成和巨噬细胞的吞噬作用等；另一方面，也能引起机体发生癌症、诱发炎症、病理损伤及自身免疫病等。
所谓自由基(free radical, FR)是一些具有不配对电子的分子、原子、离子或原子团。实际上，它们是在外层轨道上缺少电子的原子或分子，它们一般都是高度活化的，具有很强的氧化反应能力，它们总是企图夺取其他原子或分子的电子，所以在体内，氧可参与氧化还原反应，为生物提供能量。生物细胞利用氧，一方面是通过一系列的酶反应，使氧的4个电子还原生成H2O。另一方面，氧会经过单电子还原生成氧自由基，氧自由基或称活性氧，通常包括超氧阴离子(O2·)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)和单线态氧(-O2)；以及由此而衍生的烷基过氧化物自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、烷基自由基(R·)和氢过氧化物(ROOH)等。FR在书写时，为了有别于分子、原子，常在不配对电子的元素上角标一小圆点，如·OH和RO·。随着研究的深入，新的自由基不断的发现。Grygle wshiki(1986)首次提出内皮细胞松驰因子(EDRF)可能是一种不稳定的自由基，但其化学结构不清楚，推测它可能是一种过氧化物或是花生四烯酸衍生物自由基。Palmer等(1987)正式提出EDRF就是一氧化氮(NO·)，以后经过很多实验室的大量工作证实了这一点。到目前为止已证实，某些细胞受刺激或活化过程中释放出大量的O2·，同时也产生大量的NO·。通常把NO·及其反应性氮中间体，包括亚硝酸盐(NO2-)和相关的具有高活性的氮的氧化物，统称为活性氮或氮自由基。
在生物体内，自由基虽然能够不断地产生，但也不断地被清除。在生理条件下，处于平衡状态的自由基浓度是很低的。它们不仅不会损伤机体，且还显示其独特的生理作用。最主要的是吞噬细胞在杀灭侵入机体的有害微生物过程中所产生的活性氧和活性氮；其次是前列腺素、凝血酶原在生物合成中也需要氧自由基的参与，来促进羟化反应。O2·与ATP的生成有关，还可作为基质和中间体参与体内对药物或毒物进行解毒过程。活性氮还表现出细胞内的信使功能。它是内皮细胞松驰因子，可使血管平滑肌松驰，防止血小板凝集。并参与生物体神经传导和光接受器的信号发射等。
在病理情况下，环境物理因素或外源性化学物质直接或间接诱导产生的FR，得不到及时地清除，或内源性FR的产生和清除失去了正常平衡，常常会造成FR对机体的损伤。在这些FR中，O2·可以引起细胞畸变，具有很高的细胞毒性，但它很难穿透细胞膜。O2·可以在超氧化物歧化酶(SOD)催化下，或自发歧化生成H2O2，H2O2有较强的氧化性，对细胞有一定的毒害作用。在铁离子存在时，可以发生Fenton反应，生成毒性更大的·OH，但·OH寿命极短，扩散距离很小，它只能对紧挨它的分子产生毒害。至今尚未在体内找到相应的·OH清除酶。但确有许多证据说明·OH存在于正常生命过程中。O2·和·OH还可以与细胞膜脂质反应生成RO·和ROO·等。他们虽然没有·OH和O2·反应性高，但他们的寿命分别是·OH的103和106倍，所以它们扩散的距离比·OH大得多。引起细胞损伤也不比·OH小。NO·氧化性不很强，细胞毒性也不十分明显，但它和O2·结合后，生成过氧亚硝酸根(ONOO-)阴离子。
ONOO-在略高于生理pH值时(弱碱性条件下)相当稳定。在这种状态，允许它由生成位置扩散到较远的距离。一旦在低于生理pH值(即病理)条件下，它立即分解为·OH和NO2·自由基，这两种自由基的氧化性都非常强，且具有很大的细胞毒性。
FR一旦被诱发产生，就是连锁反应，只有遇到自由基清除剂才能终止自由基反应。在体内SOD、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)能分别清除O2·、H2O2和ROO·。环境中多种物理及化学因素能诱发机体产生自由基，如：电离辐射、紫外线、臭氧、废气、杀虫剂、除草剂、抗生素、光敏剂及金属离子等等。体外亦有很多自由基清除剂，如某些食物和药品中的抗氧化剂，种类繁多的天然产物和人工合成物质。当自由基在体内大量产生与积聚时，使生理平衡遭破坏。目前认为，这种失衡的原因，一是自由基产生增多；二是机体对其的清除能力减弱；三是以上两者兼而有之。当体内活性氧浓度超过细胞清除能力时，就能产生氧化应激，如氧化应激程度超过细胞防御能力，过多的活性氧就会对细胞出现毒性效应。表现为对生物大分子有强烈的氧化破坏作用，不仅可引起细胞畸变，还具有很强的细胞毒性作用。除了对肿瘤细胞、病原微生物等有杀伤作用外，对机体组织细胞也有损伤作用。 由此可见，FR对维持机体的正常生理功能和进入病理状态都是十分重要的。尤其是它们在肿瘤、炎症、免疫以及疾病的发生发展等诸多方面均起重要作用。可以说FR与医学生物学的关系已成为非常活跃的研究领域之一，并渗透到医学的各个学科。近十年来，自由基的研究，从亚分子水平推动了免疫学的发展，并取得了令人鼓舞的显著成就。
二、 免疫系统中FR的产生与清除
(一) 自由基的产生 免疫系统中FR的产生主要来自各种免疫细胞。各种免疫细胞均能产生一定量的FR，产生FR较多者为单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。用鲁米诺(luminol)依赖性化学发光法，对人外周淋巴细胞活化早期氧自由基的生成及其类型进行了研究，结果表明，外周淋巴细胞在ConA、PHA、SPA等有丝分裂原诱导下，可迅速产生各种类型的FR。且FR的生成及释放呈一瞬态爆发过程，发生于受有丝分裂原刺激的早期。嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和肥大细胞受免疫或非免疫刺激后，可发生脱颗粒反应，脱颗粒反应伴之产生FR，其颗粒也能释放O2·。
目前诸多研究表明，免疫细胞产生FR具有可诱导性，如干酪乳酸杆菌、内毒素、阿片肽、ConA、IFN-γ等能刺激或促进免疫细胞迅速产生FR。而IFNβ、PGE２则可降低或抑制FR的产生。在抗感染及肿瘤免疫中，免疫复合物、肿瘤相关物质和酵母多糖等能刺激中性粒细胞产生FR。最近研究证实：细胞因子中IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1和GM-CSF均可诱导中性粒细胞和巨噬细胞的呼吸爆发，进而促进FR的产生。这种可诱导性在免疫学上具有重大意义。
(二) 自由基产生的机制 活性氧主要是O2·和H2O2，它们主要是亚细胞结构和代谢的主要产物。在生物体内各种组织细胞的细胞酶、电子转移过程和细胞成分的自身氧化都可以产生氧自由基。活化的巨噬细胞、中性粒细胞可以释放大量的活性氧和活性氮。许多蒽环类抗癌药物和一些醌基抗生素也能产生氧自由基。电磁辐射和粒子辐射有机组织时，其能量可以转移到细胞成分或水分子上，在有氧存在时，可以生成氧自由基。另外，各种环境试剂和芳香烃类通过细胞代谢也能产生氧自由基。但在不同的细胞内，氧自由基的产生主要是通过以下几个途径。
巨噬细胞、中性粒细胞在吞噬异物的瞬间就有摄氧、耗氧明显增加的现象(可达正常的2～20倍)，代谢增强，即所谓呼吸爆发(respiratory burst)。目前认为，在这过程中氧FR主要发生在细胞膜上由NADPH(辅酶II)氧化酶参与的反应。首先NADPH氧化酶被激活，使还原型的NADPH变成氧化型NADP+，使O2转变为O2·，O2·存在时间短暂，但可通过自发和SOD的作用转变为1O2、H2O2、·OH。一般认为酶促反应速度要比自发反应快1010倍。当体内大量NADPH耗去，又可促使葡萄糖氧化的磷酸己糖通路(HMS)启动，以补充NADPH(图1151)。
图1151NADPH的补给与氧自由基的产生
注：G6P：6磷酸葡萄糖己糖MPO：髓过氧化物酶PUFA：多聚不饱和脂肪酸HMS：磷酸己糖通路
此外，其他某些酶代谢(如环氧合酶催化花生四烯酸生成前列腺素的代谢)中氧自由基的产生也都是发生在细胞膜上的。
线粒体的正常功能是通过位于内膜上的呼吸链系统将氧还原成水，为细胞提供能量，但有1%～2%的氧生成了FR。氧浓度增高或底物琥珀酸浓度的增加，呼吸链受阻或脱偶联，都会使氧FR的产生增加。
很多可溶性细胞成分如氢醌、儿茶酚胺、黄素等可以和氧反应生成氧FR。大量可溶性黄嘌呤脱氢酶转为氧化酶，同时高能磷酸化合物分解为次黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶在催化次黄嘌呤生成尿酸过程中可释放出大量O2·。细胞内的髓过氧化酶（MPO）与卤素离子和H2O2组成“过-过-卤”系统，可产生1O。
内质网膜和核膜含有细胞色素p450和b5。它们可以自动氧化生成O2·和H2O2，也可以氧化不饱和脂肪酸生成RO·、ROO·和ROOH。NADH和NADPH是这一反应的共因子。微粒体可以转移电子直接生成O2·，也可通过包含黄素的氧化酶产生氧FR。
氮自由基是通过L-精氨酸中的胍基上的氮经酶催化氧化过程产生的(图1152)。生成的NO·是一个多活性、不稳定的化合物。它迅速分解成亚硝酸盐(NO2·)和硝酸盐(NO3-)。
图1152NO·的产生反应式
注：LNMMA：L精氧酸的类似物NOS：NO·合成酶(—)：表示酶反应被抑制
催化L-精氨酸产生NO·的酶是NO·合成酶(NOS)。新近研究表明，NOS已分离和纯化出三种类型，它们在亚细胞定位、结构、动力学调节及功能上都有较大的差别。其中两种是恒定地表达的，称为恒态NOS(cNOS)，分别存在于内皮细胞和神经元中。第三种必须经过诱导才能表达，称为诱生性NOS(iNOS)。其诱导剂包括多种细胞因子和脂多糖。体内一旦表达出活化NOS，将产生大量的NO·。能够产生NO·的细胞是多种多样的。NO·最初发现于巨噬细胞，除此以外，还有许多细胞可以产生NO·，它们包括：内皮细胞、中性粒细胞、脑细胞、枯否氏细胞、肝细胞、腺瘤细胞系以及肾上腺。
(三) 自由基的清除在正常生理状态下，FR在体内不断产生，亦不断被清除。生物体还通过对FR生成的抑制，而使其保持在最低水平，生物组织中的过渡金属可以不形成OH的形态输送、贮存氧，使组织保持在自动氧化性低的结构状态。当机体抑制机制减弱或FR生成量增加时，体内普遍存在着有效的清除活性氧的酶类和低分子化合物(抗氧化剂)。一般说，对寿命较长的O2·、H2O2、ROOH等的清除，主要由SOD、CAT、GSH-PX等参与反应，如SOD通过歧化反应及时清除掉代谢产生的O2·。而对·OH、1O2等寿命短的FR主要由低分子化合物发挥作用，如维生素A、E、K、B1、B2、胡萝卜素类、黄酮类以及某些未知物质。低分子抗氧化剂不仅对·OH、1O2有清除作用，同时参与RO·、ROO·的清除。
·OH的细胞毒性大，体内尚未找到相应的·OH清除酶。目前，在国内已有利用类似硫脲、乙醇、甘露醇的硒化物作为·OH清除剂的研究报道，这些硒化物还能清除O2·，保护细胞免遭损伤。用一些非酶硒进行清除·OH的实验表明，有机硒对·OH也有明显的清除效果。
现已知道L-精氨酸的类似物如：N-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)能够有效地竞争性地抑制NOS，虽然其中有一些对iNOS更为有效，但目前还未寻找到一种对任何NOS类型酶都具有高选择性的抑制剂。由于NO·在正常生理条件下的多重作用，因此，寻找一种安全地减少NO·的诱导作用，毒性又最小的选择抑制剂是十分必要的。
当生物体受环境因素或营养条件制约，使抑制FR产生的机制减弱或生成量增加时，机体即进入所谓氧应激态(oxidative stress)，而引发组织的应激反应。一系列具有清除氧FR
作用的酶类如SOD、CAT和GSH-PX等乃至某些低分子抗氧化物质的合成增加，以清除过多的氧自由基及其作用产物，保护组织，尤其是靶器官的膜系统不受氧化损伤。
三、 FR与免疫活性细胞
淋巴细胞受抗原或有丝分裂原刺激后，可迅速发生一系列生理及生化变化，如细胞膜流动性增强，磷脂酰肌醇代谢循环活跃、产生三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DG)，进而导致胞浆游离Ca2=浓度升高及蛋白激酶C(PKC)活化等。以上过程在淋巴细胞受刺激后的极短时间内即可完成，故称为淋巴细胞的早期活化事件。其本质反映了淋巴细胞的氧化代谢活动及氧自由基的生成。因此研究淋巴细胞的FR生成规律以及FR与免疫活性细胞之间的关系，有助于深入探讨淋巴细胞的活化及分化机制。各种淋巴细胞，包括T、B、NK和K细胞对FR的作用均有不同程度的敏感性。分述如下：
(一) FR与T细胞 许多实验表明，FR有抑制T细胞的作用。用黄嘌呤氧化酶系统产生FR并与淋巴细胞共孵育，发现孵育后的淋巴细胞E-玫瑰花环形成明显降低，ConA、PHA刺激淋巴细胞的增生分化受到抑制。加入CAT后，可逆转这种抑制。FR对T细胞的抑制是一种可逆性非细胞破坏性作用，主要效应因子是H2O2及其反应产物，细胞膜是其作用点之一。T细胞E受体在T细胞的活化方面具有重要作用。研究表明：经H2O2作用后的T细胞中，失去E-玫瑰花环形成能力的细胞不能产生IL-2，对刺激原的反应性也显著下降；而对H2O2相对耐受的T细胞产生IL-2的能力和对刺激原的反应性与正常T细胞相同。
T细胞各亚群对FR作用的敏感性并不相同。经FR作用后的T细胞再经ConA刺激，尔后用McAb检查，发现Th增加，Ts减少。在E-玫瑰花环的形成和对刺激原的反应性方面，Ts对H2O2抑制作用的敏感性也高于Th的2～4倍，这提示FR的抑制作用可能对Ts更强。一些病理组织学的检查结果也进一步说明，体内FR对淋巴细胞作用的状况与体外实验中的发现是一致。而Th对FR的相对耐受性，可以为Th保持功能提供了一个选择的机会。
NO·也可抑制T细胞的增殖。实验表明，腹腔巨噬细胞可抑制ConA或LPS诱导的小鼠脾细胞的增殖反应，抑制程度与培养上清液中NO·的浓度呈正比，加入L-NMMA后，抑制作用消失。由此认为，腹腔巨噬细胞对T细胞增殖的抑制是由NO·介导的。
最近研究提出了氧化应激态是T细胞凋亡发生的一个重要媒体(mediator)，认为T细胞激活后的结果(增殖或凋亡)决定于细胞平衡，其内部氧化-抗氧化作用的能力。其主要依据是：①通过加入FR(H2O2或NO·)或消耗细胞内抗氧化物(如HIV感染)均可使细胞凋亡；②诱导细胞内FR的生成(如通过顺铂、TNF-α、Fas抗原的作用)可引起细胞凋亡；③抗氧化的化合物可以抑制细胞凋亡(如谷胱甘肽、bc1-2和EIB基因产物)，FR介导的DNA损伤，一方面通过激活多聚ADP核糖转移酶(PADPRT)；另一方面通过激活转录因子(如NF-KB)使细胞死亡基因表达。
FR对T细胞作用机理，并不十分清楚，但多数人认为细胞膜可能是重要的作用点。FR作用于细胞膜，致使细胞膜脂质过氧化，使膜的微丝微管系统功能降低，从而影响了膜及E受体的功能。
(二) FR与B细胞 B细胞对FR的作用也相当敏感。FR对B细胞克隆的形成有抑制作用。实验选用SPA为B细胞克隆形成的刺激原，分别将鼠的B细胞按合适的比例与单核细胞或H2O2共同孵育, 观察到无论是H2O2, 还是单核细胞产生的FR对B细胞克隆形成、克隆反应性都有抑制作用。此外， FR对B细胞的增殖分化及抗体分泌的抑制，也得到了实验的证实。淋巴细胞膜上连接聚合的γ球蛋白(AHG)后，可以激活中性粒细胞产生FR，将连接AHG的B细胞与中性粒细胞共同培养，发现B细胞对中性粒细胞刺激反应性明显降低。同样，用FR产生系统作用于B细胞，也明显抑制B细胞对中性粒细胞刺激的增生反应，且B细胞产生抗体减少。因此，有人认为，B细胞是FR选择性杀伤的靶细胞，H2O2对B细胞的作用可能是通过刺激B细胞释放花生四烯酸，从而激活了环氧化酶途径，以致毒性的中间产物形成，损伤B细胞。 近年来还发现，γ射线对淋巴细胞的损伤也依赖于FR产生。其中静止期B细胞最敏感，经LPS诱导的B细胞也可被损伤。低氧状态、半胱氨酸能抑制γ射线对B细胞的作用。前者是因氧的缺乏而降低了γ射线作用下FR的产生，后者可增加B细胞内谷胱甘肽的含量，以增强B细胞清除FR的能力，且半胱氨酸本身还是FR清除剂。
(三) FR与NK细胞 NK细胞在杀伤肿瘤细胞，抗感染等方面具有重要作用。发现在人和动物肿瘤组织中，NK细胞的细胞毒活性低下，这种活性低下与共存的吞噬细胞有关。在鼠的肿瘤组织中，吞噬细胞大量存在，而NK活性显著下降，去除吞噬细胞后，NK活性恢复。这一现象在晚期肿瘤患者身上亦得到证实。用醋酸豆蔻酸盐大戟二萜醇(phorbol myristate acetate,PMA)激活中性和单核细胞，以产生FR， 观察到在FR作用下NK细胞杀伤肿瘤细胞的功能显著下降。 而缺乏PMA或用产生FR缺陷的慢性肉芽肿患者的中性粒细胞、单核细胞时，NK活性并不受影响。诸多研究已证实，吞噬细胞亦是通过产生高活性FR而对NK细胞发挥抑制作用。在FR的作用下，存活的NK细胞并未减少，表明FR对NK细胞的作用是功能性的，可能也是影响细胞膜功能的结果。
(四) FR与K细胞 K细胞参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)作用。PMA激活的中性粒细胞对K细胞参与的ADCC有抑制作用。实验用PMA激活的中性粒细胞和未被激活的中性粒细胞分别加入ADCC的反应中，比较了两种中性粒细胞对ADCC杀伤靶细胞效应的影响，发现加入激活的中性粒细胞后，ADCC对靶细胞的杀伤效应明显降低，表明ADCC受到影响。而未被激活的中性粒细胞对ADCC反应无影响。这种抑制可能关系到中性粒细胞活化时FR的产生。PMA可刺激中性粒细胞产生FR，且PMA激活的中性粒细胞对淋巴细胞增殖分化及功能的影响也是FR的作用。目前已有许多实验证实，FR产生系统、H2O2均能降低K细胞参与的ADCC反应 ，而过氧化氢酶能抑制两者作用。活化的中性粒细胞对ADCC作用可能是干扰了K细胞与靶细胞的连接。K细胞膜受FR作用后，结构功能发生改变，对靶细胞识别能力下降。而靶细胞膜在FR影响下，改变结构，又不易被K细胞识别，致使ADCC反应受到抑制。这与FR对其他淋巴细胞的影响机理有相同之处。
四、 FR与免疫防御
中性粒细胞在抵御微生物入侵，对机体防御功能方面起着重要作用。它的主要功能是吞噬作用。在其吞噬病原微生物时，氧的消耗骤增，瞬时生成大量的活性氧自由基，发挥细胞生物效应。病原体作为引发剂，激活浆膜上的NADPH氧化酶系统，催化氧分子还原成O2·，进而生成H2O2、1O2和·OH。诸FR协同作用， 迅速而有效地杀伤，继而协同溶酶体酶等因素杀灭并消化病原微生物。吞噬细胞的FR瞬时产量不足或无能会导致吞噬功能不全，这也成为感染扩散及肉芽肿形成的重要原因之一。
近几年发现许多细胞因子，如IFN-的能力，并一致认为IFN-γ及TNF-α增强机体抗感染的能力是通过单核细胞产生O2·，发挥对细胞内寄居的病原菌的杀灭作用。有实验表明，IFN-γ或TNF-α本身无直接杀灭病原作用，病原体即便吞噬后，若巨噬细胞不产生足够的O2·，亦不显示杀伤作用。慢性肉芽肿就因其吞噬细胞的胞膜上NADPH氧化酶缺陷，不产生O2·，而在肝、肺、脾、淋巴结及骨等处发生反复感染。
实验表明，在巨噬细胞吞噬过程中，有些感染菌如产单核细胞李氏杆菌，鼠伤寒沙门氏菌及组织胞浆荚膜菌的被吞噬与杀伤作用不是平行进行的。有人证实，这类微生物在巨噬细胞内仍生长繁殖，这与它们能抑制巨噬细胞产生O2·有关。IFN-γ及TNF-α可去除抑制，增强NADPH氧化酶的表达，促进O2·产生，达到杀灭细菌作用。此外，这类微生物感染机体后，可测到显著水平的IFN-γ或TNF-α。但是，一旦应用抗IFN-γ或抗TNF-α后，动物的死亡率反而增加。这在弓形体感染后，亦有类似情况出现。因而认为，TNF-α或IFN-γ在感染中的产生及存在，是维持单核细胞激发状态，刺激产生O2·所必需的。一旦用抗体中和， 势必削弱了产生O2·必不可少的条件。由此可见，IFN-γ及TNF-α可维持单核细胞抗感染作用，是通过增强NADPH氧化酶表达，促进O2·产生而实现的。
20世纪80年代后期，越来越多的研究表明，NO·与活化的巨噬细胞杀伤肿瘤细胞密切相关。活化的巨噬细胞杀伤肿瘤细胞作用具有广谱性，其机制是多种多样的，它的细胞毒效应也是多种多样的，其中包括IL-1、H2O2、TNF及溶细胞性蛋白水解酶等。自从TNF被发现以来，由于它能引起肿瘤的出血性坏死，故一直被认为是活化的巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的主要效应分子。但是，随着研究的深入进行。又发现并不是所有的肿瘤细胞系如P815、Dand、YAC-1等，均可被活化的巨噬细胞杀伤。这表明活化的巨噬细胞中还存在着另一种可以杀伤肿瘤细胞的效应分子。经过许多学者的研究证明，这种效应分子是NO·，即活化的巨噬细胞杀伤对TNF不敏感的肿瘤细胞系是通过NO· 实现的。NaNO2对P815有很强的细胞毒性；如果从培养中去除L-精氨酸，则巨噬细胞杀伤P815的能力显著减弱，同时巨噬细胞产生NO·的量也显著降低。这不仅证明了NO·是巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的一种效应分子，而且还提示出NO·与TNF的细胞毒性有明显的协同作用。发现TNF本身对MethA细胞无细胞毒性，而NaNO2则有，且毒性大小依赖于其浓度。当加入NaNO2时，TNF能对MethA细胞表现出细胞毒性，且随NaNO 2浓度的增加而增加， NaNO2加TNF 细胞毒水平总是高于NaNO2单独存在时的水平。表明NO·可促使TNF 杀伤对TNF 不敏感的肿瘤细胞。用NO·的饱和溶液处理L1210细胞系，可抑制其生长呼吸，抑制程度依赖于NO·的浓度。此外，还发现，L-精氨酸氧化生成的稳定的终产物亚硝酸盐或硝酸盐不能抑制细胞生长，但在能转变成NO·或NO2·的微酸性条件下，可抑制其生长。这些都证实了NO·是巨噬细胞介导的细胞毒活性中真正的效应分子的观点。图1153NO·介导的杀伤机制
目前认为，NO·的杀伤机制是通过抑制线粒体呼吸作用。NO·可与Fe-S基团结合， 形成铁亚硝酰基复合物，从而引起顺乌头酸酶(aconitase)和线粒体呼吸链上的复合物Ⅰ与复合物Ⅱ中的Fe-S辅基的钝化与降解（图1153），从而引起细胞毒性效应。
此外，在机体感染寄生虫时，血中嗜酸性粒细胞(Eos)反应性增强，尤其是低密度的Eos(HEo)可被大量激活。试验证实：酵母多糖激活血清处理HEo后，其膜的戊糖转运增加，氧代谢增强。蛋白激酶C活性显著提高，此酶介导信息传递，对细胞的功能活动，如呼吸爆发、脱颗粒等起重要作用，表明HEo有功能性激活，激活过程产生大量FR，参与机体的抗蠕虫反应。Eos膜表面有低亲和力的IgE(Fcε RⅡ)、IgG(Fcγ RⅡ)和补体受体(CR3)等。Fcγ RⅡ介导细胞的呼吸爆发和吞噬作用；Fcε RⅡ介导IgE依赖性的寄生虫细胞毒性。寄生虫感染患者的Eos直接参与杀伤IgE包被的寄生虫目标。其杀伤作用依赖于O2·。在体外，已确认NO·能抑制多种寄生虫，如曼氏裂体吸虫、布氏锥虫的细胞外型、克氏锥虫、鼠弓形体、利什曼原虫、鼠疟的肝细胞内型、恶性疟原虫等等。
五、 FR与病理损伤
在机体内，所有需氧的生理过程，均有自由基产生，并且自身还有着清除自由基的机制，但两者一旦失去平衡，过剩的自由基就会为非作歹，引起病理损伤。FR在体内自由地游荡，一有机会，就会夺取电子，伤害无辜，如细胞膜都含有很多不饱和脂肪酸，FR与这些脂肪酸反应，会造成所谓的“氧化损伤”，就像在膜上烧个洞，使膜发生紊乱，加速细胞的衰老或死亡。现就FR引起的病理损伤，从如下几方面简述。
(一) 炎症介质作用 由于FR作用的靶细胞和分子无特异选择性，故FR在参与防御作用时，也给组织细胞造成损伤，这种损伤作用，在病理过程中有时占主导地位，构成了矛盾的主要方面。FR可攻击组织细胞膜性结构造成直接损伤，亦可氧化灭活蛋白酶抑制剂，致使蛋白酶释放，间接引起或加重组织细胞损伤。
蛋白质或酶不仅是生物体重要组成成分，而且在生命活动中，还担负着许多重要功能，活性氧、活性氮对其损伤势必会引发或加重某些疾病的病理生理过程。现已有报道，肾小球肾炎、动脉粥样硬化、糖尿病、胃肠溃疡、某些自身免疫性疾病、放射病、肺气肿、白内障等许多疾病与FR所致蛋白质氧化损伤有关。此外，还有在心血管疾患、烧伤及外科手术等情况下，缺血-重灌流病理过程中的损伤，亦认为FR的产生是造成这一过程中组织损伤重要因素之一。
用内毒素复制试验兔多器官衰竭模型时，发现与对照组相比，实验组动物血液及脏器中的FR水平显著升高，且与脏器功能障碍程度呈正相关。同时SOD活性下降程度与其FR水平升高程度基本上是一致的。表明FR参与了感染所致的多器官衰竭的发生发展。
由此可见，FR在急性和慢性炎症反应中起着重要作用。有的研究结果认为，感染后内源性IFN-γ和TNF-α的产生，可介导炎症发生。 是因为如在短时间内大量产生TNF-α、IFN-γ，将全身大量巨噬细胞激活，必将产生大量的O2·，导致机体的严重损伤。
损伤程度与产生IFN-γ、TNF-α的速率、数量有关。内源性IFN-γ、TNF-α虽是维持机体抗感染所必可少，但大量产生则又“走向问题的反面”。
抗氧化酶(SOD和CAT)以及FR清除剂（维生素E或二甲基硫化物）的抗炎或抑制炎症，防护关节炎患者滑膜液的降解，明显减轻实验性自身免疫性眼色素膜视网膜炎症反应，以及用于多器官衰竭治疗等，都从另一角度有力地证明了FR的重要炎症介质作用。
(二) 对淋巴细胞的损伤 FR对DNA的损害可使淋巴细胞功能丧失。已经证明，FR参与了放射线对淋巴细胞的损伤，如γ射线对B细胞的抗体合成有抑制作用。FR对淋巴细胞的损伤作用，B细胞似乎较T细胞更为敏感。FR对参与肿瘤杀伤的NK细胞，亦有一定的损伤作用。且已证明，FR对T细胞活化的影响，在其IL-2受体表达之前即已发生。这方面内容在前已有叙述，不再赘述。
(三) 参与超敏反应 嗜碱性粒细胞和肥大细胞在炎症和速发型超敏反应中具有重要作用。聚集的IgE 与这些细胞表面高亲合力的受体(Fcε RⅡ)相结合，可引起细胞脱颗粒，以及释放许多作用较强的炎症介质，如组织胺、蛋白酶、趋化因子、花生四烯酸代谢产物和细胞因子等。在这过程中，亦释放出大量的FR。在实验鼠的肥大细胞和嗜碱性粒细胞内可测到SOD，这是其分泌颗粒在某些阳离子刺激下释放组织胺的同时伴有O2·和SOD 的释放， 用抗IgE抗体亦能刺激肥大细胞释放SOD。另外，抗原、运动激发哮喘后以及过敏性鼻炎患者在花粉季节出现的HEo增多，亦涉及到速发型过敏反应的有关介质和FR的释放。 这都显示FR参与了速发型变态反应。
FR与免疫复合物性疾病的关系已基本搞清。免疫复合物和补体C5a活化， 促进中性粒细胞等吞噬细胞产生O2·和H2O2等，这些FR 直接或通过灭活α-蛋白酶抑制剂间接地致组织损伤；另一方面刺激花生四烯酸代谢生成白三烯类趋化性类脂，放大炎症反应，结合其他病理因素，共同引起组织病理损伤。这在免疫复合物诱发的急性肺损伤、肾小球损伤和眼内炎病症中均得到证实。
(四) FR与肿瘤的发生 尽管FR对肿瘤有一定杀伤作用，但事实表明FR也参与了肿瘤的发生发展过程。其依据是：①某些类型的致癌因子的活性形式是FR；②癌变涉及到FR启动的异常化学反应；③增加的FR具有免疫损伤或免疫抑制作用，因此认为，FR在肿瘤发生学上可能为早期诱发和促进因素之一。现在已发现癌变的两个阶段(诱发与促生)都有氧FR的参与。致癌物质必须经过代谢，经物理化学因素作用，使之成为FR后才致癌。生成FR的能力与致癌能力间有平行关系。年老者抗氧化能力低下，伴免疫功能下降，肿瘤发生率增加；白血病成人和儿童患者血中O2·升高，即为佐证。
FR参与肿瘤发生可能是其致核酸分子断裂或碱基改变等异常，从而使基因突变或变异，作为原发性肿瘤发生之基础。同时，增加的FR通过对免疫系统的抑制或损伤，使免疫功能，尤其是免疫监视和维持自身稳定功能低下，不能有效地将突变的细胞及时消灭清除，遂使肿瘤得以生成蔓延。
一些药物所以能抗肿瘤也与氧FR有关。这并不矛盾，因为无论致肿瘤还是抗肿瘤，其生物分子基础都是共同的。即FR使DNA损伤，如改变了细胞原有的状态，就会产生诱发肿瘤或抗肿瘤的结果。许多致癌物(C)经细胞活化而生成致癌自由基(C·)，C·能使DNA转变成DNA·，随后形成DNA-C加合物， 这种加合物可能是癌变诱发阶段的关键因子。如果非致癌物N与致癌物竞争，生成DNA-N加合物，保护DNA免遭C·的攻击，从而阻止癌变。
六、 FR与免疫调节
生物学过程中的重要现象是调节（regulation)。调节既包括促进，也包括抑制。这两个方面的消长、制约，使各种生物学过程得以在质和量上保持适度。FR生成消除系统与免疫系统存在着相互调节的作用。
(一) 调节免疫活性细胞 FR通过抑制淋巴细胞的DNA合成，介导了对有丝分裂和分化增殖的抑制作用。研究者们认为，Th与Ts细胞对FR作用的敏感性不同，这在触发和维持免疫调节系统中的不平衡方面有重要免疫学意义，局部高浓度的FR可选择性地破坏Ts细胞亚群，而参与局部免疫反应的调节。
Stein等(1987)通过观察免疫佐剂两性霉素对高CAT和低CAT鼠系的不同影响，认为细胞内过氧化作用产生的FR参与甚至决定了基因调节。CAT能恢复淋巴细胞的IL-2受体表达及其增殖反应，IFN-γ与CAT具有协同作用。FR可抑制B细胞的克隆反应和抗体生成，呈现与免疫负反馈抑制剂PGE类似的协同作用。例如，在柯杰金氏病人中，PG合成抑制剂消炎痛和CAT分别使用， 均只能部分解除单核细胞介导的淋巴细胞的抑制作用。而两者联合使用，则可完全解除这种抑制作用。青霉胺亦是通过H2O2特异性抑制T细胞而发挥其治疗作用的。 巨噬细胞的激活受多种因素的调节，其“呼吸爆发”反应过程产生大量FR。资料表明，不同刺激剂如酵母多糖、A23187、PMA等均能触发巨噬细胞的“呼吸爆发”反应，提示它们可能有相同或相似的信使转导机制。研究发现，“呼吸爆发”的刺激-反应偶联机制与多因素有关，其中钙调蛋白(calmoclulin, calm) 与钙是主要因素之一。 calm是一种能与Ca2+结合，起着调节细胞功能的蛋白质。Ca2+可增加大鼠和豚鼠肺泡巨噬细胞的吞噬功能。用三氟拉嗪等药物阻滞calm后，Ca2+增强肺泡巨噬细胞吞噬功能的作用消失。使用calm抑制剂能抑制IFN-γ和LPS对巨噬细胞的活化作用。 细胞外Ca2+明显影响酵母多糖和FMLP的刺激作用：无Ca2+可显著抑制H2O2和O2·释放， 而calm可对抗其抑制作用,表明calmCa2+在巨噬细胞激活以及调节“呼吸爆发”反应中起重要作用。
(二) 调节花生四烯酸代谢 FR在免疫网络系统中还与花生四烯酸及其代谢物PG等相互影响而呈现免疫调节作用。PG的产生过程中伴随着FR的生成。低浓度的FR对该代谢中的代谢酶(环氧化酶和脂氧化酶)有激活作用，高浓度时，则对之起抑制作用。主要是通过·OH灭活环氧化酶和脂氧化酶，从而抑制PG、白三烯和FR的产生， 起着自我反馈抑制作用。而FR的清除剂能增加PG的产生。
PGE2可抑制巨噬细胞产生的FR所致的炎症反应，减轻对组织的损伤。这可能是抑制了FR对溶酶体的损害，从而抑制了溶酶体酶释放的缘故。这样，消炎痛在抑制PG和FR的产生时，也降低了PGE2对FR的拮抗作用。
(三) 调节某些细胞因子 Ding等研究了12种细胞因子对静止的和受到诱导的巨噬细胞产生H2O2或NO2·的作用。结果证明：①IFN-γ是唯一诱导NO2·和H2O2 释放的细胞因子；②导致H2O2和NO2·生成的通路是独立的；③IFN-γ、IFN-α和IFN-β单用，或IFN-α、β、γ和LPS合用能协同地诱导NO2·释放。对IFN-γ和TNF-α诱导巨噬细胞生成NO·的机制研究发现，内源性生成的TNF参与了诱导作用，以及巨噬细胞的L-精氨酸通路的激活不只是通过内源性TNF。
(四) 与cAMP之间的互相调节 研究还表明，cAMP以及能使细胞cAMP水平增高的因子均可抑制由免疫复合物、趋化肽、A23187等诱导的巨噬细胞和中性粒细胞O2·的释放，提示cAMP在巨噬细胞内信使转导过程中，可能起着负反馈调节作用；但cAMP和PGE1不能抑制PMA诱导的人类中性粒细胞内cAMP水平迅速升高，且先于O2·生成与溶酶体的释放，提示cAMP可能起着第二信使的作用。可是，能使细胞内cAMP水平升高的药物，如肾上腺受体激活剂可抑制中性粒细胞的反应，ConA可诱导中性粒细胞O2·的释放， 但不引起细胞内cAMP的变化。 综上所述，机体组织，包括免疫细胞不断地产生相当量的FR，影响和调节着机体的代谢和免疫功能。FR不仅在吞噬细胞的吞噬过程、免疫调节及抗肿瘤的防御过程中起着重要作用。而且在炎症，免疫病理损伤及原发性肿瘤的发生发展等方面也起着一定的诱发、放大或促进作用，呈现对机体的损害。深入研究FR与免疫的关系，充分发挥和促进其对机体免疫的有益作用，控制或减少其损害作用，对基础和临床免疫学的发展都将是必要的。
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