重组DNA技术与基因工程6.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,重组,D,NA,技术与,基因工程,5,2,3,4,1,6,重组,DNA,技术与基因工程的基本概念,重组,DNA,技术所需的基本条件,重组,DNA,技术的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在酵母中的表达,酵母的分类学特征,酵母菌（,Yeast,）,是一群以,芽殖,或,裂殖,方式进行,无性繁殖,的单细,胞,真核生物,，分属于,子囊菌纲,（子囊酵母菌）、,担子菌纲,（担子酵母,菌）、,半知菌类,（,半知酵母菌,），共由,56,个属和,500,多个种组成。如,果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最,成熟的真核生物表达系统。,A,酵母作为表达外源基因受体的特征,6,外源基因在酵母中的表达,酵母表达外源基因的优势,全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传操作简便,能将外源基因表达产物分泌至培养基中,具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统,大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉,不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国,FDA,认定为安全的,基因工程受体系统（,Generally Recognized As Safe GRAS）,酵母是最简单的真核模式生物,A,酵母作为表达外源基因受体的特征,酵母的受体系统,B,目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母包括：,酵母属 如,酿酒酵母,（,Saccharomyces cerevisiae,）,克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（,Kluyveromyces lactis,）,毕赤酵母属 如,巴斯德毕赤酵母,（,Pichia pastoris,）,裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（,Schizosaccharomyces pombe,）,汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（,Hansenula polymorpha,）,其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母,表达外源基因最理想。,6,外源基因在酵母中的表达,提高重组蛋白表达产率的突变型受体,抑制超糖基化作用的突变型受体,衰减泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体,酵母的受体系统,B,6,外源基因在酵母中的表达,提高重组蛋白表达产率的突变型受体,能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型：,ssc,1,ssc,2,rgr,1,ose,1,ssc,11,rho,-,突变类型,生物效应,作用位点,改善重组蛋白分泌,钙离子依赖型的,ATP,酶,提高重组蛋白表达,转录后加工,转录水平,提高重组蛋白表达,转录水平,提高重组蛋白表达,改善重组蛋白分泌,羧肽酶,Y,转录水平,提高重组蛋白表达,抑制超糖基化作用的突变型受体,能抑制超糖基化的突变类型,mnn,alg,och,突变类型,生物效应,许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们,常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由,糖基核心,和,外侧糖链,两部分,组成。,酵母菌普遍拥有蛋白,质的糖基化系统，但野生,型酿酒酵母对异源蛋白的,糖基化反应很难控制，呈,超糖基化倾向，因此超糖,基化缺陷株非常重要。,甘露糖生物合成缺陷型,天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型,外侧糖链添加缺陷型,衰减泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体,泛素介导的蛋白质降解作用,蛋白酶体,Lys,HOOC,Ubiquitin 76 aa,ubiquitin ligase E3,Lys,ubiquitin ligase E3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体,酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因,酵母共有四个泛素编码基因：,UBI,1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（,CEP52）,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（,CEP52）,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（,CEP76）,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达,酵母共有七个泛素连接酶基因：,UBC,1、,UBC,2、,UBC,3、,UBC,4、,UBC,5、,UBC,6、,UBC,7,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体,泛素降解途径衰减的酿酒酵母,在酿酒酵母菌中，泛素主要由,UBI,4基因表达，,UBI,4,-,突变株能,UBI,4缺陷型：,正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，,因此,UBI,4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。,UBA,1缺陷型：,UBA,1编码泛素激活酶,E1，,UBA,1突变株是致死性的，但其等位,基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。,Ubc4,-,ubc5,双突变型：,七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。,酵母克隆表达质粒的构建,酵母中的野生型质粒,酵母的载体系统,C,6,外源基因在酵母中的表达,酵母中的野生型质粒,酿酒酵母中的2,m,环状质粒,同源重组,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,B,几乎所有的酿酒酵母中都含有2,m,双链,环状质粒，拷贝数达50至100个。,IRs,反向重复序列，600,bp，,重组,FLP,编码产物驱动,IRs,的同源重组,REP,编码产物控制质粒的稳定性,STB,REP,的结合位点,接合酵母属中的,pSR1,和,pSB1，,以及,克鲁维酵母属中的,pKD1,等均与2,m,质,粒类似。,乳酸克鲁维酵母中的线,状质粒,乳酸克鲁维酵母中含有两种不同,pGKL1 8.9 kb,DNA,聚合酶,毒素蛋白,ab,免疫蛋白,g,亚基,的双链线状质粒,pGKL1,和,pGKL1,拷贝数为50-100个，分别携带,K1,K2,两种能使多种酵母菌致死的毒,反向重复序列,素蛋白编码基因（,a b g,），,同时,酵母中的野生型质粒,含有毒素蛋白抗性基因。,酵母克隆表达质粒的构建,含有,ARS,的,YRp,质粒的构建,ARS,为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5,kb，,染色体上每30-40,kb,就有一个,ARS,元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标,记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒,DNA。,以,ARS,为复制子的质粒称为,YRp,上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代,以,2,m,质粒上的复制元件为复制子的质粒称为,YEp,后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。,含有,CEN,的,YCp,质粒的构建,CEN,为酵母菌染色体,DNA,上与染色体均匀分配有关的序列,将,CEN,DNA,插入含,ARS,的质粒中，获得的新载体称为,YCp,YCp,质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个,酵母克隆表达质粒的构建,YAC,载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列,酵母人造染色体的构建：,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Ap,r,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的,选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的,选择标记,YAC,载体的装载量为,350-400,kb,含有,TEL,的,YAC,质粒的构建,酵母克隆表达质粒的构建,酵母人造染色体的使用：,pYAC4,CEN,EcoRI,URA,TEL,BamHI,TEL,ori,Ap,r,TRP,ARS,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,含有,TEL,的,YAC,质粒的构建,酵母克隆表达质粒的构建,含有酵母菌染色体,DNA,同源序列的,YIp,质粒的构建,在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体,DNA,特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为,Yip,。,目的基因表达盒通常插在染色体,DNA,特定序列中，这样目的基因就能借助同源重组高效整合入酵母菌特定的,染色体,DNA,区域。,酵母克隆表达质粒的构建,酵母的转化程序,转化质粒在酵母细胞中的命运,用于酵母转化子筛选的标记基因,酵母的转化系统,D,6,外源基因在酵母中的表达,酵母的转化程序,酵母菌原生质体转化法,早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法,在,Ca,2+,和,PEG,的存在下，转化细胞可达原生质体总数的,1-2%,。但该程,序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。,原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多,个质粒分子，而且这种,共转化,的原生质体占转化子总数的,25-33%,。,碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化,酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如,Li,+,等）、,PEG、,热休克处,理后，也可高效吸收质粒,DNA，,而且具有下列特性：,吸收线型,DNA,的能力明显,大于环状,DNA,，,两者相差80倍,共转化现象极为罕见,酵母的转化程序,酵母电击转化法,酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒,DNA，,但,在此过程中应避免使用,PEG，,它对受电击的细胞具有较很大的负作用,电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围,广，而且转化率可高达,10,5,/,m,g DNA,。,酵母的转化程序,转化质粒在酵母细胞中的命运,单双链,DNA,均可转化酵母菌，但,单链的转化率是双链的10-30倍,；,含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制；,不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地,同源整合,入染色体,这对于体内定点突变酵母基因组极为有利；,克隆在,YIp,整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体,DNA,的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的,50-80%。,用于酵母转化子筛选的标记基因,营养缺陷型的互补基因,用于酵母转化子筛选的标记基因主要有,营养缺陷型互补基因,和,显性基因,两大类：,营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：,LEU,、,TRP,、,HIS,、,LYS,、,URA,、,ADE,但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。,显性标记基因的编码产物大都是毒性物质的抗性蛋白,显性标记基因,aph,氨基糖苷转移酶,抗,G418,cat,氯霉素乙酰转移酶,抗氯霉素,dhfr,二氢叶酸还原酶,抗氨甲喋呤和磺胺,cup1,铜离子螯合物,耐受铜离子,suc2,蔗糖转化酶,耐受高浓度蔗糖,ilv2,乙酰乳糖合成酶,抗硫酰脲除草剂,标记基因,编码产物,遗传表型,用于酵母转化子筛选的标记基因,用于酵母转化子筛选的标记基因,显性标记基因,酿酒酵母的生长为,氨甲喋呤,和,对氨基苯磺酰胺,的混合物所抑制，前者抑制二氢叶酸还原酶的活性，后者则阻止四氢叶酸的生物合成。因此在酵母载体上过量表达,二氢叶酸还原酶,基因（,dhfr,），可以有效抵消由于氨甲喋呤抑制所造成的酵母内源性二氢叶酸还原酶活性的不足。,酵母启动子的可控性,外源基因在酵母中表达的限制因素,酵母表达系统的选择,酵母的表达系统,E,6,外源基因在酵母中的表达,酵母启动子的可控性,温度控制型启动子,pho4,TS,-PHO5,启动子：,酿酒酵母,PHO5,启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开；,PHO4,基因编码产物是,PHO5,启动子的正调控因子；,因此，装在,pho4,TS,-PHO5,启动子下游的外源基因在35,时关闭，,23,诱导,表达。,PHO4,温度敏感型突变基因,pho4,TS,的编码产物在,35,时失活；,a,型启动子,hml,a,2-102,MATa,a1,Sir3-8,TS,a,型启动子,受体细胞基因组 重组质粒,a,型启动子,hml,a,2-102,MATa,a1,Sir3-8,TS,a,型启动子,a,2,a,1,25,35,a,-,a,型启动子：,酿酒酵母有,a,和,a,两种单倍体，分别由,MAT,a,和,MAT,a,两个等位基因决定。,a,1,因子决定,a,细胞特征表达,a,2,因子阻遏,a,细胞,特征表达,a1-a2,阻遏,a,细胞特征表达,编码,a,2,因子的基因突变型,hml,a,2-102,能产生,a,2,变体，它能灭活,a1,，,同时阻遏,a,型,酵母启动子的可控性,温度控制型启动子,超诱导型启动子,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导时，,GAL4,高效表达，,GAL1,、,GAL1,、,GAL10,超高效表达,GAL10,Promoter,酿酒酵母,的半乳糖,利用酶系,由,GAL1,GAL7,和,GAL10,基因编码,酵母启动子的可控性,外源基因在酵母中表达的限制因素,外源基因稳态,mRNA,的浓度,外源基因,mRNA,的翻译活性,酵母菌对密码子的偏爱性,在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶,GAPDH,、,磷酸甘油激酶,PKG,、,乙醇脱氢酶,ADH,）,中,96%,以上的氨基酸是由,25,个密码子编码的。,酵母表达系统的选择,酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油,醛-3-磷酸脱氢酶基因,GAPDH,、,磷酸甘油激酶基因,PKG,、,乙醇脱氢,酿酒酵母表达系统,酶基因,ADH,所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。,酿酒酵母表达系统的最大问题在于其,超糖基化,能力，往往使得,有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能,大量分泌。这一缺陷可用,非酿酒酵母,型的表达系统来弥补。,乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒,pKD1,已被广泛用作重组异源,蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也,乳酸克鲁维酵母表达系统,能稳定遗传40代以上。,乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优,于酿酒酵母表达系统。,酵母表达系统的选择,巴斯德毕赤酵母是一种,甲基营养菌,，能在低廉的甲醇培养基中生,巴斯德毕赤酵母表达系统,长，,甲醇,可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。因此,生长,迅速,、乙醇氧化酶基因,AOX,1,所属强启动子、表达的,可诱导性,是巴斯,德毕赤酵母表达系统的三大优势。,由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因,的表达序列一般整合入受体的染色体,DNA,上。在此情况下，外源基因,具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。,的高效表达在一定程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种,酵母表达系统的选择,巴斯德毕赤酵母表达系统,酵母表达系统的选择,多型汉逊酵母也是一种,甲基营养菌,。其自主复制序列,HARS,已被,多型汉逊酵母表达系统,克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载,体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，,HARS,质粒,能高频自发地整合在受体的染色体,DNA,上，甚至可以连续整合,100,多,目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获,个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。,得成功表达。,酵母表达系统的选择,由,乙型肝炎病毒,（,HBV,）,感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重,的传染病，每年约有,200万,病人死亡，并有,3亿,人成为,HBV,携带者，其,中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒,还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒,感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其,广泛应用提供了可靠的保证。,利用重组酵母生产乙肝疫苗,F,6,外源基因在酵母中的表达,产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,乙型肝炎病毒的结构与性质,产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,利用重组酵母生产乙肝疫苗,F,6,外源基因在酵母中的表达,乙型肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒是一种蛋白包裹型的,双链,DNA,病毒,，具有感染力的病毒,乙型肝炎病毒的结构,颗粒呈球面状，直径为,42,nm,，,基因组仅为,3.2,kb,。,病毒颗粒的主要结,构蛋白是病毒的,表面抗原,多肽（,HBsAg,）或,S,多肽，它具有糖基化和,非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括,核心抗原,（,HBcAg,）、,病,除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的,22,毒,DNA,聚合酶亚基,、,微量病毒蛋白,。,nm,的,空壳亚病毒颗粒,，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的,1000,倍,。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：,S,、,M,、,L,多肽,。,乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因,ATG,ATG,ATG,TAA,108 aa,55 aa,226 aa,preS1,preS2,S,S,多肽,226 aa,M,多肽,281 aa,L,多肽,399 aa,乙型肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫,传统乙肝疫苗的制备,苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的,疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。,乙型肝炎病毒的结构与性质,产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组,HBsAg，,主要工作包括,将,S,多肽的编码置于,ADH1,启动子,控制下，转化子能表达出具有免疫活,性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平,均颗粒直径为22,nm，,其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中,的病毒颗粒相同。,目前，由酿酒酵母生产的重组,HBsAg,颗粒已作为乙肝疫苗商品化,重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的,1%-2%,。,进一步的研究表明，,M,多肽和,L,多肽对,S,型疫苗具有显著的增效作,用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对,S,抗,原缺乏响应的人群的免疫反应。,产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建,PARS2,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,Bgl II,pBSAG151,11 kb,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,his,+,的转化子,重组分子,转化,his,-,的受体细胞,染色体,DNA,重组巴斯德毕赤酵母的性能,由于巴斯德毕赤酵母染色体,DNA,上还拥有第二个乙醇氧化酶基因,AOX2,，,所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。,重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲,醇诱导,HBsAg,表达，最终,S,蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%,在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240,L,的发酵罐,中培养，最终可获得,90克,22,nm,的,HBsAg,颗粒，足够制成,900万份,乙肝,疫苗。,产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,G,酵母糖蛋白生产的人源化改造,6,外源基因在酵母中的表达,除抗体外，哺乳动物绝大多数糖蛋白的半衰期和功能依赖于糖链末端的,唾液酸,，其它裸露的末端糖（如甘露糖、,N-,乙酰葡糖胺、半乳糖等）会被糖特异性的受体或凝集素清除。由于不少药用糖蛋白需要唾液酸化，因此其生产目前只能依靠哺乳动物受体，因为后者能进行人样化的,N-,糖基化,反应，包括在末端加唾液酸的能力。酵母和丝状真菌作为重组蛋白表达系统，与哺乳动物细胞相比，具有较高的重组蛋白表达率、较短的发酵周期、能在化学成分确定的培养基中生长等很多优势。然而，野生型酵母往往将高甘露糖型的多糖链加在蛋白质上，直接影响表达产,物在人体内的稳定性与功效。,ER,ER,两种多糖合成途径的比较,人类糖蛋白侧链多聚糖的成熟，涉及下列基因编码的酶系：,MnsI,：,-1,2-,甘露糖苷酶,I,MnsII,：,-1,2-,甘露糖苷酶,II,GnTI,：,-1,2-,N,-乙酰葡糖胺转移酶,I,GnTII,：,-1,2-,N,-乙酰葡糖胺转移酶,I,I,GalT,：,-1,4,-半乳糖苷转移酶,SiaT,：,-2,6-唾液酸苷转移酶,巴斯德毕赤酵母细胞中不存在上述酶系。,巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造,JC308 WT,RDP750,YSH557,YSH597,Y11430 WT,YSH551,Stephen R.Hamilton,et al,.,Science,313,.1441.2006,敲除,4,个基因，摧毁,巴斯德毕赤酵母原有的超糖基化系统：,D,och1,，,pno1,，,mnn4B,，,bmt2,导入,9,个基因，构建,人的糖基化系统：,UgnT,：小鼠的,UDP-,N,-,乙酰葡糖胺转运蛋白,UgnT,：克鲁维酵母的,UDP-,N,-,乙酰葡糖胺转运蛋白,MnsI,：小鼠的,-1,2-,甘露糖苷酶,I,MnsII,：果蝇的,-1,2-,甘露糖苷酶,II,GnTI,：人的,-1,2-N-,乙酰葡糖胺转移酶,I,GnTII,：大鼠的,-1,2-N-,乙酰葡糖胺转移酶,II,GalE,：裂殖酵母的,半乳糖差向异构酶,GalE,：果蝇的,UDP-,半乳糖转运蛋白,GalT,：,人的,-1,4-,半乳糖苷转移酶,YSH577,rEPO,巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造,JC308 WT,RDP750,YSH557,YSH597,Y11430 WT,YSH551,Stephen R.Hamilton,et al,.,Science,313,.1441.2006,YSH577,rEPO,JC308 WT,RDP750,b,-1,N-GlcNAc,b,-1,4-GlcNAc,b,-1,2-GlcNAc,b,-1,4-Man,a,-1,6-Man,a,-1,3-Man,a,-1,2-Man,b,-1,4-Gal,巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造,JC308 WT,RDP750,YSH557,YSH597,Y11430 WT,YSH551,Stephen R.Hamilton,et al,.,Science,313,.1441.2006,YSH577,rEPO,再导入,5,个基因，构建,末端唾液酸的添加系统：,GNE,：人的,UDP-,N,-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶,/,SPS,：人的,N,-,乙酰甘露糖胺丙酮酸,-9-,磷酸合成酶,CSS,：人的,CMP-唾液酸合成酶,CST,：小鼠的,CMP-,唾液酸运输因子,ST,：人的,唾液酸转移酶与酵母,I,I,型转膜定位肽,遗憾的是，,YSH577,株并未像预期的那样在糖基末端有效添加,唾液酸。,N,-乙酰甘露糖胺激酶,融,合体,巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造,JC308 WT,RDP750,YSH557,YSH597,Y11430 WT,YSH551,Stephen R.Hamilton,et al,.,Science,313,.1441.2006,YSH577,rEPO,改善唾液酸化反应的效率：,优化,GNE,、,SPS,、,CSS,、,CST,基因的密码子；,构建其它形式的,唾液酸转移酶,（,ST,）融合肽，发现来自小鼠,-2,6-ST,的催化功能域与酿酒酵母甘露糖基转移酶,1,将上述五个基因全部克隆在一个表达载体上，并用该表,（,Mnt1,）的靶向信号肽相融合的嵌合体，特别有效；,达载体转化,YSH577,株，获得,YSH597,株。,巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造,JC308 WT,RDP750,YSH557,YSH597,Y11430 WT,YSH551,Stephen R.Hamilton,et al,.,Science,313,.1441.2006,YSH577,rEPO,JC308 WT,YSH597,b,-1,N-GlcNAc,b,-1,4-GlcNAc,b,-1,2-GlcNAc,b,-1,4-Man,a,-1,6-Man,a,-1,3-Man,a,-1,2-Man,b,-1,4-Gal,a,-2,6-Sia,RDP750,重组巴斯德毕赤酵母分泌的,rEPO,的鉴定,JC308 WT,RDP750,YSH557,YSH597,Y11430 WT,YSH551,YSH577,rEPO,重组rEPO的,HPLC,图谱分析：,重组巴斯德毕赤酵母分泌的,rEPO,的鉴定,JC308 WT,RDP750,YSH557,YSH597,Y11430 WT,YSH551,YSH577,rEPO,重组rEPO的血细胞比容分析,：,YSH551株,YSH5,97,株,注射第,8,天,注射第,15,天,H,酵母转录机器的基因工程综合改造,6,外源基因在酵母中的表达,化石能源的日益消耗大大促进了可再生型生物燃料（如乙醇等）的开发与生产。然而，大规模发酵生产燃料乙醇的关键是酵母对高浓度乙醇和葡萄糖的耐受性。长期以来，人们普遍关注的是对乙醇生物合成基因和耐受基因的遗传操作，这些努力虽然取得了显著的进步，但似乎触及了极限。基因工程改良能否突破这一极限呢？,Hal Alper,等人提出的所谓,转录机器综合基因操作战略,（,Global transcription machinery,engineering,，,gTME,）让我们看到了新的希望。,酿酒酵母转录机器的定向改造,在酿酒酵母中，乙醇生物合成基因与其他看家基因一样，由,RNA,聚合酶,II,负责转录。,RNA,聚合酶,II,系统包含,75,种一般转录因子或共激活因子，其中最关键的是,TFIID,复合物，包含,TATA-BOX,结合蛋白,（,TBP,，由基因,SPT15,编码）及其及,14,种激活因子（,TAFs,）。有证据显示，,TATA-BOX,结合蛋白的突变会改变,RNA,聚合酶对启动子的特异性识别性质，进而影响众多不同基因的表达谱。这便是,转录机器综合基因操作战略,的,Hal Alper,et al,.,Science,314,.1565.2006,理论基础。,TATA-BOX,TBP,TAFs,TFIID complex,酿酒酵母转录机器的定向改造,Hal Alper,et al,.,Science,314,.1565.2006,利用易错,PCR,技术,构建,SPT15,的突变文库,，转入酿酒酵母标准单倍体,BY4741,株，该单倍体含有内源性野生型的,SPT15,染色体拷贝。然后在逐次提高的高浓度乙醇和葡萄糖存在下筛选耐受,突变株。,当筛选压力增加到,6%,的乙,醇和,120g/L,的葡萄糖时，获得,spt15-300,突变株，它相对野生株的耐受倍数达,13,倍。,酿酒酵母转录机器的定向改造,Hal Alper,et al,.,Science,314,.1565.2006,利用易错,PCR,技术,构建,SPT15,的突变文库,，转入酿酒酵母标准单倍体,BY4741,株，该单倍体含有内源性野生型的,SPT15,染色体拷贝。然后在逐次提高的高浓度乙醇和葡萄糖存在下筛选耐受,突变株。,spt15-300,突变株即使在,15%,的乙醇存在下，也显示出比对照野生株高出近,1,倍的耐受性。,spt15-300,突变株的鉴定,Hal Alper,et al,.,Science,314,.1565.2006,具有优良特性的,spt15-300,突变株包含三个突变位点，它们均集中在,TBP,的重复序列,2,结构域中。实验结果显示，任何单一或两两组合位点的突变，都不能产生显著的功效，,巴斯德毕赤酵母,TATA-BOX,结合蛋白变体,Spt15-300,Repeat Element 1,Repeat Element 2,Helix 2,Helix 2,F177S,Y195H,K218R,突变的相对累积效应,1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0.0,这充分表明三联突变的重要性。,spt15-300,突变株的鉴定,Hal Alper,et al,.,Science,314,.1565.2006,转录谱分析结果表明，在无压力的条件下，,spt15-300,突变株相对于野生株，展示出数百个基因不同程度的表达，但大多集中在氧化还原酶、胞质蛋白质、氨基酸代谢、电子传递链等功能范围内。突变,株中表达最高的,12,个基因，如果被单独敲除，则由,spt15-300,突变造成的优势全部丧失,spt15-300,突变株的鉴定,Hal Alper,et al,.,Science,314,.1565.2006,spt15-300,突变株乙醇发酵的性能参数,性能参数,突变株,野生株,改善效果,起始干细胞重量（,DCW,，,g/L,）,最终干细胞重量（,DCW,，,g/L,）,体积生产率（,g/L h,-1,）,比生产率（,g/DCW,h,-1,）,转化率（,6-12 h,）,乙醇与生物量比值,理论值为,0.41,（,g/g,）,4.06,4.10,6.46,5.39,+20%,2.03,1.20,+69%,0.31,0.22,+41%,0.36,0.32,+14%,0.40,0.35,+15%,98%,86%,E,酵母的表达系统,6,外源基因在酵母中的表达,C,酵母的载体系统,B,酵母的宿主系统,A,酵母作为表达外源基因受体的特征,F,利用重组,酵母生产乙肝疫苗,D,酵母的转化系统,G,酵母糖蛋白生产的人源化改造,H,酵母转录机器的基因工程综合改造,huizhzh,13901874517,