教学大纲-综合实验技能训练.doc

《综合实验技能训练Ⅱ》教学大纲
（Comprehensive Experimental Skills Training Ⅱ）
课程代码： 18112080 学分：3 总学时数：54
先修课程： 细胞工程 开课对象：2011级生物技术专业学生
一、目的要求
通过课程学习，使学生逐步掌握细胞工程技术实验的基本方法、基本技术、实验设计原则以便获取细胞工程技术知识；提高对实验中各种实验现象的观察、分析、思考和解决问题的能力；培养科学的思维方法、实事求是的科学态度和严谨的学风；提高分析、归纳问题和文字表达能力。
二、实验内容
实验一 器材的清洗与消毒
1．实验类别：基础
2．实验目的：
（1）熟悉和掌握细胞培养中所用到的器皿和器械的清洗和消毒技术；
（2）掌握针对具体目的和器具有不同的清洗和消毒策略。
3．实验主要内容：
对细胞培养中所用到的器皿和器械进行清洗和消毒。
（1）玻璃器皿
浸泡 初次使用和培养后的玻璃器皿都需用水浸泡。新用的玻璃器皿，常带有许多干涸在上面的灰尘，同时又由于生产的原因，常呈碱性并带有一些对细胞有毒性的物质，如铅和砷等。在使用前要经稀盐酸（5%）浸泡，中和其中的碱性物质便于清洗。用过的玻璃器皿往往带有大量蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，故用后要立即用清水浸泡。
刷洗 浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗涤剂洗去玻璃器皿上的杂质。刷洗次数太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以宜选用软毛刷和优质的洗涤剂。禁用去污粉，因其含有沙粒，会严重破坏玻璃器皿的光洁。
酸洗 刷洗不掉的极微量杂质经过洗液的强氧化作用可被除掉。洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污十分有效，是清洗过程中最关键的一环。洗液是由重铬酸钾、浓硫酸和水按一定比例配制而成，浸泡时，器皿要充满洗液。常用的洗液配方见附表一。
冲洗 刷洗和洗液浸泡后都必须用水充分冲洗，不留任何残迹，然后用蒸馏水漂洗2~3次，凉干备用。
（2） 塑料器皿
塑料器皿耐腐蚀能力强，但质地较软，且不耐热，因此它和玻璃器皿清洗不同。通常的方法是：先用清水充分浸泡和冲洗；再用2%NaOH溶液浸泡过夜，自来水冲洗，然后用5%稀盐酸浸泡30分钟，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水漂洗3次，晾干备用。
（3） 滤器
玻璃滤器与玻璃器皿清洗相同。无论是浸泡还是酸浸，都可用抽滤法。
a) 使用后，立即将清水注入滤器，抽气过滤，反复抽滤5次。
b) 干净铬硫酸洗液或热浓硫酸注入滤器，抽气过滤至酸液滤过完毕。
c) 用清水再次抽滤10次。
d) 蒸馏水抽气过滤3次。
蔡氏滤器使用后弃去石棉滤膜，金属部分刷洗干净，最后用蒸馏水漂洗2~3次，晾干备用。
（4）橡胶塞
新购置的胶塞带有大量滑石粉，先用自来水冲洗干净，常规处理，每次用后的胶塞用水浸泡，然后用2%NaOH煮沸15min左右，自来水冲洗，再用1%稀盐酸浸泡30min，最后用自来水冲洗和蒸馏水漂洗，晾干后备用。
4．实验类型：操作
5．主要仪器：
超净工作台，干燥箱，镊子，剪刀，解剖刀,酒精灯，75%酒精， 三角瓶，无菌培养皿等。

实验二 培养基母液的制备和培养基的配置
1．实验类别：专业基础
2．实验目的：
学习和掌握培养基母液的配制方法。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。
3．实验主要内容：
（1）大量元素母液的配制
各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍，用感量为0.01g的扭力天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中，即为10倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L培养基取此液100ml。
表1 MS培养基大量元素母液制备
序号
药品名称
培养基浓度（mg/L）
扩大10称量(mg)

1
NH4NO3
1650
16500

蒸馏水定容至1000ml
2
KNO3
1900
19000
3
CaCl2·2H2O 
440
4400
4
MgSO4·7H2O
370
3700
5
KH2PO4
170
1700
注意：
A 配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。
B CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。
（2）微量元素母液的配制
MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe ）组成。微量元素用量较少，特别是 CuSO4·5H2O、 CoCl2·6H2O ，因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2，表3配方，用感量为0.0001g的电光分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制1L培养基，取微量Ⅰ10ml，微量Ⅱ１ml
表2 MS培养基微量Ⅰ的配制
序号
化合物名称
培养基浓度（mg/L）
扩大100倍称量(mg)
1
MnSO4·4H2O
22.3
2230
2
ZnSO4·7H2O
8.6
860
3
H3BO3
6.2
620
4
KI
0.83
83
5
Na2MoO4·2H2O
025
25

表3 MS培养基微量Ⅱ的配制
序号
化合物名称
培养基浓度（mg/L）
扩大1000倍称量(mg)
1
CuSO4·5H2O 
0.025
25
2
CoCl2·6H2O  
0.025
25
注意：使用电子天平时不要把药品撒到称盘上，用完以后，用吸耳球将天平内脏物清理干净。
（3）铁盐母液的配制
铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制1L取此液10ml。
表4 MS铁盐母液的配制
序号
化合物名称
培养基浓度（mg/L）
扩大100倍称量(mg)
1
Na2-EDTA 
37.3
3730
2
FeSO4·7H2O 
27.8
2780
注意：
在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成Fe S 04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，Fe S 04会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，Fe S 04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。
（4）有机母液的配制
MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。
注意：
由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。被菌类污染的维生素母液，有效浓度降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。避免此现象发生的方法是:配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。
表5 MS培养基有机物质母液的制备
序号
化合物
名称
培养基浓度（mg/L）
扩大
倍数
称量
(mg)
配制体积(L)
1
甘氨酸
2
500
100
0.1
2
肌醇
100
200
2000
0.1
3
盐酸硫胺素(VB1)
0.4
1000
40
0.1
4
盐酸吡哆素(VB6)
0.5
1000
50
0.1
5
烟酸
0.5
1000
50
0.1

（5） 激素母液配制
植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的终浓度以0.5mg/ml为好，需要注意的是：
（１）配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。
（２）细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。
（３）配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。
注意：
所有的母液都应保存在0~4℃冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。
4．实验类型：验证
5．主要仪器：
器材：
电子分析天平（感量为0.0001g）、烧杯（500ml、100ml、50ml）、容量瓶（1000ml、100 ml、50 ml、25 ml）、细口瓶（1000 ml、100 ml、50 ml、）、药勺、玻璃棒、电炉。
药品：
NH4NO3、 KNO3 、CaCl2·2H2O 、 MgSO4·7H2O、KH2PO4 、 KI 、 H3BO3 、 MnSO4·4H2O、 ZnSO4·7H2O、 Na2MoO4·2H2O 、CuSO4·5H2O 、CoCl2·6H2O 、FeSO4·7H2O、Na2-EDTA·2H2O 、肌醇 、烟酸 、 盐酸吡哆醇(维生素B6)  、盐酸硫胺素(维生素B1) 、甘氨酸 。              
6．结果与分析：
（应用文字、表格、图形等将数据表示出来，根据实验要求对数据进行分析讨论和误差处理等）
7. 问题讨论：
1) 配制母液时为什么要按顺序加入各药品？溶解CaCl2·2H2O时，为什么要将蒸馏水加热？
2) 根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值，按给出的培养基配方计算各种母液吸取量，填入下表。
培养基配方：MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8。

实验三 培养材料灭菌和接种
1．实验类别：专业基础
2．实验目的：
培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个重要的环节。通过本实验，领会无菌培养对实验材料消毒，接种的要求，初步掌握培养材料灭菌，接种的操作技术。
3．实验主要内容：
（1）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。
（2）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，同时打开接种室内的紫外灯，用紫外灯照射至少25分钟，然后关室内的紫外灯，开送风开关，关闭台内的紫外灯，通风十分钟后，再开日光灯进行无菌操作。
（3）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。
（4）将绿豆种子在流水下冲洗干净。
（5）将种子放于200ml的广口瓶中，用75%的酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗，然后用0.1%升汞溶液（加入吐温2滴）浸泡3、5、10min，期间不断摇动溶液，用无菌水洗涤5遍待用。
（6）解除三角瓶上捆扎的线绳，有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用75%酒精擦洗接种台表面。
（7）接种用的镊子使用前插入95%的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也可以插入培养基边缘促使其冷却。
（8）在酒精灯火焰旁揭去封口膜，将瓶口倾斜接近水平方向，用火焰灼烧瓶口，灼烧时应不断转动瓶口（靠手腕的动作，使试管口沾染的少量菌得以烧死），左手持瓶，使其靠近火焰，右手将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却，夹取绿豆种子，将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放4-6个外植体。
（9）转动瓶口灼烧，将封口膜从酒精灯火焰上过一下，盖上封口膜，扎好绳子，标上接种日期、材料名称、姓名等。
（10）将接种材料移到培养室培养。
注意：
（1）从室外取得材料，要用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料，冲洗时间要长，必要时要用毛刷刷洗。
（2）外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受力、灭菌剂的去除等因素,最好选用两种消毒剂交替浸泡,初次实验灭菌时间要设置一定的时间梯度来确定最佳的灭菌时间。常用的消毒剂的见表1。
（3）工作台接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作（比如说、笑、打喷嚏），以免影响气流，造成污染。另外操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。
（4）接种前培养基出现大量污染现象,若菌类只存在于培养基表面，且主要是真菌时，可能是因培养瓶密封不严或放置培养基的环境不洁净，菌类种群密度过大所致。若菌类存在于培养基内部，则可能是由使用污染的贮藏母液引起。另外培养瓶不洁净，灭菌不彻底也是导致接种前培养基污染的原因。避免此现象发生的方法是:保持环境洁净，杜绝使用污染的母液，严格高压蒸汽灭菌程序，保证灭菌时间。
（5）接种后培养基出现大面积污染、菌落分布不匀,此种情况主要是接种过程中发生的污染所致。可能是接种室不洁净、菌类孢子过多、镊子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸及超净工作台。出现故障等原因引起。避免此现象发生的方法是:保持无菌接种室洁净，并定期用甲醛等熏蒸灭菌；在接种前无菌室用紫外灯灭菌时间不低于20-30 min；用75%酒精喷雾杀菌降尘，超净台开启15-20 min后方可使用；镊子等接种工具严格彻底灭菌，且接种时使用1次灭菌1次；操作过程中经常用75%酒精等消毒剂擦洗手部等措施。
（6）接种后外植体周围发生菌类污染可能因外植体表面灭菌不彻底所致。解决方法是:外植体用饱和洗涤剂浸泡10-1 5 min，自来水冲洗0 .5-2h后，再选择适宜的灭菌剂消毒，一般用0.1-0.2%升汞灭菌最好。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温一80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，以提高杀菌效果。

表1 植物组织培养中常用的消毒剂
消毒剂名称
使用浓度（%）
消毒难易
灭菌时间（min）
消毒效果
乙醇
70～75
易
0.1～3
好
氯化汞
0.1～0.2
较难
2～15
最好
漂白粉
饱和溶液
易
5～30
很好
次氯酸钙
9～10
易
5～30
很好
次氯酸钠
2
易
5～30
很好
过氧化氢
10～12
最易
5～15
好

4．实验类型：操作
5．主要仪器：
器材
超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。
药品及材料
0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、胡萝卜块根，绿豆种子、培养基母液。
6．结果与分析：（应用文字、表格、图形等将数据表示出来，根据实验要求对数据进行分析讨论和误差处理等）
7. 问题讨论：
观察接种后2～5天的污染情况，填入下表：
观察日期
接种日期
接种数
污染数
污染率
主要污染菌种

注：
污染率（%）=（污染的外植体数/总接种外植体数）×100％
如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短；若接种材料虽然没有污染，但材料已发黄，组织变软，表明消毒时间过长，组织被破坏死亡；接种材料若没有出现污染，生长正常，即可以认为消毒时间适宜。
2、外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？有时候会在消毒溶液中加入1～2滴的表面活性物质，例如吐温80或吐温20，为什么？
3.在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种工具，接种材料的污染？
4.对外植体表面消毒时为什么常用“两次消毒法”？

实验四 愈伤组织的诱导与分化

1．实验类别：专业基础
2．实验目的：
学习诱导植物外植体形成愈伤组织的方法。
植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的重要因素，对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈的刺激愈伤组织的形成。
了解愈伤组织再分化原理，学习诱导愈伤组织分化的方法。
3．实验主要内容：
1、培养基配置
诱导胡萝卜愈伤组织的培养基为：MS+2，4-D 1.5mg/L+CH 500mg/L+ 3%蔗糖+0.7%琼脂,pH 5.8。
愈伤组织增殖培养基：MS+2，4-D 0.5mg/L+CH 500mg/L + 3%蔗糖+0.7%琼脂,pH 5.8。
2、胡萝卜营养根的消毒。
a.将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净，切去外围组织。将胡萝卜切段，每段厚约0.5cm。
b.把胡萝卜段用无菌水漂洗干净。
c.用75%的酒精溶液浸泡30s。
d.用0.1%氯化汞浸泡2、5.10.12min，在浸泡过程中用镊子搅拌，以使消毒充分。
e.浸泡过的胡萝卜段用无菌水冲洗3-5次，洗去残留的氯化汞后切片。
3、解除三角瓶上捆扎的线绳，有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用75%酒精擦洗接种台表面。
4、胡萝卜营养根切片
胡萝卜营养根由外向内依次分为皮层、形成层和中轴三部分。在切片消毒之前首先除去皮层的最外层，以减少胡萝卜营养根的带菌量。形成层的分生能力最强，是产生愈伤组织的主要部分，因此在切片时应使每一个切片上都有形成层。具体操作方法和步骤如下：

胡萝卜的截面图 沿图中竖线切开 沿图中竖线切成
首先沿横线把胡萝卜段切开 两边部分弃去（如图） 切片，每片厚0.5-1mm
图 1 胡萝卜营养根切片的制作
5、配制生芽和生根培养基。
分化培养基（生芽）：MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8
生根培养基：1/2大量元素+MS其它成分+IBA1mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8
6、按照无菌操作，小心挑取愈伤组织3～5，放置到分化培养基中。注意标明接种日期和外植体名称。
7、放置培养室培养，10天后统计愈伤组织分化情况。

注意：
消毒以后的所有操作过程，都应在超净工作台上进行，操作所用的镊子、解剖刀和剪刀使用前插入95%乙醇溶液中，使用时在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却后再切割。
5、轻轻打开封口膜，将三角瓶口在火焰上方灼热灭菌，同时把长镊子也放在火焰上方灼烧，将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的外植体，然后将培养皿打开一小缝，用镊子取出切好的胡萝卜切片放到培养基表面，用镊子轻轻向下按一下，使切片部分进入培养基。在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈使瓶口灼热灭菌。然后用封口膜封口，同时在牛皮纸上写上培养材料、接种日期、姓名等。
注意：植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素，研究具体问题要设置一定的浓度梯度，以寻找最佳浓度。

4．实验类型：操作
5．主要仪器：
器材
超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、棉球、烧杯、广口瓶、培养皿
药品及材料
0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、胡萝卜块根、培养基母液、2，4-D、水解酪蛋白（CH）、6-BA、NAA、IBA、蔗糖、琼脂
6．结果与分析：（应用文字、表格、图形等将数据表示出来，根据实验要求对数据进行分析讨论和误差处理等）
7. 问题讨论：（结合所学理论知识，对实验中的现象、数据、产生的误差等进行分析和讨论，以提高自己分析问题和解决问题的能力并提出应注意的事项，为以后的科学研究打下基础）
l 观察接种的外植体在接种1周后产生愈伤组织的颜色和质地，计算愈伤组织诱导率。
愈伤组织诱导率（%）=（形成愈伤组织的材料数/总接种材料数）×100%
l 分析影响愈伤组织诱导和分化的主要原因。
l 愈伤组织发生不定芽和不定根的能力与哪些因素有关？

实验五 植物细胞悬浮培养与同步化
1．实验类别：专业
2．实验目的：
学习和掌握植物细胞悬浮培养的常规方法以及同步化的方法。
3．实验主要内容：
1) 诱导愈伤组织形成（参见实验四）。
2) 制备液体培养基：MS+2，4-D 1mg/L+蔗糖3%
3) 在超净工作台上，从形成愈伤组织的培养瓶中，挑取质地松弛、生长旺盛的愈伤组织、放入盛有30ml液体培养基的三角瓶中，用镊子轻轻捏碎愈伤组织。每瓶接入约2g重的愈伤组织，置于震荡摇床固定，在黑暗条件下或弱散射光下100r/min震荡培养。
4) 将胡萝卜悬浮细胞培养物摇匀后倒在或滴入孔径较大的尼龙网或不锈钢网漏斗中（孔径47μm，81μm或更大）。
5) 如果网眼被细胞团堵塞，可用吸管反复吸、吹。
6) 再用无菌培养基冲洗残留在网上的细胞团。
7) 重复步骤4-6。
8) 将通过较大孔径的细胞悬浮液，再通过较细孔径的尼龙网过滤（如31μm，26μm），用吸管反复吸、吹。
9) 经过分级过滤的“同步化”细胞离心（50g，5分钟），收集后加入液体培养基进行培养或进一步同步化。
4．实验类型：操作、设计、研究
5．主要仪器：
器材：超净工作台、震荡摇床、接种工具、尼龙网、移液管、吸耳球、漏斗、离心管、离心机。
药品：培养基母液、2，4-D、蔗糖、琼脂。
6．结果与分析：（应用文字、表格、图形等将数据表示出来，根据实验要求对数据进行分析讨论和误差处理等）
7. 问题讨论：

A. 研究细胞悬浮培养的意义何在？挑选愈伤组织进行悬浮培养需注意什么问题？
B. 建立细胞悬浮系的步骤包括哪些？一个良好的悬浮细胞培养体系应该具有什么样的特征？

实验六 原生质体培养
1．实验类别：专业
2．实验目的：
学习原生质体制备和培养的方法。
3．实验主要内容：
A 培养基及试剂的配制
绿豆原生质体培养基：MS+2，4-D 0.2+NAA1+BA0.5+蔗糖250mg/L+葡萄糖10000mg/L+（琼脂1.2%）
CPW溶液：KH2P04 27.2 mg/L, KN03 101 mg/L, CaCl2.2H20 1480 mg/L,MgS04.7H20 240 mg/L, KI 0.16 m g/L, CuS04.5H20 0.025 mg/L，pH 5. 6)。
绿豆质壁分离液CPW-13M的配制：含有13%甘露醇的CPW溶液
绿豆细胞壁酶解液：2%(W/V)纤维素酶(cellulase Onzuka R-10) 、 1%(W/V)半纤维素酶( hemicellulase H-2125, 0. 026 unit/m g)、0.5% (W/V)果胶酶( pectinase, 0.1 5 unit/m g)、0.5%离析酶（MacerozymeR-10）的CP W -9 M(含有9%甘露醇，5 mmol/L MES的CPW溶液，pH 5.2)液。
洗涤液：含或不含250 μmol/L CaCl2，含5 mmol/L MES的9%甘露醇溶液，pH 6.0。
B 无菌黄化下胚轴的获得
经挑选的绿豆种子用70%乙醇表面消毒1 min, 0.1%升汞消毒8 min，无菌水冲洗3遍。播于培养瓶中，培养瓶中放入无菌滤纸，加入适量无菌水，以保持合适水分，27士1℃黑暗培养64 h。
C 酶解
选取下胚轴长3.5- 4 cm的黄化绿豆幼苗，从弯钩下3mm处，向下切取0.5 mm的切片10个。置于CPW-13 M溶液中，静置1h，使之质壁分离，而后移入酶解液中，在往复式摇床(35-40 r/min, 25士1 ℃)上暗中酶解5-6 h。材料和酶解液的体积大约1：10。
D 纯化
用双层尼龙滤网(孔径64 um)过滤酶解液，滤液100× g离心10 min，弃去上清液。用少量CPW -9M溶解沉淀，小心加入盛有CPW-21S(含有21%蔗糖的CPW溶液，pH 5-6)溶液的离心管中，100×g离心5 min，溶液分为3层，仔细将漂浮在溶液中部的原生质体取出，经洗涤液洗涤2次，离心，获得纯净的、具有生理活性的原生质体。
E 密度测定与调整
将原生质体溶解在培养液中，用血细胞计数板记数。
F 培养
用融化的培养基将原生质体密度调整为5×105/mL，将其植板于培养皿中，使成一薄层，凝固后，切成4个扇形快，加入液体培养基，使扇形块漂浮其中，置于27士1℃黑暗培养，培养7、14、21d，除去旧液，加入新培养基（蔗糖含量为20mg/L，葡萄糖10g/L，其他成分与MS相同。培养一周后能见到几个细胞以上的细胞团。继续培养细胞团形成愈伤组织。
4．实验类型：研究
5．主要仪器：
器材: 超净工作台、震荡摇床、各种接种工具、微孔滤膜过滤器
药品: MS培养基各种母液、NAA、6-BA、2，4-D、2-N-吗啉乙磺酸（MES）、纤维素酶（Onozuka R-10，Japan）、崩溃酶（Driselase）、果胶酶（Pectinase、Serva）、半纤维素酶（Hemicellulase，Sigma）、离析酶（MacerozymeR-10）、CaCl2.2H2O、KH2PO4.H2O、KN03 、MgS04.7H20 KI 、CUS04.5H2O、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、琼脂。
6．结果与分析：（应用文字、表格、图形等将数据表示出来，根据实验要求对数据进行分析讨论和误差处理等）
7. 问题讨论：
原生质体制备与培养过程中要注意哪些问题？常用的原生质体培养方法有哪些？

实验七 植物快速繁殖体系建立
1．实验类别：专业
2．实验目的：
掌握利用叶片作为外植体进行无性繁殖的方法。
3．实验主要内容：
1）、培养基的配制
①愈伤组织诱导培养基：MS + 2,4-D1.0 mg/L(单位下同)+ NAA 2.0+KT0.5。
②愈伤组织分化培养基： MS +KT2.0+IAA0.5。
③幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 + NAA 0.2。
④生根培养基：MS + NAA 0.2。
上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8。
2）、接种
取烟草幼嫩叶片用自来水充分洗净后，经75%酒精消毒30s, 0.1%升汞溶液浸泡8min，无菌水冲洗5-6次后，去掉主叶脉和大的侧叶脉，将叶片切成1.0-1.5cm2的小方块，接入①中培养，接种时下表皮与培养基接触。培养温度25士2℃，光照14 h/d，光照强度2000 lx。每三角瓶接种3-5个外植体。
3）、愈伤诱导
约2-3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀，15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织。
4）、愈伤组织的分化
将愈伤组织转接到分化培养基②上，15d后，从疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点。40d后，从愈伤组织上分化出越来越多幼芽。
5）、幼芽的增殖
将幼芽切下，转接至不加2,4-D的幼芽增殖培养基③上，可不断增殖，发育成绿色健壮的小苗。
6）、诱导生根及移栽
取约3-4cm长的无根小苗接种于生根培养基④中，约7-8d后，外植
体从其基部产生白色幼根，当试管苗长至5-6cm高时，打开瓶口，在散射光下放置2d后取出，洗去根部残留培养基，种植于经过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中，成活率可达95%以上。
4．实验类型：综合、设计、研究
5．主要仪器：
器材：超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀。
药品：MS培养基母液、2，4-D、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、琼脂、酒精、次氯酸钠。
6．结果与分析：

7. 问题讨论：
以烟草为材料，查阅相关文献，设计烟草遗传转化实验（利用农杆菌介导法）。

实验八 烟草遗传转化实验
1．实验类别：专业
2．实验目的：
烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，使同学们了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。
3．实验主要内容：
1) 根癌农杆菌质粒的保存：构建好的根癌农杆菌质粒接种在YEP固体培养基上，YEP固体培养基的成分为每100ml含NaCl0.5g，酵母1g、水解酪蛋白1g、琼脂1.5g、Ph7.0。在冰箱中冷藏，一个月换一次培养基，保证菌种正常生长。
2) 配制YEP液体培养基：成分同上，只是添加卡那霉素而不添加琼脂，分装于试管中，每试管加入5ml左右的液体培养基，包好后高压灭菌，放置于冰箱中待用。
3) 摇菌：用灭菌的牙签或者火柴棍等挑出单菌落，一起放入上述YEP液体培养基中，然后置于27℃摇床上摇菌16-17h（180r/min），培养至OD600为0.6-0.8。
4) 用消毒后的0.5mm的打孔器从无菌苗叶片上切出叶盘，接种到 MS+6-BA1.0+NAA1.0+3%蔗糖+0.7%培养基上预培养2-3d，材料切口刚刚开始膨大时即可进行侵染。
5) 取OD600为0.6-0.8的菌液，按1%-2%的比例，转入新配制的无抗生素的细菌液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6h，OD600为0.2-0.5时即可用于转化。
6) 侵染：于超净工作台上，将菌液到入无菌小培养皿中。从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡5min，取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
7) 共培养：将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导培养基上：MS+IAA0.5+BA2.0+蔗糖3%+琼脂0.7%，在28℃暗培养条件下共培养2-4d。
8) 将经过共培养的外植体体转移到加有100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的愈伤诱导培养基上（同上），在光照为2000lx、25℃条件下进行选择培养。
9) 继代选择培养：选择培养2-3周后，外植体将产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养。
10) 将愈伤组织转移到附加选择压（同上）诱导培养基：MS +KT2.0+IAA0.5+蔗糖3%+琼脂0.7%上诱导生芽。
11) 生根培养：两周后分化出芽，从基部将芽切下，转至含有选择压的生根培养基上：MS+IAA0.1+蔗糖3%+琼脂0.7%，诱导生根。生根后的植株移入温室内栽培。
4．实验类型：综合、设计、研究
5．主要仪器：
器材：摇床、超净工作台、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、打孔器、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。
药品：MS培养基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、琼脂、蔗糖、卡那霉素、羧卞青霉素、6-BA、IAA。
6．结果与分析：

7. 问题讨论：
卡那霉素、羧苄青霉素在培养过程中各起什么作用？步骤2中如果不加入卡那霉素会影响实验结果吗？为什么？

实验九 细胞原代培养
1．实验类别：基础
2．实验目的：
学习动物细胞培养中最常用的消化法进行细胞原代培养的实验过程，为细胞纯化、冷冻保存、生长曲线的测定和细胞活性检查等实验奠定基础，并进一步学习无菌操作技术。
3．实验主要内容：
（一）胰酶消化法
1、将妊娠10-14d的母鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3s（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4、视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液（称取所需胰蛋白酶，加入无菌的D-Hanks溶液中，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.2-7.4，过滤除菌，分装，-20℃冻存备用），37℃中消化20-40min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3-5ml含5% FBS（胎牛血清）的Hank’s液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6、静置5-10min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7、1000rpm，离心10min，弃上清液。
8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
   上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。
（二）组织块直接培养法
自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3-5h，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
4．实验类型：操作
5．主要仪器：
器材： CO2培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、棉球、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。
药品及材料： 胎鼠或新生鼠、1640培养基（含20%小牛血清）、0.25%胰酶、胎牛血清、
Hank’s液（见附注）、碘酒、酒精。
6．结果与分析：
7. 问题讨论：
比较组织培养法和消化培养法获得原代培养物的效果和优缺点。
注意事项：
1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
4、根据组织类型选择适当的消化液，控制消化时间，尽量减少细胞损伤。

附注：
（1）D-Hank’s液配方：
KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml。
（2）Hanks溶液配方：
CaCl2 0.14 g、KCl 0.4g、 KH2PO4 0.06g、MgCl2.6H2O 0.10 g、MgSO4.7H2O 0.10 g、NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g、葡萄糖1.0g、Na2HPO4·7H2O 0.09g、加H2O至 1000ml。
注：Hank’s液可以高压灭菌，4℃下保存。

实验十 细胞传代培养
1．实验类别：专业基础
2．实验目的：
以原代培养的小鼠胎儿细胞为材料，学习动物细胞培养中最常用的消化法进行细胞传代培养的实验过程，为细胞纯化、冷冻保存、生长曲线的测定和细胞活性检查等实验奠定基础。
3．实验主要内容：
1) 将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，用2ml Hanks液清洗一次。
2) 加入0.5-1ml