茶陵野生稻冷响应基因OrCrGHl的表达与克隆.pdf

DOI:10.16605/ki.1007-7847.2023.05.0154茶陵野生稻冷响应基因 OrCrGHl 的表达与克隆收稿日期:2023-05-12;修回日期:2023-06-12;网络首发日期:2023-07-27基金项目:湖南省自然科学基金项目(2023JJ30397,2021JJ50134);长沙市自然科学基金资助项目(kq2202243,kq2014077);湖南师范大学博士科研启动项目(2020);湖南省教育厅重点科研项目(19A289);中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室开放基金项目(ISA2015201);湖南省重点科技计划项目(2012FJ2013)作者简介:莫香(1979),女,湖南岳阳人,博士,实验师,主要从事作物逆境生理与分子生物学研究;*通信作者:徐孟亮(1964),男,湖南益阳人,博士,湖南师范大学教授,主要从事作物逆境生理学研究及植物生理学教学,E-mail:。莫香,盛丽丽,罗佳,徐甜甜,徐孟亮*(湖南师范大学 生命科学学院 作物不育资源创新与利用湖南省重点实验室,中国湖南 长沙 410081)摘要:为了发现新的水稻耐逆基因,采用水稻基因芯片分析了茶陵野生稻及籼型栽培稻培矮 64S 苗期全基因组在冷胁迫下的表达水平,从茶陵野生稻中筛选出一个强烈响应低温的耐冷候选基因,暂命名为 OrCrGHl(Oryza rufipogon cold responsive glucan hydrolase-like)。用实时定量 PCR 方法对其表达水平进行了进一步的分析,所得结果与基因芯片分析结果基本吻合。以茶陵野生稻为材料,用逆转录 PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法获得了包含其完整开放阅读框(open reading frame,ORF)的 cDNA 克隆。根据其 ORF 序列进行预测,该基因编码一个包含 558 个氨基酸残基的糖基水解酶相似蛋白质,其理论分子质量为 59.252 kD,pI 为5.81。经蛋白质相似性比对,其编码蛋白与日本晴第 7 号染色体上的 LOC4343492 基因编码的蛋白质(XP_015647631.1,glucan endo-1,3-beta-glucosidase GII isoform X2)的氨基酸序列完全一致,与籼稻 93-11 预测蛋白质(EEC82204.1,hypothetical protein OsI_26347)的相似性为 99.28%。对其可能的启动子区域序列进行分析,发现了多个可能与逆境或逆境激素响应有关的顺式作用调控元件。以上结果提示,该基因为一新的野生稻耐冷候选基因,进一步的研究正在进行。关键词:野生稻;冷胁迫;基因芯片;实时定量 PCR;基因克隆中图分类号:Q781,S511.9文献标志码:A文章编号:1007-7847(2023)05-0377-08Expression and Cloning of OrCrGHl,a Novel Cold-responsiveGene in Chaling Common Wild RiceMO Xiang,SHENG Lili,LUO Jia,XU Tiantian,XU Mengliang*(Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Sterile Germplasm Resources Innovation and Application,College of Life Sciences,Hunan Normal University,Changsha 410081,Hunan,China)Abstract:In order to identify novel cold-tolerance genes in rice,genome-wide gene expression profiling ofChaling common wild rice(CWR)and the cultivar indica rice Peiai 64S subjected to cold stress was perfor-med at the seedling stage using the GeneChip Rice Genome Array.A gene,designated OrCrGHl(Oryza rufi-pogon cold responsive glucan hydrolase-like),was screened from Chaling CWR as a cold-tolerance candi-date,which was highly responsive to cold stress in Chaling CWR but not in Peiai 64S.The expression pro-file of OrCrGHl obtained by the microarray analysis was confirmed by real-time quantitative PCR,suggestingthat OrCrGHl is a cold-responsive gene in Chaling CWR.Its full open reading frame(ORF)-containing cD-NA clone was obtained by reverse transcription PCR(RT-PCR).Its sequence analysis showed that it encodesa glucan hydrolase-like protein of 558 amino acid residues,with a molecular weight of 59.252 kD and pIvalue of 5.81.The deduced amino acid sequence was completely identical with that of the glucan endo-1,3-beta-glucosidase GII isoform X2 of japonica rice Nipponbare,and was 99.28%identical with that of hypo-thetical protein OsI_26347 of indica rice 93-11.Analysis of the putative promoter region revealed several第 27 卷 第 5 期生命科学研究灾燥造援27 晕燥援5圆园23 年 10 月蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻 砸藻泽藻葬则糟澡Oct.圆园23窑 生物化学与分子生物学 窑生命科学研究圆园23 年水稻是主要粮食作物之一,其在生产过程中经常遭遇季节性、区域性的冷胁迫(零上低温胁迫),冷胁迫对其产量与品质的影响巨大,是限制水稻分布的主要因素之一。培育耐冷性强的水稻品种是保障水稻稳产与高产、扩大其时空种植范围的重要举措。克隆水稻耐冷新基因,可为水稻耐冷分子育种提供基因资源或分子标记,具有重要价值。茶陵普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.,以下简称“茶陵野生稻”)是两个北缘普通野生稻居群之一,其耐冷性极强1-2,是进行水稻耐冷相关新基因克隆的理想材料。目前,关于野生稻耐冷相关基因克隆的研究工作已有一些报道,主要是以东乡野生稻为材料对其耐冷性进行了经典遗传学分析以及耐冷相关数量性状位点(quantitative trait lo-cus,QTL)定位分析,克隆的耐冷相关基因十分有限3-6。近年,Zhao 等7以水稻耐冷渗入系(供体为东乡野生稻)为材料,通过耐冷 QTL 定位与全基因组表达谱分析相结合的方法,克隆了一个幼苗早期耐冷性基因 OsLTPL159,该基因编码一个定位于细胞膜的非特异性脂质转移蛋白质,可能通过降低活性氧的毒性、增强细胞壁中纤维素沉积及促进渗透调节物质积累来提高水稻幼苗早期的耐冷性。Pan 等8以耐冷的普通野生稻编号 Y12-4 和冷敏的栽培籼稻 ce253 为材料,对它们发芽期冷胁迫的转录组进行了差异表达分析,鉴别出发芽期起重要作用的耐冷基因 LTG5,该基因编码UDP-葡萄糖基转移酶。Bai 等9以东乡野生稻和冷敏感栽培稻协青早 B 为材料,采用定量蛋白质组学方法分析了苗期冷胁迫相关蛋白质,结果显示,冷胁迫后,在东乡野生稻和协青早 B 中分别检测到101 和 216 个差异表达蛋白质(differentially expres-sed protein,DEP),通过进一步的生物信息学分析与功能验证,发现一个代号为 Q5Z9Q8 的 DEP 可显著提高大肠杆菌的耐冷性。以栽培稻为对象的耐冷相关基因克隆方面的研究工作相对较多,比如:有研究表明,水稻的耐冷性是受多基因控制的数量性状,在每一条染色体上都能找到耐冷QTL3-6,10;Ma 等11在第 4 号染色体上克隆到一个涉及苗期耐冷的关键基因 COLD1,该基因编码蛋白是一个 G 蛋白信号的调控因子,定位于细胞质膜与内质网膜,被认为是温度感受器之一而介导冷信号转导,同时研究发现该基因中源于我国普通野生稻的一个单核苷酸多态性(single-nucleo-tide polymorphism,SNP)位点 SNP2 使粳稻比籼稻具有更强的耐冷性;Mao 等12认为,HAN1 基因在粳稻适应低温的过程中起重要作用,该基因编码蛋白是一种单加氧酶,属于细胞色素 P450 家族,可催化有生物活性的茉莉酰-L-异亮氨酸(jasmonyl-L-isoleucine,JA-Ile)转化为无活性的 12-羟基-JA-Ile(12OH-JA-Ile),并微调茉莉酸(jasmonic acid,JA)介导的冷应答反应。除此之外,研究人员以栽培稻为对象还克隆了其他一些耐冷相关基因,如OsDREB1A/OsCBF313-14、OSISAP115、OsMSR216、OsSAP1617、OsMAPK318、bZIP7319、OsWRKY5320、OsWRKY7621、CTB4a22、OsCIPK723、OsLEA924、EF-Tu25、OsCRT326等。根据国家水稻数据中心的数据(本体系统,http:/ 2023 年 06 月 12 日,从水稻中克隆或定位的耐冷相关基因或 QTL 有 125 条记录。总之,在克隆水稻耐冷相关基因方面虽然取得了一些成就,但水稻耐冷分子机制十分复杂,涉及众多耐冷相关基因,目前克隆的耐冷相关基因数量依然很少,因此,以水稻尤其是耐冷性极强的野生稻为研究材料来继续克隆其耐冷相关基因是很有必要的,这既有助于提高人们对稻属植物耐冷分子机制的认识,也有助于水稻尤其是籼稻的耐冷性分子改良与耐冷栽培。本研究是在分析冷胁迫下茶陵野生稻与栽培稻培矮 64S 全基因组基因表达数据的基础上,对筛选出的一个冷响应基因进行进一步表达分析、克隆及可能的功能分析。1材料与方法1.1材料栽培与管理供试材料为耐冷性极强的茶陵野生稻(Oryzarufipogon Griff.)及冷敏感的培矮 64S 籼型栽培稻(Oryza sativa L.ssp.indica),它们的种子经消毒、cis-acing regulatory elements that may be related to stress or stress hormone responses.The results indicatedthat OrCrGHl is a novel candidate gene associated with cold tolerance in wild rice.Further study is inprogress to understand more about the gene.Key words:Oryza rufipogon;cold stress;microarray;real-time quantitative PCR;gene cloning（Life Science Research，2023，27（5）：377-384）378第 5 期莫香等：茶陵野生稻冷响应基因 OrCrGHl 的表达与克隆图 1茶陵野生稻与栽培稻培矮 64S 苗期 CrGHl 基因在冷胁迫下的相对表达水平图例中,Microarray 代表基因芯片分析结果,Real-time PCR代表实时定量 PCR 分析结果。横轴中,PA64S 代表培矮64S,CL 代表茶陵野生稻,K 代表对照(28 益、12 h),C 代表冷胁迫(4 益、12 h)。*表示同一材料在冷胁迫与对照处理下的相对表达量差异显著(P臆0.05),图 3 类似。Fig.1The relative expression levels of CrGHl in leavesof Chaling common wild rice(CWR)and cultivated indi-ca rice Peiai 64S at the seedling stage under cold stressMicroarray:Relative expression level by microarray analysis;Real-time PCR:Relative expression level by real-time quan-titative PCR analysis;PA64S:Peiai 64S;CL:Chaling CWR;K:Control(28 益,12 h);C:Cold stress(4 益,12 h).*:Signifi-cant difference(P臆0.05)between the same materials undercold stress and control conditions(the same in Fig.3).浸种、催芽后播于盆中,在适宜温光等自然条件下生长,实施常规水肥管理与病虫害防治,直至需要冷处理或取材的发育时期。1.2冷处理方式将生长至 5 叶期的茶陵野生稻及培矮 64S 秧苗置于人工气候箱中,进行 4 益处理,对照(适温)材料置于另一人工气候箱中,温度为 28 益。冷处理与对照均无光照,处理不同时间后取材,其中用于基因表达芯片分析的材料冷处理 12 h,用于实时定量 PCR 分析的材料冷处理 0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h。1.3取材与制样苗期取倒二叶中部片段适量,抽穗期取根、茎、叶、穗适量,剪碎,用液氮研磨成干粉状,随即分装入编好号且盛有 1.0 mL TRIzol 提取液的 1.5 mL离心管中,每管约 100 mg,盖紧,混匀,封口后置-80 益保存备用。1.4基因表达芯片分析按 Affymetrix 基因芯片分析系统提供的Affy-metrix 表达芯片实验操作手册操作(2005 年版)。1.5实时定量 PCR 分析参考徐孟亮等27的方法。目的基因引物为Or-CrGHl-F:5忆-CGTCCGTGGTTAGCCTTCT-3忆,Or-CrGHl-R:5忆-TGGACATCGCCACCATCA-3忆,扩增片段长 120 bp;内参基因为 18S rRNA,其引物为18S rRNA-F:5忆-CGTCCCTGCCCTTTGTACAC-3忆,18S rRNA-R:5忆-CGAACA CTTCACCGGATCATT-3忆;按相对定量法计算。1.6 cDNA 克隆参考徐孟亮等27的方法。根据 Affymetrix 60k水稻基因芯片检测 OrCrGHl 基因的探针组(probeset)所提供的核苷酸序列信息,从 GenBank 中搜索到它最相似的基因,根据其最相似基因的 cDNA序列,用 Primer Premier 5.0 软件设计 PCR 特异引物,以茶陵野生稻苗期叶片为材料,提取其总RNA,经反转录获得 cDNA 第一链,以 cDNA 第一链为模板,通过 PCR 扩增获得包含该基因完整开放阅读框(open reading frame,ORF)的 cDNA 克隆。该基因的 PCR 引物为 OrCrGHl-F:5忆-TC原TAGATTACCCTGCTTTCCTCTGC-3忆(带下划线的序 列 为 添 加 的 酶 切 位 点);OrCrGHl-R:5忆-CACGTGTCTTACTGCCGAGTCTTCTG-3忆。1.7实时定量 PCR 数据的统计分析用于实时定量 PCR 分析的材料重复取样 3次,相对表达量以平均值依标准差(x依s)表示。同一材料冷处理与对照(适温)处理间的相对表达量差异用 t 检验分析;同一材料不同组织器官间的相对表达量差异用 Duncan 多重比较法分析。以 P臆0.05 或 琢臆0.05 作为差异显著性标准。2结果与分析2.1OrCrGHl 的表达分析采用 Affymetrix 基因芯片分析系统以及Affy-metrix 60k 水稻基因芯片(可同时检测 51 279 个转录本,涵盖水稻全基因组所有编码蛋白基因的转录丰度)分析了茶陵野生稻(耐冷)与籼型栽培稻培矮 64S(不耐冷)苗期叶片在冷处理 12 h 后的全基因组表达谱,筛选出一个耐冷相关候选基因,暂将其命名为 OrCrGHl(Oryza rufipogon cold respon-sive glucan hydrolase-like):该基因在常温下表达量不高,且在茶陵野生稻与培矮 64S 之间没有显著性表达差异,但经冷处理后,在茶陵野生稻中大幅上调(为常温下表达量的 9.2 倍),而在培矮64S中的表达无明显变化。该结果也得到实时定量PCR 分析结果的验证(图 1)。为了了解该基因的表达特点,我们进一步对该基因在茶陵野生稻各组织器官中的表达水平以及经不同时间冷处理后的表达水平进行了实时定Real-time PCRMicroarray6050403020100*PA64S KPA64S CCL KCL C379生命科学研究圆园23 年图 2OrCrGHl 在茶陵野生稻不同组织器官中的相对表达水平图中数据为平均值依标准差,带有不同小写字母者差异显著,带相同小写字母者差异不显著。Fig.2The relative expression levels of OrCrGHl in dif-ferent tissues and organs of Chaling CWRThe data are presented as mean 依 standard deviation from 3independent samples.The data with different letters and withthe same letters among different tissues and organs indicate asignificant difference and no significant difference at 琢臆0.05,respectively.图 3冷胁迫不同时间茶陵野生稻与培矮 64S 苗期 CrGHl 的相对表达水平(A)茶陵野生稻 OrCrGHl 的相对表达水平;(B)培矮 64S OsCrGHl 的相对表达水平。Fig.3The relative expression levels of CrGHl in Chaling CWR and Peiai 64S when treated with cold stress for dif-ferent time periods at the seedling stage(A)Relative expression levels of OrCrGHl in Chaling CWR;(B)Relative expression levels of OsCrGHl in Peiai 64S.18161412108642000.51361224*t/h(A)18161412108642000.51361224*t/h(B)aabab1.61.41.21.00.80.60.40.20RootStemLeafSpike量 PCR 分析。结果显示:在正常生长条件下,该基因在根、叶片中的表达量显著高于其在茎中的表达量(图 2);与冷处理前相比,经不同时间冷处理后,该基因在茶陵野生稻苗期叶片中的表达水平明显上调,并在冷处理 3 h 时达到最大值,表明其受冷诱导表达,而在培矮 64S 中,经不同时间冷处理后,基因的表达水平并不上调,甚至在冷处理 12 h 与 24 h 时还显著下降,表明其不受冷诱导表达(图 3)。该结果进一步验证了基因芯片的分析结果。以上表达分析结果说明,茶陵野生稻的 Or-CrGHl 基因明显受冷胁迫诱导,而培矮 64S 中的最相似基因 OsCrGHl 不受冷胁迫诱导,表现出与它们耐冷性强弱的相关性。此外,茶陵野生稻的OrCrGHl 基因在叶、根中的表达水平显著高于其在茎中的表达水平。2.2OrCrGHl 基因的 cDNA 克隆为了明确 OrCrGHl 基因是否在水稻中具有耐冷作用,需要克隆该基因的 cDNA。以茶陵野生稻 cDNA 为模板进行 PCR,获得了 OrCrGHl 预期大小的 cDNA 片段(图 4)。回收后,将该 cDNA 片段连接到克隆载体上,转化感受态大肠杆菌,在大肠杆菌中扩增后提取其质粒进行酶切鉴定,鉴定结果表明,OrCrGHl 的 cDNA 已被成功连接到克隆载体上(图 5)。测序结果表明,该 cDNA 大小为 1 757 bp。2.3OrCrGHl 基因的生物信息学分析依据该基因的测序结果,通过 NCBI 数 据 库的 ORF Finder 分析工具(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/home/analyze/)对基因的 ORF 进行预测,结果显示:其 ORF 长度为 1 677 bp,推测的编码蛋白含 558 个氨基酸残基。经 Compute pI/Mw(https:/www.expasy.org/resources/compute-pi-mw)计算,其编码蛋白理论分子质量为 59.252 kD,pI 为 5.81。在 NCBI 数 据 库(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/;2023-05-10)对 OrCrGHl 基因进行核苷酸序列相似性比对(Blastn)分析,结果表明:其 cDNA与GenBank公布的日本晴最相似基因 cDNA(XM_015792145.2)的对应片段序列相差 3 个碱基,相似性为99.83%;其 cDNA 第 1 位至第 122 位核苷酸残基序列与籼稻 RP Bio-226 第 7 号染色体片段 CP012615.1 第18 259 432 位至第 18 259 311 位核苷酸残基序380第 5 期图 6不同物种 CrGHl 系统进化树图谱Fig.6Phylogenetic tree of CrGHl in different species图 4通过 RT-PCR 获得的 OrCrGHl cDNA 片段M:DNA 分子量标准;1:cDNA 片段(箭头所指);2:无模板对照。Fig.4The cDNA of OrCrGHl obtained by RT-PCRM:DNA marker;1:cDNA insert(shown by the arrow);2:Notemplate control.图 5连接 OrCrGHl cDNA 的 pMD18-T 阳性克隆酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析M:DNA 分子量标准;1:被酶切的阳性克隆;2:被酶切的阴性对照。Fig.5Agarose gel electrophoretic analysis of digestiveproducts of a positive pMD18-T clone ligated with Or原CrGHl cDNA insertM:DNA marker;1:Positive clone digested with Xba玉andEcoR玉;2:Negative control(pMD18-T plasmid)digested withXba玉and EcoR玉.XP 015647631.1 Oryza sativa japonica groupOrCrGHlEEC82204.1 Oryza sativa indica groupKAF0909584.1 Oryza meyeriana var.granulataXP 006657798.2 Oryza brachyanthaKAB8105765.1 Oryza sativaXP 020155797.1 Aegilops tauschii subsp.tauschiiBAJ90025.1 Hordeum vulgare subsp.vulgareXP 037468134.1 Triticum dicoccoidesKAF7008150.1 Triticum aestivumKAE8793885.1 Hordeum vulgareXP 037007911.1 Artibeus jamaicensisXP 021307883.1 Sorghum bicolorXP 034593173.1 Setaria viridisTVU38669.1 Eragrostis curvulaPUZ72350.1 Panicum hallii var.halliiXP 025802915.1 Panicum halliiXP 020396960.1 Zea maysKAF8669167.1 Digitaria exilis20M12bp2 0001 000M12bp2 0001 0003 000莫香等：茶陵野生稻冷响应基因 OrCrGHl 的表达与克隆列一致,而第 114 位至第 1 441 位核苷酸残基序列与第 18 259 186 位至第 18 257 860 位核苷酸残基的相应序列相差 2 个碱基,相似性为99.85%;其 cDNA 第 56 位至第 1 736 位核苷酸残基序列与短花药野生稻(Oryza brachyantha)的基因 cDNA(XM_006657735)的第 84 位至第 1 769 位核苷酸残基序列的相似性为 79.88%。然而,在模式植物拟南芥中未找到高相似基因。根据预测的该基因编码的蛋白质氨基酸序列,在 NCBI 数据库进行蛋白质相似性比对(Blastp)分析,结果显示,该基因编码蛋白与糖基水解酶基因家族编码的多个蛋白质序列高度相似。通过MEGA7.0 软件进一步构建了它们的系统进化树图谱,图谱显示 OrCrGHl 基因编码蛋白与 XP_015647631.1(Oryza sativa japonica group)亲缘关系最近(图 6),二者的序列完全一致(图 7)。XP_015647631.1 由日本晴第 7 号染色体上的 LOC4343492 基因编码,注解为 glucan endo-1,3-beta-glucosidase GII isoformX2。此外,OrCrGHl 基因编码蛋白与籼稻 93-11预测蛋白质(EEC82204.1,hypothetical protein OsI_26347)的相似性为99.28%,与日本晴XP_015647630.1蛋白(glucan endo-1,3-beta-glucosidase 3 isoformX1)的相似性为 92.69%,其第 18 位至第 557 位氨381生命科学研究圆园23 年图 7OrCrGHl 编码蛋白与其他类似蛋白质的比对XP_015647631.1 和 XP_015647630.1 为粳稻日本晴蛋白质,EEC82204.1 为籼稻 93-11 的蛋白质,XP_006657798.2 为短花药野生稻蛋白质。大写字母表示氨基酸,括号中数字代表左边第一个氨基酸的序号,“*”代表所有蛋白质在该位点的氨基酸残基一致,“.”代表所有蛋白质在该位点的氨基酸残基一致性很高,字母加粗区域表示结构域。Fig.7Sequence alignment of the OrCrGHl and other similar proteinsXP_015647631.1 and XP_015647630.1 are similar proteins in japonica rice,EEC82204.1 is a similar protein in indica rice va原riety 93-11,and XP_006657798.2 is a similar protein in wild rice(Oryza brachyantha).Capital letters represent abbreviationsfor amino acids.The number in a bracket indicates the site of the first amino acid from the left.“*”means that the amino acidresidues at this site are the same in all the proteins,and“.”means that the amino acid residues at this site are almost the same.The regions with bold letters are the glycoside hydrolase(glyco-hydro)superfamily or X8 domains.XP 015647631.1OrCrCHlEEC82204.1XP 015647630.1XP 006657798.2(1)(1)(1)(1)(1)XP 015647631.1OrCrCHlEEC82204.1XP 015647630.1XP 006657798.2(23)(23)(23)(38)(46)XP 015647631.1OrCrCHlEEC82204.1XP 015647630.1XP 006657798.2(54)(54)(54)(98)(78)XP 015647631.1OrCrCHlEEC82204.1XP 015647630.1XP 006657798.2(114)(114)(114)(158)(138)XP 015647631.1OrCrCHlEEC82204.1XP 015647630.1XP 006657798.2(174)(174)(174)(218)(198)XP 015647631.1OrCrCHlEEC82204.1XP 015647630.1XP 006657798.2(234)(234)(234)(278)(258)XP 015647631.1OrCrCHlEEC82204.1XP 015647630.1XP 006657798.2(294)(294)(294)(338)(317)XP 015647631.1OrCrCHlEEC82204.1XP 015647630.1XP 006657798.2(354)(354)(354)(398)(377)XP 015647631.1OrCrCHlEEC82204.1XP 015647630.1XP 006657798.2(413)(413)(413)(457)(437)XP 015647631.1OrCrCHlEEC82204.1XP 015647630.1XP 006657798.2(473)(473)(473)(517)(497)XP 015647631.1OrCrCHlEEC82204.1XP 015647630.1XP 006657798.2(533)(533)(533)(577)(557)X8 domainX8 domainGlyco-hydro superfamily基酸与短花药野生稻 XP_006657798.2 蛋白(glu-can endo-1,3-beta-glucosidase 12-like)第 41 位至第 581 位氨基酸的相似性为 77.86%(图 7)。它们都包含 2 个与碳水化合物结合有关的 X8 结构域及1 个糖基水解酶超家族结构域,因此,我们推测OrCrGHl 基因编码一个糖基水解酶相似蛋白质,该蛋白质具有葡聚糖水解酶活性,很可能在冷适应过程中起重要作用。382第 5 期图 8预测的 OrCrGHl 启动子区域顺式作用调控元件ABRE、TCA-element、CGTCA-motif、Myb-binding site、ARE 分别表示脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯、干旱、厌氧响应元件,GT1-motif、G-box、chs-Unit 1 m1 表示光响应元件,ATG 为翻译起始位点。Fig.8The possible cis-acting regulatory elements in the putative promoter region of OrCrGHl geneABRE:Abscisic acid-responsive element;TCA-element:Salicylic acid-responsive element;CGTCA-motif:MeJA-responsiveelement;Myb-binding site:Drought stress-responsive element;ARE:Anaerobism-responsive element;GT1-motif,G-box,andchs-Unit 1 m1:Light-responsive elements;ATG:The translation initiation site.TATA-boxTATA-boxTATA-boxTATA-boxTATA-boxTATA-boxTATA-boxTATA-boxTATA-boxTATA-boxTATA-boxTATA-boxTATA-boxGT1-motifTCA-elementATTATA-boxATTATA-boxATTATA-boxATTATA-boxATTATA-boxATTATA-boxARE ABRE G-boxMyb-binding siteCGTCA-motifchs-Unit 1 ml莫香等：茶陵野生稻冷响应基因 OrCrGHl 的表达与克隆最后,采用 PlantCARE 工具(http:/bioinforma-tics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/),依据 Or-CrGHl基因的 cDNA 在水稻日本晴基因组中对应的核苷酸序列,对其翻译起始密码 ATG 前 1.5 kb的启动子区域序列(AP005786.2,范围:15 24116 769 的反向互补序列)进行了顺式作用调控元件的在线分析,找到多个可能与逆境及逆境激素诱导相关的顺式作用调控元件(图 8),这些元件有可能参与 OrCrGHl 对逆境胁迫的响应。3讨论研究表明,在逆境锻炼(stress acclimation)过程中,植物很多基因的表达水平会发生显著变化(上调或下调),导致体内一些生理生化过程的适应性调整,如糖分与游离脯氨酸的积累、可溶性蛋白的增加、膜系统组分的改变等,因而耐逆性增强28-30。一些逆境应答基因往往就是耐逆相关基因,参与植物对逆境的适应过程。本研究表明,OrCrGHl 基因是茶陵野生稻苗期对冷胁迫有应答而表达水平显著上调的基因,而栽培稻培矮 64S 中的相似基因则对冷胁迫几乎不应答,CrGHl 的表达量高低与它们的耐冷性强弱密切相关;在 OrCrGHl 基因可能的启动子区域找到一些与逆境及逆境激素如脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)响应相关的顺式作用调控元