肠炎宁对猪大肠杆菌肠道感染的保护作用.pdf

中国兽医杂志():肠炎宁对猪大肠杆菌肠道感染的保护作用于欢坤 彭增斌 孙 艳 单 虎 王 新 吴帅成(青岛农业大学动物医学院 山东 青岛)摘要:为评价中药肠炎宁对猪大肠杆菌感染小鼠肠道的保护效果并初步研究其机制本试验将 级/小鼠随机分为空白对照组、大肠杆菌 组和肠炎宁组 个组大肠杆菌 组和肠炎宁组小鼠通过口服产肠毒素性大肠杆菌 诱导腹泻模型 后分别灌服生理盐水和肠炎宁药液连续给药 检测不同组别小鼠的存活时间、体重变化、肠道病理变化、结肠长度变化、肠道通透性和炎症因子等指标变化并分析炎症因子信号通路蛋白表达情况 结果显示与空白对照组相比大肠杆菌 组小鼠出现死亡存活时间显著缩短()体重显著下降()结肠显著缩短()肠道通透性和血清髓过氧化物酶()活性显著升高()血清和结肠组织中 和 水平显著升高()与大肠杆菌 组相比肠炎宁组小鼠存活时间显著延长()体重显著增加()结肠显著增长()肠道通透性和血清 活性显著下降()血清和结肠组织中 和 水平显著下降()组织病理学观察结果显示肠炎宁可缓解大肠杆菌 感染导致的结肠杯状细胞肿大和炎性细胞浸润免疫组化结果显示肠炎宁可抑制大肠杆菌 导致肠道组织中 和 的上调 结果表明肠炎宁对猪大肠杆菌肠道感染具有良好的治疗作用本试验结果为肠炎宁应用于兽医临床提供了数据支持关键词:肠炎宁 猪大肠杆菌 肠道感染 保护作用中图分类号:文献标志码:文章编号:()():()/:.(.)(.)(.)()(.)(.).(.)(.)()(.)(.).:收稿日期:基金项目:年度山东省新旧动能转换重大课题攻关项目青岛农业大学高层次人才科研基金()青岛农业大学大学生创新创业训练计划作者简介:于欢坤()女硕士生研究方向为中兽医药学:彭增斌()男本科生就读于动物医学专业:注:彭增斌与于欢坤对本文具有同等贡献通信作者:吴帅成:中 西 结 合 卷 细菌感染是危害畜牧养殖业健康发展的重要因素之一 大肠杆菌是引起人和动物肠道疾病最重要的病原体之一可引起仔猪黄白痢和禽大肠杆菌 病 等 疾 病 其 中 产 肠 毒 素 大 肠 杆 菌()是猪大肠杆菌病的常见病原体其主要毒力因子为黏附素和肠毒素 可以通过黏附素等毒力因子定植于肠道上皮引起肠道通透性增加和炎症反应导致仔猪生长发育迟缓、死亡和饲料利用率下降使养猪业遭受严重经济损失中药可以通过调节机体免疫和抑制细菌毒力等作用来防治细菌性疾病因此成为抗猪大肠杆菌病药物研究的热点 中药肠炎宁由地锦草、黄毛耳草、樟树根、香薷和枫香树叶 味中药组成具有清热解毒、化湿止泻等功效常用于湿热蕴结胃肠所致的腹泻、小儿消化不良 现代药理学研究表明肠炎宁具有抗菌、抗炎和松弛肠道平滑肌等作用 因此推测肠炎宁具有防治猪大肠杆菌病的潜力但目前罕见报道 本试验拟建立猪大肠杆菌小鼠肠道感染模型评价肠炎宁对大肠杆菌感染小鼠的保护效果为其应用于兽医临床防治猪大肠杆菌病提供数据支持 材料与方法 主要试剂和仪器 地锦草、黄毛耳草、樟树根、香薷和枫香树叶均购自山东省青岛市城阳人民医院、试剂盒均购自上海酶联生 物 科 技 有 限 公 司 髓 过 氧 化 物 酶()试剂盒购自南京建成生物工程研究所荧光素钠购自北京索莱宝科技有限公司诱导型一氧化氮合成酶()和 样受体()一抗均购自武汉赛维尔生物科技有限公司生化培养箱购自广东省医疗器械制造仪器厂超声波破碎仪购自上海比朗仪器制造有限公司高压蒸汽灭菌器购自松下健康医疗器械株式会社酶标仪购自科麟得实验仪器股份有限公司光学显微镜购自奥林巴斯 实验动物 级/小鼠雌性 周龄体重()购自济南朋悦实验动物繁育中心生产许可证号:(鲁)猪大肠杆菌的培养产肠毒素性大肠杆菌(菌号:)由青岛农业大学动物医学院临床诊断学实验室惠赠 从 冰箱取出细菌复苏后接种至肉汤培养基 振荡培养 使用麦氏比浊仪测定细菌浓度 肠炎宁汤剂的制备 称取地锦草 、黄毛耳草 、樟树根、香薷、枫香树叶 加入 倍量蒸馏水煮沸 过滤取药液药渣加入 倍量蒸馏水煮沸 重复 次合并药液离心后静置取上清液过滤浓缩至 /浓缩液于高压灭菌器内灭菌于 冰箱保存备用 试验方法 动物分组和造模小鼠适应性喂养 随机分为 个组每组 个重复每个重复 只:空白对照组()、大肠杆菌 组()和肠炎宁组()小鼠禁食禁水 称重大肠杆菌 组和肠炎宁组按/只剂量口服感染大肠杆菌空白对照组给予等量新鲜培养基 大肠杆菌 感染 后当小鼠精神不振出现眼睑分泌物时肠炎宁组小鼠按 /()剂量灌服肠炎宁药液空白对照组和大肠杆菌 组给予等剂量生理盐水连续给药 称重观察并记录小鼠的存活时间和临床症状 结肠组织病理学观察末次给药 后每组随机选取 只小鼠取结肠组织去除内容物 多 聚 甲 醛 固 定 石 蜡 包 埋 苏 木 精 伊 红(.)染色进行组织病理学观察 结肠长度和肠道通透性检测末次给药 后每组随机选取 只小鼠按 /只剂量灌服 荧光素钠 后取结肠组织无张力状态下量取结肠长度 清洗匀浆加入 三氯乙酸溶液 放置 离心取上清 加入 孔 板 中 酶 标 仪 检 测 荧 光 强 度 激 发 波 长 发射波长 血清 活性检测 末次给药 后每组随机选取 只小鼠眼球采血静置离心取血清按照 试剂盒说明书操作检测血清 活性 血清和结肠组织炎性细胞因子检测末次给药 后每组随机选取 只小鼠同 方法采血制备血清 采血后处死小鼠剪取结肠组织约 称重 匀浆离心收集上清 按照 试剂盒说明书操作检测血清和结肠组织中 和 水平 结肠组织中 和 表达检测 应用免疫组化法将结肠石蜡切片脱蜡至水抗原修复封闭、一抗孵育过夜漂洗二抗孵育 期于欢坤等:肠炎宁对猪大肠杆菌肠道感染的保护作用 显色复染细胞核常规脱水中性树胶封片于显微镜下观察并拍照 统计分析使用 软件对数据进行统计学分析试验结果以“平均值 标准差”表示存活时间比较采用 法其他组间比较采用 检验 表示差异显著 表示差异极显著 结果 小鼠存活时间和临床症状观察感染猪大肠杆菌 后小鼠被毛粗乱精神沉郁羞明蜷缩眼睑红肿分泌物增多食欲减退甚至出现死亡 与空白对照组相比大肠杆菌 组小鼠存活时间显著缩短()与大肠杆菌 组相比肠炎宁组小鼠的存活时间显著延长()(图)给药 后小鼠精神状态有所好转食欲和活动量逐渐增加 在感染 后与空白对照组相比大肠杆菌 组小鼠体重显著下降()与大肠杆菌 组相比肠炎宁组小鼠体重显著增加()(图)结肠组织病理学观察 与空白对照组相比大肠杆菌 组小鼠肠黏膜上皮细胞脱落杯状细胞肿大出现黏液肠绒毛变短变平出现炎性细胞浸润与大肠杆菌 组相比肠炎宁组杯状细胞肿大减轻肠绒毛排列规则有序炎性细胞浸润明显减少(图)图 不同组小鼠存活时间()和体重()变化 ()():.下图同:.图 小鼠结肠组织病理学观察(.染色 )(.):空白对照组:大肠杆菌 组(黄色箭头:杯状细胞肿大浆液渗出肠绒毛变短变平 白色箭头:炎性细胞浸润):肠炎宁组:(:):结肠长度和肠道通透性检测为了评价肠道功能首先检测结肠长度变化然后采用荧光素钠法检测肠道通透性 结果显示猪大肠杆菌感染导致小鼠肠道显著缩短()经肠炎宁处理后小鼠结肠长度有恢复()(图)与空白对照组相比大肠杆菌 组小鼠肠道通透性显著升高()经肠炎宁处理后肠道通透性显著下降()(图)血清 活性检测与空白对照组相比大肠杆菌 组小鼠血清中 活性显著升高()与大肠杆菌 组相比肠炎宁组小鼠血清 活性显著降低()(图)血清和结肠组织炎性因子检测结果如图 所示与空白对照组相比大肠杆菌 组小鼠血中 西 结 合 卷清和结肠组织中 和 水平显著升高()与大肠杆菌 组相比肠炎宁组小鼠血清和结肠组织中 和 水平显著下降()图 小鼠结肠长度()和肠道通透性()检测 ()()图 小鼠血清 活性检测 结肠组织中 和 表达检测 结果如图 所示与空白对照组相比大肠杆菌 组小鼠结肠组织中 和 蛋白表达量升高与大肠杆菌 组相比肠炎宁组小鼠结肠组织中 和 蛋白表达量减少 讨论肠道健康的维持对畜禽的生长发育起着重要作用而大肠杆菌等肠道细菌感染是导致猪肠道功能紊乱和生产性能下降的主要原因 是猪大肠杆菌病的常见病原体能够引起仔猪腹泻和体重下降甚至导致死亡 中药肠炎宁具有清热利湿和行气的功效在人医临床上适用于溃疡性结肠炎、慢性结肠炎、直肠炎、慢性菌痢、肠易激综合症等多种疾病 本试验结果显示中药肠炎宁可以抑制猪大肠杆菌感染导致的小鼠死亡和体重减轻改善其肠道屏障功能表明肠炎宁对猪大肠杆菌感染小鼠具有很好的治疗作用为兽医临床防治猪大肠杆菌病提供了数据支持炎性反应在大肠杆菌病等感染性疾病中起着重要作用 和 是重要的促炎因子常用作评价炎症反应的典型生物标志物 多项研究表明大肠杆菌 肠道感染可以导致 和 分泌增多 富含于中性粒细胞由粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并存储于噬天青颗粒内 大肠杆菌等病原微生物刺激肠道可导致中性粒细胞聚集从而释放 肠炎宁可以抑制猪大肠杆菌感染导致的小鼠血清和结肠组织中 和 水平升高并抑制血清 活性表明肠炎宁可以抑制猪大肠杆菌诱导的炎症反应大肠杆菌可以通过激活 信号通路调节促炎因子 和 的分泌 同时激活 和炎症细胞因子可以上调 表达诱导氧化应激损伤 此外现代药理学研究证实地锦草、枫香树叶、黄毛耳草、樟树根和香薷含有槲皮素和山奈酚等成分具有抗氧化和抗炎等作用表明肠炎宁可能通过抑制 和 的上调来抑制猪大肠杆菌感染导致的肠道炎性反应减轻肠道组织损伤综上所述肠炎宁能够缓解猪大肠杆菌感染导致的小鼠死亡和体重下降改善肠道屏障功能减轻肠道组织损伤 同时肠炎宁能够抑制猪大肠杆菌感染导致的小鼠炎性反应抑制结肠组织 和 上调 表明肠炎宁对猪大肠杆菌肠 期于欢坤等:肠炎宁对猪大肠杆菌肠道感染的保护作用 图 小鼠血清和结肠组织中炎性细胞因子的检测 图 免疫组化法检测小鼠结肠组织中 和 的表达()()道感染具有保护作用为其进一步应用于兽医临床防治猪大肠杆菌病提供了依据 但是肠炎宁在靶动物猪上的临床应用和机制尚需进一步研究参考文献:.():.中 西 结 合 卷 .():.:.():.董颖刘保光许二平.黄连解毒汤抗炎作用与临床应用研究进展.中国实验方剂学杂志():.王同慧凌保东.抗细菌生物被膜感染中药的研究进展.中药药理与临床():.王海荣朱振娜付合明等.肠炎宁颗粒对幼龄小鼠的抗炎止泻作用及体外抗菌作用研究.药物评价研究():.():.:.():.:.严建良.肠炎宁分散片的研制 .上海:华东理工大学.侯静黎理蔡毅.地锦草组药用植物的研究进展.华西药学杂志():.姚奕许浚黄广欣等.香薷的研究进展及其质量标志物预测分析.中草药():.吴静胡居吾熊伟等.樟树不同器官中多糖抗氧化、免疫调节活性的研究.江西农业大学学报():.李丽李颖陈志雄.微波辅助枫香树叶黑色素提取及其稳定性研究.保山学院学报():.