苯甲酸在全价饲料中的抑菌效果评价.pdf

问题探讨2023年第44卷第22期 总第691期苯 甲 酸 在 全 价 饲 料 中 的 抑 菌 效 果 评 价 任蒙蒙 董 伟 湛梦颖 汪仕奎 邢丽维*（帝斯曼（中国）动物营养研发有限公司，河北霸州 065799）摘 要：研究使用一种新的简便、快速、灵敏的方法来评价苯甲酸在全价饲料环境中抑菌效果。试验将不同类型全价饲料（保育料、鸡全价料、教槽料）按照110与水混合，在灭菌后接种大肠杆菌K88+进行培养，在不同时间点取10、20 L和30 L（浓度分别为0、0.03%、0.30%）添加到培养皿形成多点矩阵，培养24 h后观察菌斑的形态。并通过保育料比较不同浓度的苯甲酸（0、0.08%、0.10%）和青霉素钠（0.002 5%、0.003 0%、0.003 5%）处理组菌斑形态，考察该方法的灵敏性。结果表明：苯甲酸添加量为0.03%时，在教槽料中的体外抑菌效果优于保育料与鸡全价料；在保育料中添加0.08%苯甲酸，对大肠杆菌K88+有抑菌作用，抑菌效果与添加量成正比；当苯甲酸和青霉素钠浓度分别变化0.02%和0.000 5%时，抑菌效果有明显差异，说明本方法较灵敏。综上所述，全价饲料作为细菌培养基影响了苯甲酸对大肠杆菌K88+体外抑菌效果；本研究所用方法较灵敏，可评估不同类型抑菌剂在不同类型饲料中的最适添加量，从而为畜牧业提供了切合实际生产的依据。关键词：苯甲酸；全价饲料；抑菌方法；大肠杆菌；青霉素钠；抑菌剂doi:10.13302/ki.fi.2023.22.015中图分类号：S816.17 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）22-0094-05Evaluation of Bacteriostatic Performance of Benzoic Acid in Complete FeedREN Mengmeng DONG Wei ZHAN Mengying WANG Shikui XING Liwei*(DSM(China)Animal Nutrition Research Center,Hebei Bazhou 065799,China)Abstract：This study aimed to evaluate the bacteriostatic performance of benzoic acid in a complete feed environment using a new simple and sensitive method.In the experiment,different types of complete feed(pig nursery feed,chicken complete feed,and creep feed)were mixed with water according to 110,inoculated with E.coli K88+after sterilization,and 10 L,20 L and 30 L(concentrations of 0,0.03%,and 0.30%,respectively)were added to the Petri dish to form a multi-point matrix at different time points,and the morphology of the plaque was observed after 24 h of incubation.Benzoic acid(0,0.08%,0.10%)and penicillin sodium(0.002 5%,0.003 0%,0.003 5%)were included in the pig nursery feed culture medium to evaluate the sensitivity of this method.The in vitro bacteriostatic effect in the creep feed was better than that of pig nursery feed and chicken feed When the amount of benzoic acid was 0.03%.The addition of 0.08%benzoic acid to the pig nursery feed has an antibacterial effect on E.coli K88+,and the antibacterial effect is proportional to the amount added.When the concentrations of benzoic acid and penicillin sodium changed by 0.02%and 0.000 5%,respectively,there was a significant difference in the number of colonies,indicating that the method was more sensitive.In summary,complete feed as bacterial culture medium may comprise or enhance the bacteriostatic effect of benzoic acid on E.coli K88+in vitro.The method used in this study is more sensitive,which can evaluate the optimal amount of different types of bacteriostatic agents in different types of feed,so as to provide a useful tool for feed industry and animal husbandry.Key words：benzoic acid;complete feed;bacteriostatic methods;E.coli K88+;penicillin sodium;bacteriostatic agents在现代畜牧业中，抗生素因安全问题已经被限制作为饲料添加剂使用，抗生素替代物成为动物营养研究的重点。市场上具有抑菌效果的产品种类繁多，作作者简介：任蒙蒙，硕士，研究方向为动物肠道健康。*通讯作者：邢丽维，硕士。收稿日期：2023-07-1894SILIAO GONGYE2023年第44卷第22期 总第691期用机理和化学特性各不相同，如何科学有效地评估相关产品的实际效果给行业带来困扰1-2。目前，评估体外抑菌方法主要扩散法（琼脂平板扩散法和 E-test法）、梯度稀释法（微量、大量肉汤稀释和琼脂稀释）、时间杀伤试验、薄层色谱生物自显影法、生物发光和流式细胞荧光法等3。首先，这些方法中所涉及的培养基均为标准培养基，而抑菌产品在饲料中的实际效果会受到多种因素的影响，比如饲料成分、pH。因此，基于标准培养基的评估方法无法准确模拟实际生产效果。其次，这些经典方法也具有各自的局限性。比如扩散法的抑菌原理是渗透扩散产生浓度梯度，适用于易溶于水的抑菌物质的测定，对于水溶性低的植物精油，可用二甲基亚砜进行助溶4-5，然而以二甲基亚砜为溶剂时,还需要注意其本身的抗菌作用6，而且添加助溶剂与实际使用场景有一定差别。琼脂稀释法操作繁琐，不适合实验室的常规开展，只能作为回顾性监测7。再次，因成本限制一般企业不具有使用薄层色谱生物显影和流式细胞荧光法评估抑菌剂性能的能力。由此可见，基于自身饲料配方组成、抑菌剂的特性、设备情况和操作的便利性等因素综合考虑开发出的评估方法，才能满足大多数全价饲料企业的现实需求。作为一种安全有效的抗生素类添加剂，苯甲酸在畜禽生产中得到广泛的应用8。然而，苯甲酸微溶于水，不能使用基于扩散的牛津杯法等来评估其抑菌特性。类似于苯甲酸，低溶解度抑菌物质还有很多，比如姜黄素、大蒜素、白藜芦醇等9-11。本试验以苯甲酸为主要研究对象，研究一种基于全价饲料、具有直观、高灵敏、操作简洁的评估方法，以促进抑菌剂的科学合理使用，合理配置资源，降低饲料成本。1 材料与方法1.1 试剂与仪器氯化钠购于国药集团化学试剂有限公司；苯甲酸（含量98%）购于Sigma；青霉素钠（160万单位）购于商丘市成达动物药品厂；胰蛋白大豆肉汤（TSB）培养基、溶菌肉汤（LB）琼脂培养基均购于北京陆桥技术股份有限公司；保育料、鸡全价料、乳猪教槽料均由帝斯曼（中国）动物营养研发有限公司生产（不含有抗生素和苯甲酸）；大肠杆菌K88+（CVCC198）购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。ZQWY-200 卧式全温振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司）；GI54DWS高压蒸汽灭菌锅致微（厦门）仪器有限公司、GHP-9160隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、BSC-1300 A2生物安全柜（苏净安泰）、Mf3菌落统计/显微细胞仪（杭州迅数科技有限公司）、OLS200振荡水浴锅（格兰特）、MS3002S型电子天平梅特勒托利多科技（中国）有限公司、紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司。1.2 制备饲料培养基将饲料粉碎后，过0.25 mm筛，取10 g加入90 mL超纯水10倍稀释饲料，再添加不同类型抑菌剂（可耐高温），充分混匀，然后进行高压蒸汽灭菌（115、20 min），当添加不耐高温的抑菌剂时，如抗生素，要在饲料稀释液灭菌后冷却至50 以下时再添加，制备饲料培养基。1.3 菌液制备及接种将大肠杆菌 K88+单菌落用胰蛋白大豆肉汤（TSB）液体培养基37 培养3 h左右，取2 mL加到比色皿中测定 OD值，OD600为0.51.0时，取100 L菌液加入到饲料培养基中，接种后，饲料培养基中大肠杆菌的含量约为105 CFU/mL。1.4 不同时间点取样及培养如图1所示，分别于接种前、接种后0 h和16 h取样。取100 L饲料培养基，加入到900 L生理盐水中，混匀备用。每一个处理组，分别取 10、20 L 和30 L 混悬液滴加到LB 琼脂培养基中。37恒温培养1824 h，用菌落计数仪进行观察并拍照。根据LB培养基上液滴处菌落生长状况评估抑菌剂的抑菌效果，与不含抑菌剂的对照组相比，菌落数减少即有抑菌作用，菌落数越少抑菌作用越强。1.5 不同类型饲料培养基组成在保育料、鸡全价料、教槽料饲料稀释液中分别添加0、0.03%、0.30%的苯甲酸（具体组成见表1），接种大肠杆菌培养后，观察大肠杆菌在不同类型饲料培养基中的生长差别。1.6 保育料中添加苯甲酸和青霉素钠的抑菌效果对比在保育料培养基中添加不同浓度的苯甲酸或青霉素钠（具体组成见表2），接种大肠杆菌培养后，通过与无抑菌剂空白组对比，观察不同浓度的抑菌剂的抑菌效果。2 结果与讨论2.1 方法的优势如图1所示，本试验检测周期为3d，操作步骤简单，不需要大型仪器，成本较低。本方法将培养皿分为三个区域，每一个区域内为一个处理组，在每个区域内滴入含不同体积（10、20 L和 30 L）稀释液，形成小、中和大三个圆点，如图2所示，从而可以在同一培养皿上观察不同抑菌剂的生长情况。使用菌落法考察不同苯甲酸抑菌能力的大小时，将培养好的抑菌后菌悬液进行不同浓度梯度的稀释，每一个稀释度需要多个独立的培养皿作为平行12。相比而言，本方法减少了稀释梯度，节省了培养皿的95问题探讨2023年第44卷第22期 总第691期使用量，减少涂布和计数时间，本方法可批量操作。使用肉汤稀释法时，加入抑菌剂培养24 h后，观察试管或96孔板底部，浑浊带有沉淀说明有细菌生长，澄清透明说明相应药物浓度有抑菌作用13-14。陈聪15和张昊雪4分别通过指示剂刃天青和TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)颜色的变化来表示细菌的生长，但是均无法直接对比澄清透明或无颜色变化的管（孔）之间细菌含量差异。如图3所示，本方法中处理组B2、C2、E2和F2在接种后培养16 h均比初始接种时的菌落数减少，说明在此浓度下均有抑菌作用，同时可根据菌落数的多少对比不同抑菌剂在此浓度下的抑菌性能差异。抑菌培养24 h后，古丽巴哈尔 托乎提16用一次性无菌接种环从试管取出1环液体划线平板，唐亮17分别取各孔培养物20 L，点种于培养基上，徐欣欣14从无细菌沉淀产生的孔中吸取10 L内容物滴至培养基，以是否生长菌落来判定抗菌物质的最小杀菌浓度（MBC）。类似地，本方法分别于接种前、接种后0 h和接种后16 h，取稀释液10、20 L和30 L滴加到培养基上，不仅能根据无菌落生长判定杀菌浓度，同时可纵向对比同一抑菌剂随时间菌落数的变化，判定抑菌剂在此浓度下的抑菌性能，横向对比同一抑菌时间下不同抑菌剂的抑菌效果。图1 检测流程表2 不同含量苯甲酸和青霉素钠在保育料中饲料培养基组成处理A2B2C2D2E2F2抑菌剂无苯甲酸苯甲酸青霉素钠青霉素钠青霉素钠抑菌剂浓度(%)00.080.100.002 50.003 00.003 5抑菌剂质量(mg)0801002.53.03.5饲料质量(g)101010101010超纯水(mL)909090909090表1 不同饲料培养基组成处理A1B1C1D1E1F1G1H1I1饲料类型保育料保育料保育料鸡全价料鸡全价料鸡全价料教槽料教槽料教槽料苯甲酸浓度(%)00.030.3000.030.3000.030.30饲料质量(g)101010101010101010苯甲酸质量(mg)030300030300030300超纯水(mL)90909090909090909096SILIAO GONGYE2023年第44卷第22期 总第691期苯甲酸溶解度较低，使用扩散法测定，牛津杯内或滤纸上会以晶体的形式析出，不能准确评估其抑菌效果。本方法有效避免扩散法对难溶物质测定的局限性。此外，本方法直接观察菌落数量，从而克服了使用比浊法受颜色干扰的问题18，为姜黄素等抑菌效果评估提供了方法。2.2 不同全价饲料对抑菌效果的影响本试验利用饲料培养基更接近实际，更能体现抑菌剂在生产中的实际效果。本试验所用的全价料均未添加苯甲酸和任何抗生素。由于苯甲酸在饲料中的添加量为35 kg/t19，所使用的培养基中选择苯甲酸添加浓度为0.30%。如图2所示，分别以保育料、鸡全价料和教槽料为培养基，在接种前，保育料、鸡全价料和教槽料中均没有菌落形成，说明该培养基因灭菌处理后为无菌状态。接种后0 h，所有处理组饲料均有菌落形成，且溶液边缘处菌落形成圆环，处理组间无差异，说明接种量一致。接种后16 h，保育料组和鸡全价料组在相同处理条件下，培养皿上菌落数及生长形态大体一致，且A1、D1组菌落数明显多于接种后0 h，说明大肠杆菌在饲料液体培养基中生长良好；在相同苯甲酸浓度下，而教槽料组的菌落数明显少于保育料组和鸡全价料组，说明教槽料中本身存在其他因素直接或者间接抑制了大肠杆菌的生长。张博20表明酸化剂在家禽养殖中的应用效果受基础日粮类型和日粮组成的影响。本试验中不同类型全价饲料添加同一浓度的苯甲酸，菌落数有差异，苯甲酸添加量为0和0.03%时，教槽料组中菌落数少于保育料组和鸡全价料组，苯甲酸添加量为0.30%时，教槽料组和保育料组的菌落数少于鸡全价料组，说明不同类型全价料对抑菌剂的抑菌效果存在影响，可根据不同类型全价饲料合理选择抑菌剂的添加量以节省成本。2.3 保育料中添加苯甲酸和青霉素钠的抑菌效果由图3可知，以保育料为培养基时，接种前所有处理组均没有菌落形成。接种后0 h所有处理组均有菌落形成，且溶液边缘处菌落形成圆环，处理组间无差异。接种后16 h，苯甲酸组中，C2组菌落数（苯甲酸0.1%）少于B2组（苯甲酸0.08%），二者均少于A2组（对照）；青霉注：A1、D1和G1：对照组；B1、E1和H1：苯甲酸添加量0.03%；C1、F1和I1：苯甲酸添加量0.30%。图2 不同类型饲料添加苯甲酸的抑菌效果A1A1A1B1B1B1C1C1C1D1D1D1E1E1E1F1F1F1G1G1G1H1H1H1I1I1I1保育料鸡全价料教槽料接种前接种后0 h接种后16 h97问题探讨2023年第44卷第22期 总第691期素组中，F2组（青霉素钠0.003%）菌落数少于E2组（青霉素钠0.003 5%），二者均少于A2组（对照），D2组（青霉素钠0.002 5%）菌落生长情况与A2组（对照）一致。B2组（苯甲酸0.08%）与E2组（青霉素钠0.003%）菌落数相似、C2组（苯甲酸0.1%）与F2组（青霉素钠0.003 5%）菌落数相似，说明在苯甲酸和青霉素钠在保育料中抑菌效果：C2组=F2组B2组=E2组D2组。苯甲酸和青霉素钠浓度分别增加时，菌落数随之减少，当苯甲酸和青霉素钠浓度分别变化0.02%和0.000 5%时，抑菌16 h后菌落数有明显的差异，说明本方法较灵敏。注：A2为对照组，B2和 C2组苯甲酸含量分别为 0.08%、0.10%，D2、E2和 F2青霉素钠含量依次为 0.002 5%、0.003%和0.003 5%。图3 保育料中添加苯甲酸和青霉素钠的抑菌效果A2A2A2B2B2B2C2C2C2D2D2D2E2E2E2F2F2F2苯甲酸青霉素钠接种前接种后0 h接种后16 h酸化剂作用并不是剂量依赖性20，所以选择酸化剂的最适添加量很关键。同时，在使用每种酸化剂之前，需要具体考虑其抑制作用及效果21。由于本方法抑菌剂添加量在相对窄的范围，也能评估其抑菌效果的差别，在实际应用中，可根据需要评估抑菌产品的最适添加量，以节约成本。如图3所示，当抑菌16 h时，试验组的菌落数少于对照组A2，即有抑菌效果，根据试验组菌落数的疏密即可对比抑菌剂的抑菌效果强弱。3 结论本研究利用全价料做细菌培养基、构建肉眼可见的微量接种矩阵，建立了一种简洁、快速、灵敏度高的体外评估方法，可评估不同类型抑菌剂在不同类型饲料中的最适添加量。运用此方法试验得出：同一浓度苯甲酸以教槽料为培养基时，对大肠杆菌K88+的抑菌效果优于保育料和鸡全价料；在保育料中添加0.08%苯甲酸，可明显观察到对大肠杆菌K88+有抑制作用。参考文献1 田志梅,崔艺燕,杜宗亮,等.抗生素替代物在畜禽养殖中的研究及应用进展J.动物营养学报,2020,32(4):1516-1525.2 曾建国.饲用替抗产品应用与开发进展J.饲料工业,2022,43(9):1-6.3 BALOUIRI M,SADIKI M,IBNSOUDA S K.Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity:a reviewJ.Journal of Pharmaceutical Analysis,2016,6(2):71-79.4 张昊雪,屠焰,胡凤明,等.植物提取物对犊牛致病菌的体外抑菌效果研究J.饲料工业,2022,43(4):15-20.5 闫红秀,刘香萍,任乃芃,等.肉桂精油及其主要组分对饲料中常见真菌的抑菌活性的研究J.饲料工业,2022,43(17):47-53.6 池水晶,冯时,王艳红,等.二甲基亚砜的体外抗菌活性研究J.中国热带医学,2014,14(3):348-349,354.7 梁佩婵,吴志周,林仲女.微量稀释法和琼脂稀释法测定淋球菌药物敏感性的比较J.人人健康,2022(15):96-98.8 易鑫,陈勇,舒刚.苯甲酸的生物学功能及其在畜禽生产中的应用研究进展J.饲料工业,2023,43(3):13-17.9 王永辉,汪新月,郭卫芸,等.反溶剂诱导法和p H驱动法对姜黄素的增溶及稳态化J.食品研究与开发,2023,44(3):47-52.10 BORLINGHAUS J,ALBRECHT F,GRUHLKE M,et al.Allicin:chemistry and biological propertiesJ.Molecules,2014,19(8):12591-12618.11 杨琴,王凯悦,蒲前,等.白藜芦醇载药系统研究进展J.广东化工,2022,49(14):72-74,103.12 雷燕,李瀚林,曾凡坤,等.不同单一酸化剂及复合酸化剂体外98SILIAO GONGYE2023年第44卷第22期 总第691期宠物食品中以鲜肉替代肉粉对猫粮的适口性、消化率的影响 温超宇1 肖再利2 唐 超2 赵世元2 邓百川1*（1.华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642；2.佛山市雷米高动物营养保健科技有限公司，广东佛山 528143）摘 要：试验旨在研究在宠物食品中使用30%新鲜鸡肉替代鸡肉粉，以评估鲜肉对猫粮的适口性、营养物质消化率的影响。试验以45%鸡肉粉作为蛋白来源的猫粮为肉粉组，以30%鲜鸡肉等干物质含量替换鸡肉粉作为蛋白来源的猫粮为鲜肉+肉粉组。选择16只健康英国短毛猫进行饲养试验，首先进行为期2 d的适口性评价试验，之后随机分为2个组，每组8只猫，分别饲喂肉粉粮和鲜肉+肉粉粮，正试期30 d，测定采食量、粪便评分、表观消化率和血清生化指标。结果表明：与肉粉组相比，鲜肉+肉粉粮组显著提高了猫粮的适口性（P0.05）；鲜肉+肉粉组可显著提高猫对干物质、粗蛋白、粗纤维、有机物、钙和总磷的表观消化率（P0.05）；鲜肉+肉粉组不影响猫的体重、采食量、粪便评分和血清生化指标，表明猫维持在健康的机体状态。综上所述，猫粮中使用30%新鲜鸡肉替换鸡肉粉能够显著提高猫粮的适口性和营养物质的消化率，且保持机体健康。关键词：猫；猫粮；鲜肉；适口性；消化率doi:10.13302/ki.fi.2023.22.016中图分类号：S816 文献标识码：A 文章编号：1001-991X（2023）22-0099-05Effect of Fresh Meat Instead of Meat Meal in Diets on The Palatability,Nutrient Digestibilityof Diets for CatsWEN Chaoyu1 XIAO Zaili2 TANG Chao2 ZHAO Shiyuan2 DENG Baichuan1*(1.College of Animal Science of South China Agricultural University,Guangdong Guangzhou 510642,China;2.Ramical Pet Health Technology Co.,Ltd.,Guangdong Foshan 528143,China)Abstract：This study was conducted to evaluate the effects of fresh meat on palatability,nutrient digestibility of diets for cats by replacing chicken meal with 30%fresh chicken.In this study,45%chicken meal as protein source was taken as meat meal group,and replacing chicken meal with 30%fresh chicken(on a dry matter basis)as protein source was taken as fresh meat+meat meal 作者简介：温超宇，硕士，研究方向为宠物营养。*通讯作者：邓百川，副教授，硕士生导师。收稿日期：2023-06-12基金项目：国家自然科学基金32002186抑菌能力比较研究J.现代畜牧兽医,2021(7):28-31.13 李美发,陈作栋,梁欢,等.单一中草药以及复方中草药体外抑菌效果研究J.饲料工业,2019,40(12):22-26.14 徐欣欣,施平伟,张海文.蛙源抗菌肽Magainin 对畜禽常见病原菌抑菌活性与体外稳定性测定J.饲料工业,2018,39(20):34-39.15 陈聪,薛桥丽,胡永金,等.云南木姜子醇提物抑菌活性及其稳定性研究J/OL.食品工业科技:1-18.2023-08-11.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100111.16 古丽巴哈尔 托乎提,李海芳,贺金华,等.芩榆烧伤凝胶体外抑菌试验及杀菌曲线的测定J.药物分析杂志,2013,33(12):2047-2050.17 唐亮,刘翠艳,韩春杨,等.中药研究常用三种体外抑菌方法的比较J.中国中医药科技,2011,18(5):419-420.18 陈玉琪.微生物生长曲线中生长量测定方法的比较J.轻工科技,2020,36(4):7-8,12.19 唐茂妍,陈旭东.饲用苯甲酸的应用研究进展J.饲料博览,2017(10):15-17,26.20 张博,李军国,来光明,等.饲用酸化剂在家禽生产中的研究应用进展J.饲料工业,2023,44(9):45-51.21 SANSAWAT T,LEE H C,SINGH P,et al.Inhibition of Listeria monocytogenesin deli-style Turkey using hop acids,organic acids,and their combinationsJ.Poultry Science,2019,98(3):1539-1544.（编辑：沈桂宇，）99