不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测.pdf

202308期 总第401期非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起猪的一种高致病性、高死亡率、急性传染性疾病，世界动物卫生组织（OIE）将ASF列为法定报告动物疫病，该病也是各国重点防范的一类动物疫情。2018年8月辽宁省沈阳市出现国内首例非洲猪瘟疫情，随后蔓延至国内各地，2019年5月广西玉林市博白县发生非洲猪瘟疫情1。为有效阻断ASF疫情蔓延，广西壮族自治区农业农村厅相继下发文件，要求生猪定点屠宰企业（厂、场）建设非洲猪瘟PCR检测实验室，并对产地生猪及生猪产品采取“点对点”调运备案管理。屠宰企业是生猪调运的终点站，对不同产地待宰生猪进行采样检测有着重要意义，可有效检验不同产地生猪养殖场（户）对非洲猪瘟病毒防控是否到位，官方兽医产地检疫是否严谨等。本研究对玉林市福绵区某屠宰企业不同产地的待宰生猪采集全血样本进行荧光PCR检测。1材料与方法1.1主要仪器冰箱，可调移液器及吸头，1.5mL离心管，防护用品，高速台式离心机，荧光PCR仪及配套反应管等。1.2主要试剂非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，包含：阴性对照、阳性对照、样品稀释液、荧光PCR反应液。1.3样品采集非洲猪瘟病毒样品可从猪肉、猪血管、淋巴结、脾脏等部位采集。本次检测主要使用生猪全血作为样本，为提高检测效率。同一钟东1，宁广南2，牟礼乾1*，王永妮3，梁雄燕4，宋运福5（1.广西玉林市福绵镇水产畜牧兽医站，广西 玉林 537023；2.广西玉林市沙田镇水产畜牧兽医站，广西 玉林 537034；3.广西玉林市福绵区动物疫病预防控制中心，广西 玉林 537023；4.广西玉林市仁厚镇农业农村综合服务中心，广西 玉林 537012；5.广西玉林市成均镇水产畜牧兽医站，广西 玉林 537024）中图分类号：S851.43文献标识码：B文章编号：1001-8964（2023）08-0030-03收稿日期：2022-05-26作者简介：钟东（1993-），男，广西玉林市人，大学本科，助理兽医师，研究方向：水产畜牧、动物医学。E-mail：*通信作者：牟礼乾（1976-），男，广西玉林市人，大专，助理兽医师，研究方向：淡水养殖。E-mail：摘要：2019年广西玉林地区报告首例非洲猪瘟疫情，为探明当地防控政策措施实施以来对非洲猪瘟的阻断效果，本研究对辖区内某屠宰企业不同产地的待宰生猪采集全血制成混合血液样本，应用荧光PCR技术检测样本中是否含有非洲猪瘟病毒。检测结果得出均为阴性，说明当地有关政策的贯彻落实对防控非洲猪瘟起到了积极作用。关键词：不同产地；待宰生猪；非洲猪瘟病毒；荧光PCR试验研究不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测30202308期 总第401期来源地的生猪最多100头为1份混合血样2，使用无菌注射器抽取200 L生猪全血样本至1.5 mL无菌离心管中，待检。样本采集后应及时检测，未能及时检测的需保存于20冰箱中，样本保存期间应避免交叉污染。1.4检测方法1.4.1试剂准备实验前30 min从冰箱中取出试剂盒（试剂盒保存条件为20），待恢复至室内温度（1525）使试剂完全融化3。按照单反应体系配制方法，将试剂分装至PCR反应管中，拧紧反应管盖子，其余试剂返回冰箱20冷冻保存。1.4.2样本准备DNA提取：为避免DNA酶受到污染并保护操作者，进行下述操作时必须佩戴一次性手套和口罩。（1）待检样品份数要求为n份，则取n个无菌的1.5mL离心管，并对离心管编号。（2）离心管中加入样品稀释液80L。（3）离心管中分别加入已处理的待检样品20L，充分混匀，室温下放置2min。（4）离心机设置5 000 r/min离心1 min，取上清20 L即为待检DNA模板。提取好的DNA模板如不能立即检测的，建议放冰箱中20以下保存。1.4.3加样打开装有PCR反应液的反应管分别向其中加入已提取的样本模板（标记：A1、A2、A3），阳性对照（标记：C2），阴性对照（标记：C1）各2.5L，在记录本上记录加样顺序。将所有的反应管振荡混匀后以2000r/min离心10s，随即转到PCR扩增步骤。1.4.4PCR扩增启用荧光PCR仪预热并检验仪器性能。将准备好的PCR反应管放置于荧光PCR仪样品槽，并记录放置顺序。设置荧光PCR仪参数进行扩增。参数设置为：50 孵育 2 min；95 预变性2 min；95 变性5 s，60 退火延伸30 s，40个循环；在每一循环的60 时收集FAM通道采集荧光信号。2结果判定详见表1。类别检测样本检测样本检测样本Ct值353538或无Ct值PCR结果判定阳性，有非洲猪瘟病毒核酸可疑，应对样本做重复检测阴性，无非洲猪瘟病毒核酸表1Ct值结果判定3检测结果按上述操作流程，从2022年3月1日至3月10日开展实验检测，每日对生猪采集全血样本并作荧光PCR检测，检测样本数为3份（样本标记：A1、A2、A3），累计采集750头生猪全血样本。结果显示：生猪全血样本无Ct值，判定均为阴性，详细检测数据见表2。4结论PCR检测结果表明，在当地严格的防控要求下，不同产地的生猪均未检出非洲猪瘟阳性，证明非洲猪瘟疫情防控措施取得了积极效果。生猪养殖在产地、运输车辆、运输路径、屠宰销售等环节形成了健全的、可追溯的长效机制，最大限度地检测时间2022-03-012022-03-022022-03-032022-03-042022-03-052022-03-062022-03-072022-03-082022-03-092022-03-10检测通道FAMFAMFAMFAMFAMFAMFAMFAMFAMFAMA1C1A2C225.60526.34826.30925.69124.67625.27025.60626.27026.23124.965A3生猪产地福绵区桂平市博白县容县兴业县福绵区兴业县兴业县钦州市桂平市全血样本数（份）85756271827571807574全血PCR检测结果阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性表2PCR检测生猪全血样本Ct值试验研究（下转第33页）31202308期 总第401期1 mL，经12 000 r/min离心2 min，弃上清液，后续步骤参照细菌全基因组DNA提取试剂盒说明书操作，DNA于20保存备用。1.5细菌 16S rDNA 扩增及测序使用细菌16S rDNA通用引物（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3）进行PCR扩增，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳确认。引物由上海生工生物有限公司合成。1.6生化试验将平板上纯化的分离菌株接种于TSB培养基中，37 摇床培养24 h后，接种于葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、果糖、甘露糖、甘露醇、非甘露醇试管中，37培养24h，观察主要生化特性。1.7药敏试验测定分离菌株对10类28种抗生素的敏感性，抗生素包括：-内酰胺类（青霉素、阿莫西林），头孢菌素类（头孢曲松、头孢他啶、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮），氨基糖苷类（链霉素、庆大霉素、丁胺卡那、卡那霉素），大环内酯类（红霉素、麦迪霉素、克林霉素），多肽类（杆菌肽、多粘菌素B），四环素类（四环素、多西环素），喹诺酮类（恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星），磺胺类（磺胺异恶唑、复方新诺明），氯霉素类（氟苯尼考），林可酰胺类（克林霉素）。1.8系统进化树构建将测序获得的序列登录NCBI 网站，利用Blast 模块进行序列比对，利用Mega7.0软件构建进化树进行遗传进化分析。2结果2.1细菌的分离与培养将采集的2份样本接种于营养琼脂及 10%绵羊血平板中，37 培养ABCDA：颌下明显肿胀；B：穿刺流出脓液；C：脓肿溃烂；D：无菌采集脓汁图1发病羊群临床症状图2菌株在TSA固体培养基上的生长情况ABA：1号分离菌株；B：2号分离菌株图3菌株革兰氏染色镜检结果ABA：1号分离菌株；B：2号分离菌株试验研究降低了非洲猪瘟疫情对经济社会造成的不利影响。但受限于实验室设备及人手不足等因素，检测的样本较为单一，仅使用了生猪全血作为PCR检测样本，下一步将增加生猪样本采集部位，以进一步论证不同产地生猪养猪场（户）等在贯彻落实当地非洲猪瘟防控策略中的实际效果。参考文献：1 农民日报社.广西壮族自治区博白县发生非洲猪瘟疫情 N.农民日报（02版），2019-05-28.2 时文贤.生猪屠宰厂非洲猪瘟病毒PCR检测技术浅析 J.农民致富之友，2021（26）：149.3 马成立.荧光PCR检测技术对非洲猪瘟的常规监测 J.中国畜禽种业，2020，16（12）：53-54.（上接第31页）33