SN∕T 1197-2016 油菜中转基因成分检测 普通PCR和实时荧光PCR方法(出入境检验检疫).pdf

书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 代替 油菜中转基因成分检测普通犘犆犚和实时荧光犘犆犚方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犵 犲 狀 犲 狋 犻 犮 犪 犾 犾 狔犿狅 犱 犻 犳 犻 犲 犱犻 狀 犵 狉 犲 犱 犻 犲 狀 狋 狊犻 狀狅 犻 犾 狊 犲 犲 犱狉 犪 狆 犲犆狅 狀 狏 犲 狀 狋 犻 狅 狀 犪 犾犪 狀 犱狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿犲犘犆犚犿犲 狋 犺 狅 犱 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准替代 油菜籽中转基因成分定性检测方法 。本标准与 相比，主要技术性差异如下： 修改了标准的中文名称和英文名称； 增加了实时荧光检测方法； 增加了品系特异性检测方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：潘良文、李想、吕蓉、杨捷琳、刘月明、高琴。本标准所代替标准的历次版本发布情况为： 。犛犖犜 油菜中转基因成分检测普通犘犆犚和实时荧光犘犆犚方法范围本标准规定了油菜及其加工产品中转基因成分筛选、基因特异性和品系特异性普通和实时荧光检测方法。本标准适用于油菜及其加工产品中转基因成分筛选、基因特异性和品系特异性定性检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 转基因产品检测实验室技术要求 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法术语、定义和缩略语 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 转基因狋 狉 犪 狀 狊 犵 犲 狀 犲将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。 实时荧光犘犆犚狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿犲狆 狅 犾 狔犿犲 狉 犪 狊 犲犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个进程，荧光信号的强弱直接反映模板数量。 内源基因犲 狀 犱 狅 犵 犲 狀 狅 狌 狊犵 犲 狀 犲在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于判定物种特异性。 外源基因犲 狓 狅 犵 犲 狀 狅 狌 狊犵 犲 狀 犲利用生物工程技术转入的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。 犆 狋值犮 狔 犮 犾 犲狋 犺 狉 犲 狊 犺 狅 犾 犱每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。犛犖犜 缩略语：草丁（铵）膦乙酰转移酶基因（ ）： 犅犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊犪犿狔 犾 狅 犾 犻 狇 狌 犲 犳 犪 犮 犻 犲 狀 狊，来源于解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶基因： 犅犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊犪犿狔 犾 狅 犾 犻 狇 狌 犲 犳 犪 犮 犻 犲 狀 狊，来源于解淀粉芽孢杆菌的基因的特异抑制基因 ： ，碱基对： 犓犾 犲 犫 狊 犻 犲 犾 犾 犪狆狀 犲 狌犿狅 狀 犻 犪 犲狊 狌 犫 狊 狆犗狕 犪 犲 狀 犪 犲，来源于肺炎克雷伯杆菌臭鼻亚种的腈水解酶基因 ： ， 莽草酸 磷酸合成酶基因 ： ，油菜种子储藏蛋白基因： ，十六烷基三甲基溴化铵： ，脱氧腺苷三磷酸： ，脱氧胞苷三磷酸： ，脱氧鸟苷三磷酸： ，脱氧核糖核酸： ，脱氧核苷三磷酸： ，脱氧尿苷三磷酸： ，乙二胺四乙酸： ，草甘膦氧化还原酶基因： ，高移动性蛋白家族基因 ： ，新霉素 磷酸转移酶基因： 犅犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊犪犿狔 犾 狅 犾 犻 狇 狌 犲 犳 犪 犮 犻 犲 狀 狊，来源于解淀粉芽孢杆菌的草丁膦乙酰转移酶基因： ，聚合酶链式反应： ，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因： ，十二烷基磺酸钠 ： ，花椰菜花叶病毒 启动子 ： ，玄参花叶病毒 启动子： 来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子 ： 犖犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪狋 犪 犫 犪 犮 狌犿，来源于烟草的花蕊特异性 基因的发育调节启动子犜犪 狇：犜犪 狇 ，聚合酶： 、缓冲液： 犃犵 狉 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 狌犿狋 狌犿犲 犳 犪 犮 犻 犲 狀 狊，来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子 ： （ ） ，三（羟甲基）氨基甲烷： ，尿嘧啶 糖基酶酶： ，尿嘧啶 糖基化酶犛犖犜 方法提要提取样品后，通过普通或实时荧光技术对样品进行筛选基因或结构基因特异性片段扩增，根据扩增结果电泳图或实时荧光扩增曲线，判断该样品中是否含有转基因成分。对外源基因检测阳性的样品，或已知为转基因阳性的样品，如需进一步进行品系筛查和确证，则采用品系特异性普通或实时荧光，特异性扩增上述品系特异性片段，根据扩增结果（电泳图或实时荧光扩增曲线） ，判定该样品中含有哪（些）种转基因油菜品系成分。仪器设备 实时荧光仪。 普通仪。 样品粉碎仪或研磨机。 天平：感量 。 水浴锅或恒温孵育器。 冷冻离心机。 高压灭菌锅。 涡旋振荡器。 生物安全柜。 计。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 微量移液器（、 、 、 、 ）试剂和材料除特别说明外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合 中一级水的规格。 样品犇犖犃提取纯化试剂 ， ：称取 ，溶于 水中，搅拌，加入浓盐酸 ，冷却至室温，用稀盐酸准确调整至 ，分装后高压灭菌备用。 ， ：在 中加入 ，在磁力搅拌器剧烈搅拌，用调节溶液值至 （约需 颗粒） ，然后定容至，分装后高压灭菌备用。 抽提缓冲液：量取 ， ，称取 ， ，定容至，分装后高压灭菌备用。 饱和酚 氯仿 异丙醇 乙醇 缓冲液：量取 和 加水定容至，分装后高压灭菌备用。 蛋白酶（ ）犛犖犜 （ ） 普通犘犆犚反应试剂 缓冲液：含 ， （ ） ， ， 明胶。 ： 。 ：含 ，。 犜犪 狇酶：。 超纯水：无菌、无酶和酶污染的双蒸水。 引物：根据附录中的表 的序列进行合成引物，加超纯水配制成 储备液，用于扩增的引物浓度为 。 溴化乙锭： 。 分子量标记 。 琼脂糖。 缓冲液：称取 ，量取 冰醋酸， ，溶于蒸馏水中，定容至。分装后高压灭菌备用。 上样缓冲液：含 溴酚蓝， 二甲苯青， 甘油水溶液。 实时荧光犘犆犚反应试剂 实时荧光预混液：犜犪 狇聚合酶（） 、反应缓冲液、 （） 、 （含，）和酶按比例配制的溶液。 荧光校正试剂（ ） 。 引物和探针：根据附录中的表 的序列合成引物和探针，加超纯水配制成 储备液，用于实时荧光扩增的引物和探针浓度为 。检测步骤 取样按照 中规定的方法执行。 实验室环境要求按 规定的方法执行。 制样制样按 中规定的方法执行。在制样过程中，应采取有效措施防控制样器具和接触台面等对样品的污染。对经过制样的油菜籽或颗粒状油菜来源加工制品，称取约 代表性样品，经粉碎仪或研磨机进行碾磨至样品粉末颗粒约 左右大小。对粉末状油菜来源制品，可直接进行提取。 样品犇犖犃的提取与纯化 称取约 粉末状样品转入 离心管中，每个样品设置管取样平行。犛犖犜 加入 抽提缓冲液，混匀，注意不要使样品结块，再加入 抽提缓冲液，震荡 后，反复颠倒混合 。 离心 ，取上清 ，加入 （） ， 保温 。 加入等体积的 饱和酚，上下反复颠倒混匀共 。 离心 ，取上清液 ，加入等体积的氯仿，上下反复颠倒混匀共 。 离心 ，取上清液 ，加入等体积的异丙醇，轻轻混合 。 离心 ，此时管底有白色沉淀。 去上清，加入 乙醇清洗次次。 倒去 乙醇，短暂离心，用吸管尽可能除去乙醇洗液。低温冷冻干燥约 ，加 缓冲液（ ） ，溶解沉淀。注：也可按照 的方法或采用具有相同效果的植物基因组提取试剂盒进行提取。 犇犖犃浓度测定和定量取 样品溶液加双蒸水稀释至 ，使用紫外分光光度计分别测定 和 处的吸光值，并记录 比值以及样品浓度值， 的比值在 之间时，适于扩增。 普通犘犆犚检测 犘犆犚反应体系普通反应体系见表。表普通犘犆犚反应体系名称储液浓度终浓度使用量 缓冲液 （含） 犜犪 狇酶 酶 上游引物 下游引物 模板 超纯水补足至 注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。以对应的转基因油菜品系或含有相应外源基因的转基因油菜作为阳性对照，非转基因油菜样品作为阴性对照，以加入超纯水作为空白对照进行扩增。 犘犆犚反应循环参数反应循环参数为： ； ，引物的退火温度（见表 ） ， ， 个循环； 。反应循环参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。犛犖犜 犘犆犚产物的琼脂糖凝胶电泳检测将适量 稀释成溶液，配制溴化乙锭（或其他具有相同效果的荧光染料）含量为 的 琼脂糖凝胶。取 产物，加 上样缓冲液点样行电泳，并加分子量标记点样以判断产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在长度，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定，电泳检测结果用凝胶分析成像系统记录。 实时荧光犘犆犚检测 实时荧光犘犆犚反应体系实时荧光反应体系配制见表。每个样品设置个平行重复。表实时荧光犘犆犚检测体系名称储液浓度终浓度使用量 缓冲液 （含） 酶 上游引物 下游引物 探针 犜犪 狇酶 模板 超纯水补足至 注：）可选用含有缓冲液、 、和犜犪 狇酶等成分的基于 探针的实时荧光预混液进行实时荧光扩增。）荧光试剂仅在具有校正通道的实时荧光仪上进行扩增时添加，否则用超纯水补足。）反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。 实时荧光犘犆犚反应程序两步法实时荧光反应参数为： ； ； ， ， 个循环。三步法实时荧光反应参数为： ； ； ， ， ， 个循环。注：以上参数可根据不同型号实时荧光仪和所选扩增体系不同作适当调整。 仪器检测通道的选择设置反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。犛犖犜 实验对照的设立每个样品应有个平行实验，同时每次检测应设立个对照： 阳性对照，为对应的转基因油菜品系或含有相应外源基因的转基因油菜基因组，或含有上述片段的质粒标准分子； 阴性对照，非转基因油菜样品； 空白对照（不含模板） 。质量控制检测的所有对照应满足以下条件，如有任何一条不满足时，实验应视为无效：）空白对照和空白提取对照：普通扩增中无目的条带，实时荧光扩增中无荧光对数增长，相应的犆 狋值 。）阴性对照：用外源基因和品系特异性检测体系扩增，普通扩增中无目的条带，实时荧光扩增中无荧光对数增长，相应的犆 狋值 。）阳性对照：普通扩增中有较亮的目的条带，实时荧光扩增中有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线。结果判定及表述 结果判定 普通犘犆犚扩增结果判定用油菜内源基因扩增体系对提取的溶液进行测试，在符合第章所述的情况下，如在普通扩增中未见有明亮的目的条带，则说明在提取过程中未提取到可进行测试的，或提取液中有抑制反应的物质存在，应重新提取。对油菜及其来源样品中转基因成分的检测，可参考附录的内容进行筛选检测或品系特异性检测。在符合第章所述的情况下，对被检样品进行检测时：测试样品出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小见表 ） ，则可初步判断含有该外源基因或品系，可进一步做实时荧光或序列测定等确证实验，然后依据确证实验结果最终报告。如果测试样品中未出现扩增产物，则可判定测试样品中不含有该外源基因或品系。 实时荧光犘犆犚结果判定对油菜及其来源样品中转基因成分的检测，可参考附录的内容进行筛选检测或品系特异性检测。在符合第章所述的情况下，对被检样品进行检测时：）检测的外源基因或品系犆 狋值 ，内源基因出现正常扩增，则可判定该样品不含所检外源基因或品系。）检测的外源基因或品系犆 狋值 ，内源基因出现正常扩增，则可判定该样品含有所检外源基因或品系。）检测的外源基因或晶系犆 狋值在 之间，应调整模板浓度，应重新进行实时荧光扩增。如再次扩增后外源基因或品系犆 狋值仍为 ，则可判定为该样品含有所检基因或品犛犖犜 系；如再次扩增后犆 狋值 ，则可判定为该样品不含所检外源基因或品系。 结果表述结果为阳性的，表述为“检出外源基因或转基因品系” ；结果为阴性的，表述为“未检出外源基因或转基因品系” 。 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照 和 中的规定执行。 最低检出限各基因片段的普通和实时荧光扩增的最低检出限分别见附录表 和表 。犛犖犜 附录犃（规范性附录）油菜中转基因成分筛选、基因和品系特异性普通犘犆犚和实时荧光犘犆犚方法油菜转基因成分检测普通检测引物见表 。表犃 油菜转基因成分检测普通犘犆犚检测引物基因品系名称引物序列扩增片段长度 退火温度提示检测下限（质量分数） 内源基因 筛选检测 筛选检测 筛选检测 筛选检测 筛选检测 筛选检测 抗草甘膦油菜 （ ） 抗草甘膦油菜 抗草丁膦及雄性不育油菜 抗草丁膦油菜，选择其一 抗草丁膦及雄性不育油菜 抗草丁膦及雄性不育油菜 抗溴苯腈除草剂油菜 （ ）品系 （ ）品系 品系 品系 犛犖犜 表犃 （续）基因品系名称引物序列扩增片段长度 退火温度提示检测下限（质量分数） 品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 （ ）品系 （ ）品系 （ ）品系 （ ）品系 油菜转基因成分检测实时荧光检测引物和探针见表 。表犃 油菜转基因成分检测实时荧光犘犆犚检测引物和探针基因品系名称引物序列探针序列扩增片段长度 提示检测下限（质量分数） 油菜内源基因 筛选检测 筛选检测 筛选检测 筛选检测 筛选检测 筛选检测 筛选检测 （ ） 筛选检测 犛犖犜 表（续）基因品系名称引物序列探针序列扩增片段长度 提示检测下限（质量分数） （ ）品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 品系 （ ）品系 （ ）品系 （ ）品系 （ ）品系 品系 品系 品系 品系 注：除特别指定外，一般情况下，标记，标记或。也可根据实际情况选择报告基团和淬灭基因。 犛犖犜 书 书 书附录犅（资料性附录）转基因油菜品系包含外源基因和调控元件信息转基因油菜品系包含外源基因及调控元件见表 。表犅 转基因油菜品系包含外源基因及调控元件列表品系名称研发单位基因或调控元件名称 （ ）孟山都公司 （ ）孟山都公司 （ ）孟山都公司 拜尔作物科学公司 孟山都公司 （ ）拜尔作物科学公司 拜尔作物科学公司 安万特作物科学公司 ， 拜尔作物科学公司 拜尔作物科学公司 拜尔作物科学公司 拜尔作物科学公司 拜尔作物科学公司 犛犖犜 书 书 书表犅 （续）品系名称研发单位基因或调控元件名称 （ ）孟山都公司 （ ）拜尔作物科学公司 （ ）拜尔作物科学公司 ， ， 佛罗里达大学 拜尔作物科学公司 拜尔作物科学公司 先锋国际良种公司 先锋国际良种公司 犛犖犜