Hsa-miR-145靶向复制蛋白A1对胃癌细胞增殖的影响.pdf

917第 11 期第 53 卷2023-01-11温州市基础性科研项目（Y20210189）。陈健，住院医师，Email：。俞耀军，副教授，Email：。收稿日期：基金项目：作者简介：通信作者：Hsa-miR-145靶向复制蛋白A1对胃癌细胞增殖的影响陈健1，李利义1，诸葛林敏1，马香爱2，朱岳升3，俞耀军1温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江温州325027，1.胃肠外科；2.手术室；3.消化内科摘 要 目的：探讨胃癌细胞中靶向复制蛋白A1（RPA1）基因的miRNA对肿瘤恶性生物学行为的影响及其机制。方法：采用生物信息学分析法比较癌与癌旁组织中RPA1基因的表达及其与胃癌患者预后的相关性；采用RNApulldown法在胃癌细胞（SGC-7901）中检测靶向RPA1基因3UTR区的miRNA；构建miR-145高表达的胃癌SGC-7901细胞，采用MTT法检测细胞增殖情况，采用流式细胞术分析细胞周期时相；采用双荧光素酶实验验证miR-145与RPA1的靶向关系，Westernblot法进一步证实miR-145和RPA1的靶向关系。结果：相比于癌旁组织，RPA1基因在胃癌组织中表达显著上调（P0.05），并且RPA1基因在胃癌组织中的高表达与患者更差的预后相关。RNApulldown回收并检测胃癌细胞SGC-7901中靶向RPA1基因3UTR区的miRNA，结果发现miR-145和RPA1基因3UTR区的结合最高。荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-145组荧光素酶活性相比于对照miRNA组显著降低（P0.05）；Westernblot检测结果显示，与转染对照miRNA组比较，miR-145组RPA1表达显著下降（P0.05）。MTT结果显示miR-145组胃癌细胞增殖能力较对照miRNA组低（P0.05）；流式细胞术检测结果显示miR-45组胃癌细胞G2/M期阻滞增加（P0.05）。结论：miR-145高表达可显著抑制胃癌细胞的增殖，这一作用可能与下调RPA1表达，阻滞细胞周期有关。关键词 胃肿瘤；微小RNA-145；复制蛋白A1；细胞增殖；细胞周期中图分类号R735.2 DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2023.11.009Effect of Hsa-miR-145 targeting replication protein A1 on proliferation of gastric cancer CHEN Jian1,LI Liyi1,ZHUGE Linmin1,MA Xiangai2,ZHU Yuesheng3,YU Yaojun1.1.Department of Gastrointestinal Surgery,the Second Affiliated Hospital&Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China;2.Department of Operating Room,the Second Affiliated Hospital&Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China;3.Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital&Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China Abstract:Objective:To investigate the effect of miRNA targeting replication protein A1(RPA1)gene in gastric cancer cells on tumor malignant biological behavior and its mechanism.Methods:Bioinformatics analysis was used to compare the expression of RPA1 gene in cancer and adjacent tissues and its correlation with the prognosis of gastric cancer patients.RNA pulldown method was used to detect the miRNA targeting the 3UTR region of RPA1 gene in gastric cancer cells(SGC-7901);SGC-7901 cells with high expression of miR-145 were constructed.Cell proliferation was detected by MTT staining,and cell cycle phase was analyzed by flow cytometry;The targeting relationship between miR-145 and RPA1 was verified by luciferase experiment,which was further confirmed by Western blot.Results:Compared with the adjacent tissues,the expression of RPA1 gene was significantly up-regulated in gastric cancer tissues.The high expression of RPA1 gene in gastric cancer tissues was associated with worse prognosis of patients.RNA pulldown was used to detect miRNA targeting the 3UTR region of RPA1 gene in gastric cancer cell SGC-7901.The results showed that miR-145 had the highest binding with the 3UTR region of RPA1 gene.Then,miR-145 was selected for further research.The results of luciferase reporter gene experiment showed that the luciferase activity was lower than that in the control miRNA group(P0.05);the Western blot results showed that the expression of RPA1 in gastric cancer cells in miR-145 本文引用：陈健,李利义,诸葛林敏,等.Hsa-miR-145靶向复制蛋白A1对胃 癌细胞增殖的影响J.温州医科大学学报,2023,53(11):917-922.消化道肿瘤的筛查与诊治论著Vol.53 No.11Nov.2023第53卷第11期2023年11月温 州 医 科 大 学 学 报Journal of Wenzhou Medical University918第 53 卷温 州 医 科 大 学 学 报第 11 期group was lower than that in the control miRNA group(P0.05).MTT results showed that the proliferation ability of gastric cancer cells in miR-145 group was lower than that in control miRNA group(P0.05);Flow cytometry showed that the G2/M phase arrest of gastric cancer cells in miR-45 group increased(P0.05).Conclusion:The overexpression of miR-145 can significantly inhibit the proliferation of gastric cancer cell SGC-7901,and its mechanism may be related to down-regulation of RPA1 expression which blocks the cell cycle.Key words:stomach neoplasms;micro RNA-145;replication protein A1;cell proliferation;cell cycle胃癌是恶性肿瘤死亡的第四大原因，尽管目前临床上进行的化疗、放疗、手术治疗以及一些分子靶向治疗能够显著延长胃癌患者的生存期，但其5年生存率依然很低1，因此，进一步研究胃癌发生的分子机制，寻找胃癌患者新的治疗靶点并采取针对性的治疗策略具有重要的意义2。复制蛋白A1（replicationproteinA1,RPA1）是三聚体复制蛋白A的最大亚基，在真核细胞DNA复制、同源重组和切除修复中起核心作用，其在食管癌、结肠癌、尿路上皮癌等多种癌症中均被扩增3-5。有研究发现，RPA1在胃癌中呈现高表达，与患者的临床特征、预后之间存在相关性6，但是，具体机制尚不清楚。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类小分子非编码单链RNA，在转录后水平抑制靶mRNA的翻译或降解mRNA，参与调控细胞的增殖、分化和凋亡等。研究显示，miR-30a在胃癌和卵巢癌细胞中通过靶向调控RPA1基因的表达进而抑制细胞增殖7，但miRNA与RPA1在胃癌中的相互作用尚不明确，因此，本研究在胃癌细胞中通过RNApulldown技术探究了RPA1结合的miRNA，结果发现miR-145在胃癌细胞中靶向结合并调控RPA1基因的表达，进而抑制胃癌细胞的增殖。1 材料和方法1.1 细胞和主要试剂 胃癌SGC-7901细胞（中科院细胞库），FBS、RPMI1640培养基（美国Gibco公司），胰蛋白酶、脂质体2000、TRIzol试剂（美国Invitrogen公司），miRNA分离试剂盒（美国Ambion公司），All-in-OnemiRNAqRT-PCR检测试剂盒（美国GeneCopoeia公司），has-miR-145模拟物、miRNA对照物（上海吉玛制药技术有限公司），生物素标记的RNApulldown探针（生工生物工程（上海）股份有限公司），RNApulldown试剂盒（上海泽恒生物科技有限公司），RPA1抗体（美国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记兔抗鼠二抗（美国CST公司），双荧光素酶活性检测试剂盒（美国Promega公司），包含RPA1基因3-非翻译区（3UTR）荧光素酶报告载体由上海吉凯基因公司包装合成。1.2 RNApulldown回收实验 使用RNApulldown试剂盒进行RNA回收实验，参照文献8并做稍加修改。使用的探针列于表1。将对数生长期的SGC-7901细胞接种于培养皿中，待细胞生长密度达80%时分为两组，即RPA1探针回收组和对照探针回收组。首先用甲醛对细胞进行交联，加甘氨酸缓冲液进行平衡，加裂解液收集细胞。细胞样品经超声处理后离心。上清液移入2mL离心管中。细胞裂解液用生物素标记的RPA1探针或对照探针旋转孵育3h。然后再加入链霉亲和素磁珠旋转孵育1h。清洗磁珠3次。随后进行解交联处理，然后加TRIzol纯化RNA。使用All-in-OnemiRNAqRT-PCR检测试剂盒，检测纯化的miRNA。1.3 细胞增殖能力检测 SGC-7901细胞增殖活性检测采用MTT法。细胞在含10%FBS的RPMI1640培养基中，置于37、50mL/LCO2的培养箱中培养。共分为3组：空白对照组（PBS组）、对照miRNA组（转染表1 RNApulldown探针探针名称探针序列（5-3）RPA1-1GGGATCGTCACACGGAGGTGRPA1-2AATGAAATTGACAGAAGCCTRPA1-3GAATTCTAGGAAGACACACTRPA1-4GGGACGGCAAGTCAATGCTTRPA1-5ATACTGTTTATTAAAACAAARPA1-6TAGTGTTTTCATGCTTTGAARPA1-7ATAATTAATATGATTAGGAARPA1-8GCTGGCCCCTATGTCAACGGRPA1-9ATGCTTTATAAGCAAGGTCARPA1-10CAGCGTTCCCTGGACACGTCRPA1-11AAATCTCTGAAAAGCCCAACRPA1-12GAGACTGGAGGGAATTCAAGRPA1-13ATCAATAGTATTTATACTTTRPA1-14CCTTCTAACAGGTGAAAAGARPA1-15TTTGAATAAGTGAAAATTAAControlTTCTCCGAACGTGTCACGTA919第 11 期第 53 卷miRNA对照模拟物）和miR-145组（转染has-miR-145模拟物）。取各组转染后的细胞，以2.5104/mL的浓度，每孔200L接种于96孔板中，每组设3个复孔。分别培养24、48、72h后，加入5g/L的MTT溶液20L。继续孵育4h后，弃去上清液。然后每孔加入150L的二甲基亚砜，充分振荡溶解结晶紫，混匀后用酶标仪于490nm处测定OD值。实验重复3次。1.4 细胞周期检测 按上述1.3分组和准备细胞，用胰蛋白酶消化各组细胞，吹打使其充分变匀，制备成单细胞悬液离心，收集到流式专用管中，离心并去上清液，PBS液进行重悬，移入离心管内，加入无水乙醇，在-20温度固定24h以上；细胞固定好以后，离心，去掉上清液，使用PBS洗涤沉淀若干次，用lmg/mL的RNaseA溶液消化细胞内的RNA；用PI溶液避光环境下染核10min；最后用流式细胞仪分析3组细胞细胞周期百分比。1.5 Westernblot法检测RPA1蛋白的表达 按上述1.3分组和准备细胞，收集各组细胞，PBS冲洗后，加入裂解液冰上裂解30min，超声破碎细胞，低温离心后取上清液加样，经电泳蛋白分离和转膜，50g/L脱脂奶粉封闭30min。用RPA1（1:1 000稀释）一抗孵育，4过夜，TBST洗膜3次，每次5min。加兔抗鼠二抗常温下孵育1h，TBST洗膜3次，每次5min。凝胶成像系统显色曝光，QuantityOne进行灰度测量分析。1.6 双荧光素酶报告基因检测 PCR扩增RPA1基因3UTR，构建包含RPA13UTR的质粒（pMIR-RPA1）和不包含RPA13UTR的对照质粒（pMIR）。调整胃癌SGC-7901细胞浓度为2.5105个/mL，每孔2mL接种于6孔板中。待细胞融合至60%时，分别共转染pMIR-RPA1与miR-145模拟物或miRNA对照模拟物、pMIR与miR-145模拟物或miRNA对照模拟物。转染12h后，更换培养基，继续培养24h，收集细胞。参照试剂盒说明书，检测荧光素酶活性。1.7 生物信息学分析 收集TCGA数据库375例胃癌组织及32例正常胃黏膜组织的RNA测序数据，比较两种组织中RPA1基因表达量log2（TPM+1）的差别。生存分析由在线分析工具Kaplan-Meierplotter（http:/ 统计学处理方法 采用GraphPadPrism6统计软件进行分析。计量资料以 s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 RPA1基因在胃癌组织中显著高表达 生物信息学分析结果显示，相比较于正常胃黏膜组织（n=32），肿瘤组织（n=375）中RPA1基因的表达量显著升高（P0.05），见图1。2.2 RPA1基因在胃癌组织中高表达与患者较差的预后相关 根据胃癌组织中RPA1基因表达量的高低对TCGA数据库中的胃癌患者进行了分组，并比较了其生存情况，结果显示，RPA1基因高表达组（n=459）的预后显著差于低表达组（n=172），HR=1.72（1.322.25，P0.01）。见图2。2.3 miR-145靶向结合RPA1基因3UTR区 为了明确胃癌细胞中结合RPA1基因的miRNA，本研究设计了靶向RPA1基因3UTR区的探针，进行了RNApulldown回收，并对回收到的miRNA进行了qRT-PCR检测，结果发现，miR-145在胃癌细胞中和RPA1基因3UTR区结合最高（见图3）。2.4 miR-145在胃癌细胞中抑制RPA1基因的表达 为了验证miR-145在胃癌细胞中是否能调控RPA1基因的表达，本研究进行了荧光素酶报告基因检测和Westernblot检测。荧光素酶相对活性分析结果显示，miR-145组相比于对照miRNA组显著降低（P0.05，见图4A、图4B）。Westernblot检测结果显示，图1 RPA1基因在胃癌肿瘤组织及正常胃黏膜组织中的表达比较（aP0.05）肿瘤组织相对表达量正常胃黏膜组织8a6420图2 RPA1基因表达与胃癌患者预后的相关性生存时间(月)累积生存率(%)50010010050150高表达组低表达组陈健，等：Hsa-miR-145靶向复制蛋白A1对胃癌细胞增殖的影响920第 53 卷温 州 医 科 大 学 学 报第 11 期与转染对照miRNA组比较，miR-145组RPA1表达显著下降（P0.05，见图4C、图4D）。2.5 miR-145抑制胃癌细胞增殖 MTT实验结果表明，胃癌细胞转入miR-145后72h，细胞增殖显著降低（P0.05），见图5。2.6 miR-145阻滞胃癌细胞周期 流式细胞术结果显示，胃癌细胞转染miR-145后，细胞阻滞在G2/M期（P0.05），见图6。3 讨论胃癌是消化道常见恶性肿瘤，全球每年约有85万新增胃癌病例，65万例死亡病例9。尽管进行相对表达(RPA1探针/对照探针)miR-145200150100500miR-30amiR-20bmiR-142-5pmiR-193amiR-1miR-15amiR-92bmiR-150miR-128miR-133a图3 采用RNApulldown法在胃癌细胞中回收并分析靶向结合RPA1基因3UTR区的miRNAA：包含和不包含RPA1基因3UTR区的荧光报告基因表达载体示意图；B：荧光素酶报告基因验证miR-145和RPA1基因3UTR区的结合；C：Westernblot检测胃癌细胞中miR-145对RPA1基因表达的影响；D：Westernblot统计学分析结果。aP0.05图4 胃癌细胞中检测miR-145对RPA1基因的靶向和调控作用了大量的临床和基础研究，但人们对它仍然知之甚少。致癌基因蛋白表达、幽门螺杆菌感染、饮食因素、吸烟、饮酒、肥胖等因素均与胃癌的发生发展相关10-11。尽管在早期发现、治疗和预防方面取得了进步，但晚期胃癌仍然是不可治愈的，其5年生存率仅为4%5%12。无限制的癌细胞增殖是肿瘤发生的原因13。为了找到治疗癌症的方法，人们已经在努力寻找抑制恶性细胞增殖的方法。有丝分裂是真核细胞增殖的主要途径，在这个过程中，DNA被复制，然后将细胞的遗传物质传递到下一代细胞中。任何DNA复制的缺陷或DNA损伤都会触发一个检查点，延迟细胞周期的进程，并促进DNA修复。如果错误无法恢复，细胞将启动死亡程序以消除危害14。RPA1基因在DNA复制中起关键作用。它帮助解开双链DNA，招募聚合酶将核苷三磷酸结合到新合成的DNA链中，并保持基因组的完整性15-16。RPA1缺陷会引起自发的DNA损伤，诱导DNA复制检查点，从而抑制有丝分裂或启动细胞死亡15，17。研究发现RPA1基因与肿瘤的发生发展密切相关。RPA1可以通过CDK4/Cyclin-D通路促进肝细胞癌增殖19。沉默RPA1可增强结直肠恶性肿瘤细胞对5-Fu的敏感性19。RPA1表达的下调可通过阻断RAD51的DNA损伤位点增强鼻咽癌相对表达量(RPA1/Actin)荧光素酶相对活性PBS组对照miRNA组 miR-145组PBS组对照miRNA组miR-145组00pMIR质粒pMIR-RPA1质粒0.50.51.01.01.51.5pMIR质粒pMIR-RPA1质粒RPA1基因3UTRACBDaaPBS组对照miRNA组miR-145组ActinRPA1921第 11 期第 53 卷的放疗敏感性20。本研究发现，与正常胃黏膜比较，胃癌组织中RPA1基因的表达显著上调，且RPA1的高表达与患者较低的累积生存率相关，提示RPA1在胃癌的发生发展过程中起着重要的作用，因此，RPA1可能可以成为胃癌治疗的潜在靶点。已有研究表明RPA1可通过各种转录后修饰如泛素化、巴豆酰化调节其功能21-22。然而，目前对于RPA1的表达调控的研究却鲜有报道。研究显示，miR-30a在胃癌和卵巢癌细胞中通过靶向调控RPA1基因的表达进而抑制细胞增殖7，但是否还有其他miRNA在胃癌细胞中参与RPA1基因的表达调控还不清楚。miRNA是一种长度约为22nt的单链小RNA，进化高度保守，可参与细胞生长、分化、凋亡和血管生成等多种重要的生物学过程。有研究发现，miRNA可以通过与靶mRNA的3-UTR结合而影响靶基因mRNA的转录后翻译23。本研究采用RNApulldown技术全面分析了靶向RPA1基因3-UTR的miRNA，结果发现多种miRNA包括miR-30a结合RPA1基因3-UTR区域，但miR-30a并不是结合最多的miRNA，miR-145在RPA1基因3-UTR区结合最高。A：流式细胞术检测结果；B：统计结果。aP0.05图6 流式细胞术检测miR-145对胃癌细胞细胞周期的影响细胞含量(%)细胞含量PBS组PE-APE-A对照miRNA组miR-145组PBS组对照miRNA组miR-145组020406080A2004003503503003002502502002001501501001005050001501005050100150200250(1 000)50100150200250(1 000)50100150200250(1 000)0BaaG1期S期G2/M期aP0.05图5 MTT检测miR-145对胃癌细胞增殖的影响OD49024 h48 h72 hPBS组对照miRNA组miR-145组1.00.80.60.40.20amiR-145是一种抑癌miRNA，可通过对多种靶基因的调控抑制肠癌、食管癌等肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，参与肿瘤的发生发展调控24-25。XU等26发现miR-145通过靶向（mTOR）/p70S6K1信号通路抑制结肠癌患者肿瘤细胞生长和血管生成。WANG等27发现miR-145通过靶向AEG-I/MTDH信号通路抑制非小细胞肺癌患者肿瘤细胞侵袭和转移。也有研究发现，miR-145在胃癌肿瘤组织内的表达明显下调22，miR-145通过靶向IRS-I/-actin信号通路抑制胃癌细胞的增殖28，通过靶向Six1基因抑制胃癌细胞侵袭、血管形成及上皮间质转化29。本研究结果显示，在胃癌细胞中miR-145可以抑制RPA1基因的表达，且将miR-145转入胃癌细胞会通过抑制RPA1基因的表达抑制细胞的增殖，miR-145对胃癌细胞增殖的抑制是通过阻滞细胞周期获得的。综上所述，本研究发现miR-145可以通过靶向下调RPA1的表达而阻滞胃癌细胞周期并抑制细胞增殖，这可能为胃癌的治疗提供一个新靶点。但是，本研究仅用了SGC-7901细胞，未来尚需在不同的胃癌细胞系进行实验验证，并进一步探讨miR-145在RPA1基因3UTR区的具体结合位点。陈健，等：Hsa-miR-145靶向复制蛋白A1对胃癌细胞增殖的影响922第 53 卷温 州 医 科 大 学 学 报第 11 期参考文献1 SUNG H,FERLAY J,SIEGEL R L,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countriesJ.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.2 RAY K.New markers and models of premalignancy and the early development of gastric cancerJ.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2020,17(4):193.3 ZHANG D J,XIANG J,WANG X,et al.RPA1 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