HER2阳性乳腺癌中p95HER2表达与细胞增殖的相关性研究.pdf

论著 阳性乳腺癌中 表达与细胞增殖的相关性研究吴旸，张薇，董丽平，徐迪，邓飞，唐金海基金项目：国家自然科学基金青年项目（）作者单位：江苏 南京，南京医科大学第一附属医院 生物样本库（吴旸，董丽平）；江苏南京，南京医科大学第一附属医院 普外科（张薇，徐迪，唐金海）；江苏 南京，南京市浦口人民医院普外科（邓飞）第一作者：吴旸，男，博士，副研究员，研究方向：肿瘤治疗靶点与标志物的发掘，：通信作者：唐金海，男，博士，教授，主任医师，研究方向：乳腺癌的临床与基础，：【摘要】目的 通过检测并分析 阳性乳腺癌患者肿瘤组织中 的表达情况，探索其与相关临床及病理特征之间的关系，建立 过表达细胞验证其促进细胞增殖的生物学功能，为临床 阳性乳腺治疗提供实验基础。方法 收集 年 月至 年 月就诊于江苏省人民医院普外科的 例 阳性乳腺癌患者的肿瘤组织及其临床资料。通过免疫组化法检测肿瘤组织中 蛋白的表达水平，比较 阳性组及阴性组的临床病理及检验资料的组间差异。通过 慢病毒质粒表达载体转染 细胞，构建 和 方法验证的 蛋白稳定表达的 细胞株。以 细胞株为模型，经过 和克隆形成试验验证考察 蛋白表达对细胞曲妥珠单抗的敏感性及其对细胞增殖的影响。结果 例 阳性乳腺癌患者肿瘤组织中，的阳性率为 （）。蛋白的表达情况与患者肿瘤的 指标相关，差异有统计学意义（）；而 表达情况与患者的不同年龄、肿瘤大小、是否伴腋窝淋巴结转移、病理分级、雌激素受体状态比较，差异无统计学意义（）。在血液学分析中，蛋白的表达与患者的血清、相关，且差异有统计学意义（）。经过 慢病毒质粒表达载体转染的 细胞，可以稳定表达 蛋白，细胞在 曲妥珠单抗药物的作用下，较 细胞在增殖上差异有统计学意义，克隆形成也显示出相同的趋势（）。结论 在 阳性乳腺癌且 蛋白表达的患者肿瘤组织中，增殖指数上升，肿瘤细胞增殖能力提高，提示 的表达提高了肿瘤细胞对曲妥珠单抗治疗的内在抗性。同时，基因不因其表达在细胞外蛋白的截短而丢失 蛋白促肿瘤细胞增殖的生物学功能。【关键词】；阳性乳腺癌；曲妥珠单抗；细胞增殖：文章编号：（），（，fi ，；，；，）：，：【】，中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，（），（），（），（），（），【】；癌症是威胁人类健康的一大重要因素，约的乳腺癌患者存在人类表皮生长因子受体（，）过表达，此类患者更易发生肿瘤复发转移，预后较差。鉴于其在乳腺癌、胃癌和胃食管交界处癌、结直肠癌、胆道癌、非小细胞肺癌和膀胱癌等多种癌症中扩增或过表达。当前已经开发出多种靶向 的治疗方法，并在乳腺癌和胃癌中显示出疗效，。其中，曲妥珠单抗（）为全球批准的第一个针对 过表达乳腺癌的人源化单克隆抗体，它可与 的细胞外结构域相结合，从而抑制肿瘤细胞生长。由于 在一些重要器官如肝、肺和心脏中也有弱至中度表达，可能会产生不良反应，因此限制了给药剂量，从而使乳腺癌患者对 治疗不敏感或逐渐发生耐药。阳性乳腺癌患者 耐药有多种形式，其中肿瘤细胞表面 蛋白结构形态的改变能够导致 阳性肿瘤细胞对 抵抗。而人表皮生长因子受体 突变蛋白（，）是 受体的缩短形态，缺少 结合位点但仍具有酶活性，可以作为接受 治疗的 阳性转移性乳腺癌患者不良预后标志（图）。的表达与全长 表达正相关，大约的 阳性肿瘤表达，。既往研究表明，表达是一个独立的预后因素，高水平的 与预后较差相关。在促进肿瘤进展和转移方面比全长 更具侵袭性，并且被认为与 耐受密切相关。与 不同，在 阳性的正常组织中不表达，这使得 成为一个值得研究的 阳 性 肿 瘤 亚 群 的 肿 瘤 特 异 性 抗 原，。的表达提示曲妥珠单抗治疗 阳性乳腺癌存在一定的肿瘤抗性的现象，已被广泛接受。而 除了在肿瘤耐药方面的价值外，是否与肿瘤的其他生物学行为如增殖、转移等有关系，尚未被充分研究。本文旨在探讨 的表达情况与临床病理之间的相关性，探索其在肿瘤增殖中可能发挥的作用。中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，材料和方法 患者入组调取江苏省人民医院生物样本库保藏的 年 月至 年 月由普外科切除的、经 位病理医师确诊的 例乳腺癌 阳性患者标本，患者均为女性；年龄 岁，中位年龄 岁，纳入标准为 且病理 确定或，排除标准为 或。患者使用 方案治疗 周后或直接手术治疗，收集患者肿瘤组织样本及首次入院前后的生化及血常规数据。研究经本院医学伦理委员会批准通过，患者及家属签署知情同意书。实验资料人乳腺导管癌细胞（）购于中国科学院细胞库，培养条件为含 胎牛血清的 培养基，二氧化碳，下培养。过表达慢病毒载体购于南京晶麦生物科技公司，培养基购于南京凯基生物公司，胎牛血清（）购于南京维森特生物公司。抗 抗体，购于（上海）公司，货号为，抗兔二抗购于武汉 生物公司和 中国公司，货号为，。显色试剂盒等购于碧云天生物科技公司。组织样本获取及免疫组化染色取乳腺癌手术切除组织，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，乙醇和 过氧化氢封闭，去除内源性过氧化物酶后于室温下 孵育 ，磷酸盐缓冲液（，）冲洗 次，煮沸抗原修复，加入枸橼酸缓冲液中煮沸 ，取出至室温冷却，冲洗，封闭 ，顺序一抗和二抗孵育，冲洗 次，二氨基联苯胺法染色（，），苏木精复染，乙醇脱水至二甲苯透明，干燥后树脂封片。为对照，染色标准判断以肿瘤细胞膜着色为基准，统计 个高倍视野（）下免疫组化染色细胞。染色面积，着色范围为 分，着色范围为 分，着色范围为 分，着色范围为 分，着色范围为 分。染色强度，无色 分，弱染色 分，中染色 分，强染色 分。以两种积分之和 分为阴性，分为弱阳性（），分为阳性（），分为强阳性（）。对 的判断标准，判断为 低表达，为 高表达。染色玻片分别按照美国临床肿瘤学会 美国病理学家学会（）年发布和更新的乳腺癌检测指南进行解读。稳定表达细胞株的构建取处于对数生长期的 细胞，消化计数并以 个细胞每 孔 种 入 孔 板 中，培 养 过 夜 待 转 染。取 慢病毒质粒载体，以 值为 与聚凝胺（）混合孵育 后，加入到 培养基中，使 终浓度达到 。将含 慢病毒质粒载体的 培养基加入 细胞中，共孵育 后，更换新鲜 培养基。细胞继续培养 后，向 孔板的每孔中加入终浓度为 的嘌呤霉素与细胞共同孵育，待显微镜下观察到未转染慢病毒质粒载体的空白 细胞组全部死亡后，更换不含嘌呤霉素的 培养基继续培养细胞得 稳定表达的 细胞株（）。细胞株的 的 与蛋白表达检测 取对数生长期的 细胞，消化细胞后离心倾倒干净离心管中液体，将含有细胞的离心管置于冰上，加入 总 抽提试剂（）溶液充分 裂 解 细 胞，细 胞 裂 解 完 成 后 于 下 离心 ，将上清转移至新离心管中并加入 氯仿，涡旋震荡溶液后 下 离心，将上层液体转移至新离心管中并加入等体积的异丙醇，涡旋震荡溶液后 下 离心 ，弃上清向离心管中加入 乙醇，下 离心 ，弃上清室温下晾干沉淀后加入 无酶水溶解沉淀并测定总 含量。随后根据 逆转录试剂盒在 体系下将 逆转录为，并取定量 通过实时荧光定量 检测 在细胞中的表达情况。取对数生长期的 细胞，加入预冷的含有 的 裂解液，冰上裂解 后 离心 取上清，通过 蛋白浓度检测法（）检测上清中细胞总蛋白含量。将所需量的蛋白溶液与 的蛋白上样缓冲液混合后，置于金属浴上 加热 ，冷却至室温后将蛋白样本加入制备好的 胶孔中，分别以 和 的电压使蛋白样本通过压缩胶和分离胶。裁剪与胶相对应大小的 膜，浸泡于甲醇中约，将在转模液中浸湿后的海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵按顺序置于转模夹中夹紧，放入转膜中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，槽中并加入转膜液，转膜槽放在碎冰中以 转膜 。转模结束后，将 膜置于 的 溶液中封闭 ，随后分别将 膜与 一抗和 二抗室温孵育 和 ，最后将显影液滴加在 膜上并进行曝光拍照检测 蛋白在细胞中的表达情况。阳性细胞增殖与克隆形成实验取处于 对 数 生 长 期 的 阳 性 细 胞（），并以未转染 慢病毒质粒载体 细胞（）为对照，用含 的胰酶消化后，以 个细胞每孔铺入 孔板中，分成、加曲妥珠单抗和 加曲妥珠单抗组，曲妥珠单抗在培养基中的终浓度为 ，每组 个重复孔。采用细胞活力检测法（）于、检测每组细胞的增殖情况，即 孔板中加入 试剂后避光孵育 ，用酶标仪检测 孔板在 处的吸光值。取处于对数生长期的 和 细胞，胰酶消化计数后以 个细胞每孔铺入 孔板中，细胞均匀分布，随后加入终浓度为 的曲妥珠单抗。每 更换新鲜培养基，待细胞克隆形成后，倾倒培养基并用 缓冲液清洗细胞 次，吸干 缓冲液后用 的多聚甲醛固定细胞 ，随后加入 的结晶紫溶液染色 ，缓冲液冲洗残留染色液，室温晾干拍照并计算细胞克隆形成数。统计学方法本研究数据采用 包 进行分析，计数资料以例（）表示，连续性变量符合正态分布采用组间 检验，不符合正态分布则描述为中位数四分位数，采用秩和检验；二分类变量组间比较采用卡方检验或 精确检验。表示差异有统计学意义。结果与讨论 及 在正常组织和乳腺癌中的表达情况 通过 例人乳腺癌的组织切片进行免疫组化染色法检测乳腺癌标本中全长 和 的表达，结果显示 例的乳腺癌标本全长 表达阳性，其中 （）的乳腺癌标本中 表达阳性（图，表）。此外，我们发现大部分 阳性分布在 免疫组化（，）的乳腺癌样本中，而在 及 以 下 的 样 本 中 未 检 测 到 阳性，这与之前的报道一致。综上所述，在大约 的 阳性（）乳腺癌中表达，但在正常组织中检测不到，这使得它成为一个有吸引力的肿瘤特异性靶点。图 及 在正常组织和乳腺癌中的表达：及 与 作用机制示意图；：乳腺癌组织 及 蛋白表达情况的免疫组化图，中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，表 在 阳性乳腺癌患者肿瘤组织中表达与临床指标的关系指标低表达（）高表达（）值 值年龄 伴导管内癌 否（）（）是（）（）腋窝淋巴结转移 否（）（）是（）（）肿瘤大小 （）（）（）（）肿瘤分级 （）（）（）（）雌激素受体 弱阳或阴性（）（）阳性（）（）（）（）（）（）临床病理特征与 蛋白表达的关系 在不同年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、浸润性癌是否合并导管内癌等指标上的差异无统计学意义（）；而在原发病灶的 分组中，患者 的表达差异有统计学意义（），见表。进一步，我们专门分析其与血常规及生化治疗方面是否有联系，结果发现在碱性磷酸酶、肌酸激酶、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇同样差异有统计学意义（），见表。稳定表达细胞株的构建稳定表达细胞株的构建，是通过慢病毒转染含嘌呤霉素抗性的 表达质粒筛选得到。随后，通过实时荧光定量法和 法，对构建好的 稳 定 表 达 细 胞 株（）的 基因和蛋白表达进行验证。其结果如图，经过转染后 细胞在荧光显微镜下发出大量绿色荧光，同时在嘌呤霉素的筛选下未经过慢病毒转染的 细胞全部死亡。细胞在嘌呤霉素的筛选下与 细胞比其 表达有显著差异，同时 结果也证明了 蛋白可以在 细胞上稳定表达（图）。因此，后续实验以嘌呤霉素筛选后的 慢病毒转染的 细胞（）作为 基因稳定表达细胞株。阳性细胞的增殖与克隆形成实验 基因是 基因在其氨基酸序列第 处截短所表达出的蛋白，其细胞外段截短，是导致曲妥珠单抗无法识别、结合而发挥抗体药物功能的原因之一，进而导致表达 基因的 阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗抵抗。而 及 是一种具有激酶活性的跨膜蛋白，属于表皮生长因子跨膜受体，其表达与细胞增殖、存活密切相关。实验通过细胞 法和结晶紫染色法，检测在有曲妥珠单抗药物的作用下，表达 的乳腺癌细胞（）及表达 的乳腺癌细胞（）的增殖情况。结果如图 所示，在未加曲妥珠单抗药物组，增殖迅速与 比 有 极 显 著 差 异（），而 加 入 曲妥珠单抗药物后，细胞迅开始死亡（，），在 时 细胞数量仅有实验开始 时细胞总量的 左右。在 未加曲妥珠单抗药物组，乳腺癌细胞增殖对比 在未加曲妥珠单抗药物组 内无显著性差异（），加入曲妥珠单抗药物后 明显产生药物抵抗，与 加药组比其在 内细胞继续增殖（），但增殖比例低于 未加曲妥珠单抗药物组，其原因为 细胞有一定的 基因表达，可与曲妥珠单抗药物作用。细胞克隆形成实验是测定细胞增殖能力的方法之一，细胞贴壁后必须是有增殖活力的细胞才能形成克隆，而细胞存活及形成克隆的数量多少，可以有效反应实验外加条件对细胞增殖的影响。细胞克隆形成实验结果如图 所示，在 组 的曲妥珠单抗药物有效抑制了细胞克隆的形成，而在转染了 慢病毒质粒载体后，组细胞克隆数量虽有抑制，但与使用了曲妥珠单抗药物 组比较差异有统计学意义，实验结果进一步说明 细胞对曲妥珠单抗药物具有抵抗作用。同时，保留了 的生物功能因而导致了肿瘤细胞的增殖。讨论 是 表 皮 生 长 因 子（，）受体酪氨酸激酶家族的一员。在胚胎发育，特别是在心脏发育过程中起着至关重中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，表 在 阳性乳腺癌患者肿瘤组织中表达与血生化及血常规指标的关系，（，）指标 低表达（）高表达（）统计值 值丙氨酸氨基转移酶（）（，）（，）天门冬氨酰基转移酶（）（，）（，）碱性磷酸酶（）（，）（，）谷氨酰转移酶（）（，）（，）乳酸脱氢酶（）（，）（，）肌酸激酶（）（，）（，）羟丁酸脱氢酶（）（，）（，）总胆红（）（，）（，）直接胆红（）（，）（，）间接胆红（）（，）（，）总胆固醇（）甘油三酯（）（，）（，）高密度脂蛋白胆固醇（）低密度脂蛋白胆固醇（）（，）（，）脂蛋白 （）（，）（，）总蛋白（）（，）（，）白蛋白（）球蛋白（）（，）（，）白球比（）葡萄糖（）（，）（，）尿素（）肌酐（）（，）（，）尿酸（）（，）（，）钙离子（）磷（）（，）（，）白细胞（）淋巴细胞（）单核细胞（）中性粒细胞（）嗜酸性粒细胞（）（，）（，）嗜碱性粒细胞（）（，）（，）淋巴细胞百分比（）单核细胞百分比（）中性粒细胞百分比（）嗜酸性粒细胞百分比（）（，）（，）嗜碱性粒细胞百分比（）（，）（，）红细胞（）血红蛋白（）（，）（，）红细胞压积（）平均红细胞体积（）（，）（，）平均红细胞血红蛋白量（）（，）（，）平均血红蛋白浓度（）（，）（，）红细胞分布宽度（）（，）（，）血小板（）降钙素原（）平均血小板体积（）血小板分布宽度（）（，）（，）中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，图 稳定表达细胞株的构建：荧光显微镜下 细胞转染 慢病毒质粒载体，；：与 检测转染 过表达慢病毒质粒载体后 细胞中 基因在的表达情况图 阳性细胞的增殖与克隆形成实验：结晶紫染色后的细胞克隆情况照片；：不同实验组细胞克隆情况统计图；：不同实验组细胞增殖情况，中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，要的作用。在一些上皮来源的正常组织中具有中低表达水平，其在乳腺癌、胃癌和胃食管交界处癌、结直肠癌、胆道癌、非小细胞肺癌和膀胱癌等多种癌症中扩增或过表达。在 在乳腺癌研究中，仅在肿瘤组织中高表达，并且表达率超过。这些研究主要集中在 蛋白表达曲妥珠单抗的抵抗方面，以及与患者预后的关系上，而其与肿瘤增殖等生物学行为有无关系，目前并没有详细评估，由于入组患者为两年内的 阳性乳腺癌患者，未得到乳腺癌耐药随访结果，同时在患者入院后新辅助患者病例不足且有研究表述 蛋白表达参与了曲妥珠单抗治疗抵抗，后续我们将纳入更多病例并增加随访时间以分析 蛋白表达与曲妥珠单抗治疗效果情况。有研究证实，阳性乳腺癌接受曲妥珠单抗拉帕替尼双靶治疗，的抑制程度更高。此前有文章研究拉帕替尼对 过表达的 阳性乳腺癌带来获益。结合两者研究，我们有理由相信，因为避开靶向药的结合且维持 的活性，从而发挥维持肿瘤细胞的高增殖特性。在我们的研究中，与 存在显著相关性。在 阴性组，低表达数目占比 （）；而 阳性组中，低表达占比为（），提示 可能在恶性肿瘤细胞 增 殖 过 程 中 同 样 发 挥 作 用。为 了 探 讨 较全长 是否有更高的细胞增殖特性，我们进行了相关细胞株的细胞克隆形成实验，结果同样发现 过表达的 细胞具有更强的增殖能力，并且胞外段截短的 蛋白有着与 蛋白类似的促进细胞增殖的生物学功能，同时 蛋白可以抵抗 抗体药物（曲妥珠单抗）对 阳性细胞的抑制作用。此外，有研究针对不同乳腺癌分子亚型分析对比临床病理资料的关系，发现 与血脂之间存在联系，且在 及 阳性乳腺癌中，血清 和 明显升高。肥胖与癌症之间存在关联的流行病学证据是确凿的，而与肥胖相关的脂蛋白水平与癌症之间的关联则不那么明显。有文献研究提示循环血液载脂蛋白平与多种癌症风险相关。另有研究提示血清中，和 的水平与乳腺癌风险相关。因此，我们针对患者的生化指标进行了相关性分析，发现 阳性组 较 阴性组高，该现象有待进一步探索。同时，研究提示了在 阳性乳腺癌患者中，当 蛋白的表达水平升高时，肿瘤组织中的 增殖指数也会上升，肿瘤细胞的增殖能力增强。而 因为其表达在细胞外蛋白的截短而失去与曲妥珠单抗结合位点，导致肿瘤细胞对曲妥珠单抗治疗产生内在的抵抗性，这些研究对于理解 阳性乳腺癌的内在抗性和治疗方法具有重要意义。参考文献：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：（下转第 页）中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，参考文献：，（）：？，（）：，：，（）：，：，：，（）：，（）：，；，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，；，（）：，：，：，：，（）：修回日期：本文编辑：凌云（上接第 页），（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：修回日期：本文编辑：钦嫣中国肿瘤外科杂志 年 月第 卷第 期 ，