Eg5小分子抑制剂SB-743921通过c-Myc_SP1_CDK1通路抑制去势抵抗性前列腺癌细胞恶性增殖的研究.pdf

浙江医学2023年第45卷第15期论著徐礼臻朱再生周鹏飞刘全启徐旻胡亮Eg5 小分子抑制剂 SB-743921通过c-Myc/SP1/CDK1通路抑制去势抵抗性前列腺癌细胞恶性增殖的研究DOI：10.12056/j.issn.1006-2785.2023.45.15.2020-3371基金项目：金华市科学技术研究计划项目（2019-4-022）作者单位：321000浙江大学医学院附属金华医院泌尿外科通信作者：徐礼臻，E-mail：【摘要】目的探讨驱动蛋白（Eg5）小分子抑制剂SB-743921 对去势抵抗性前列腺癌（CRPC）细胞增殖、凋亡、细胞周期及迁移的影响以及相关分子机制。方法取对数生长期的人 CRPC 细胞株 DU145，设置对照组、NC 小干扰 RNA（siRNA）组、Eg5 siRNA组、SB-743921（4 nmol/L）组、SB-743921（8 nmol/L）组。分别采用MTT法、流式细胞术、PI单染实验、划痕实验检测SB-743921对细胞增殖、凋亡、细胞周期及迁移的影响；进一步采用qRT-PCR、Western blot 法检测SB-743921对细胞中c-Myc、SP1、周期蛋白依赖性激酶（CDK）1、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）mRNA及蛋白表达水平的影响。结果Eg5 siRNA 组、SB-743921（4 nmol/L）组、SB-743921（8 nmol/L）组生长抑制率、细胞凋亡率、G2/M 期百分比均明显高于对照组（均P0.05），而细胞迁移率均明显低于对照组（均P0.05）。Eg5 siRNA 组、SB-743921（4 nmol/L）组、SB-743921（8 nmol/L）组 c-Myc、SP1、CDK1、Vimentin mRNA 及蛋白表达水平均明显低于对照组（均P0.05），E-cadherinmRNA 及蛋白表达水平均明显高于对照组（均P0.05）；SB-743921（8 nmol/L）组 CDK1、Vimentin 蛋白表达水平均明显低于Eg5 siRNA 组（均P0.05）。结论SB-743921可通过c-Myc/SP1/CDK1信号通路阻断CRPC细胞的恶性增殖和迁移，诱导细胞凋亡并将细胞周期阻滞在G2/M期。【关键词】驱动蛋白5；去势抵抗性前列腺癌；c-Myc；SP1；周期蛋白依赖性激酶1Eg5 inhibitor SB-743921 inhibits malignant biological features of castration-resistant prostate cancer cells through c-Myc/SP1/CDK1 signaling pathwayXU Lizhen,ZHU Zaisheng,ZHOU Pengfei,LIU Quanqi,XU Min,HU LiangAuthors address:Department of Urology,Affiliated Jinhua Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Jinhua 321000,ChinaCorresponding author:XU Lizhen,E-mail:【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of kinesin-5(Eg5)inhibitor SB-743921 on the proliferation,apoptosis,cell cycle,invasion and metastasis of castration-resistant prostate cancer(CRPC)cells and the related mechanism.MethodsHuman CRPC DU145 cells were divided into control group,NC small interfering RNA(siRNA)group,Eg5 siRNAgroup,SB-743921(4 nmol/L)group and SB-743921(8 nmol/L)group.The effects of SB-743921 on cell proliferation,apoptosis,cell cycle,and migration were detected using MTT test,PI staining,flow cytometry and scratch assay,respectively.The expression of c-Myc,SP1,cyclin-dependent kinase 1(CDK1),E-cadherin,Vimentin mRNA and protein inDU145 cells were detected by qRT-PCR and Western blot,respectively.ResultsThe growth inhibition rate,apoptosis rate,G2/M phase percentage of Eg5 siRNA group,SB-743921(4 nmol/L)group and SB-743921(8 nmol/L)group weresignificantly higher than those of the control group(allP0.05),while cell migration rates were significantly lower than those of 1609浙江医学2023年第45卷第15期近年来前列腺癌的发病率逐渐上升且患者趋于年轻化1-2。研究表明，前列腺癌是一种异质性疾病，相同病理类型的前列腺癌表现形式差异很大3-4。对于细胞生长缓慢且长期局限于前列腺内的患者，可采取积极观察等应对措施；对于侵袭性前列腺癌患者，多采取积极手术等治疗方式，一般行前列腺切除术、睾丸切除术或全雄激素剥夺治疗5。但是，转移性前列腺癌接受手术去势或雄激素剥夺治疗后，经过一段时间后大多发展为去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）。CRPC 是前列腺癌晚期的一种表现形式，易发生转移，且致死率极高，目前尚无确切的治疗方式6。因此，探讨前列腺癌发展为CRPC 的分子机制是突破 CRPC 治疗瓶颈的有效手段。驱动蛋白5（kinesin-5，Eg5）在细胞纺锤体有丝分裂过程中起着重要作用。研究发现，Eg5参与调节细胞周期、细胞凋亡、肿瘤侵袭转移及DNA损伤响应等多种生物学功能7，与胰腺癌、肝癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关8。Eg5在恶性肿瘤细胞中异常表达会导致转录因子c-Myc表达上调；而c-Myc过表达与前列腺癌去势抵抗有关。作为c-Myc的下游靶点SP1，与共济失调毛细血管扩张突变基因转录调控密切相关，参与调节DNA双链损伤修复、细胞周期、肿瘤转移等9。作为重要的有丝分裂作用因子，笔者推测Eg5可能是CRPC的有效靶点。但Eg5调节前列腺癌细胞产生去势抵抗的机制研究鲜有报道。因此，本研究观测了 Eg5 小分子抑制剂 SB-743921 对CRPC细胞株DU145增殖、凋亡、细胞周期及迁移的影响，并初步探讨相应的分子机制，现将结果报道如下。1材料和方法1.1主要药物与试剂Eg5小分子抑制剂SB-743921（批号：HY-12069）购自美国 Med Chem Express 公司。Eg5抗体（批号：14404S）、c-Myc抗体（批号：18583S）、SP1抗体（批号：9389S）、波形蛋白（Vimentin）抗体（批号：5741S）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）抗体（批号：14472S）、-肌动蛋白（-actin）（批号：4970S）、鼠二抗（批号：14709S）、兔二抗（批号：14708S）均购自美国Cell Signaling Technology 公司，周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）1抗体（批号：ab201008）购自美国Abcam公司，MTT试剂盒（批号：C0009）、An-nexin V-FITC 典化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒（批号：C1062M）均购自上海碧云天生物技术公司，MEM培养基（批号：KGM41500N-500）购自江苏凯基生物技术股份有限公司，RIPA 裂解液（批号：SY021-100）购自南京三翊生物科技有限公司，反转录试剂盒（批号：R323）、qRT-PCR 试剂盒（批号：Q311）均购自南京诺唯赞生物科技有限公司，慢病毒 NC 小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）（批号：PLV-10）、Eg5siRNA（批号：AM4639）均购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。1.2细胞培养与分组人CRPC细胞株DU145购自上海生命科学院细胞资源中心。将 DU145 细胞置于含10%FBS、100 mg/L 链霉素、100 U/L 青霉素的 MEM 培养基中培养。取对数生长期的DU145细胞，设置对照组、NC siRNA 组、Eg5 siRNA 组、SB-743921（4 nmol/L）组、SB-743921（8 nmol/L）组，每组3个重复孔。待细胞贴壁后，NC siRNA组、Eg5 siRNA组分别用NC siRNA、Eg5 siRNA 转染细胞；SB-743921（4 nmol/L）组、SB-743921（8 nmol/L）组分别用 4、8 nmol/L 的 SB-743921处理细胞48 h预实验提示SB-743921对DU145细胞处理72 h的半数抑制浓度为（8.830.67）nmol/L，故本实验以4、8 nmol/L浓度进行以下实验。1.3细 胞 增 殖 能 力 检 测采 用 MTT 法。取 5 组DU145细胞，以4104个/mL的浓度接种于96孔板；每孔加入MTT继续培养4 h，弃上清液；每孔加入150 L二甲基亚砜震荡 30 s，使用美国 Biotek 公司 Cytation 5酶标仪测定570 nm波长处的吸光度值。细胞生长抑制率=1-实验组吸光度值/空白对照组吸光度值the control group(allP0.05).The expression levels of c-Myc,SP1,CDK1,Vimentin mRNA and protein in the Eg5 siRNAgroup,SB-743921(4 nmol/L)group,and SB-743921(8 nmol/L)group were significantly lower than those of the control group(allP0.05),while the expression levels of E-cadherin mRNA and protein were significantly higher than those of the controlgroup(allP0.05).The expression levels of CDK1 and Vimentin proteins in the SB-743921(8 nmol/L)group weresignificantly lower than those of the Eg5 siRNA group(allP0.05).ConclusionSB-743921 can block the malignantproliferation and migration of CRPC cells through c-Myc/SP1/CDK1 signaling pathway,induce cell apoptosis and block cellcycle in G2/M phase.【Key words】Kinesin-5;Castration-resistant prostate cancer;c-Myc;SP1;Cyclin-dependent kinase 1 1610浙江医学2023年第45卷第15期100%。1.4细胞凋亡能力检测采用流式细胞术。收集5组DU145细胞，以1106个/mL的浓度接种于6孔板，PBS洗涤2次；在室温、避光下Annexin V-FITC染色5 min，PI 染色 5 min。使用德国美天旎生物技术公司 MAC-SQuant流式细胞仪检测细胞凋亡情况，利用FlowJo 7.6软件分析并计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数100%。1.5细胞周期检测采用 PI 单染实验。收集 5 组DU145 细胞，以 1106个/mL 的浓度接种于 6 孔板，PBS 洗涤 2 次；将各组细胞固定于 70%乙醇，再加入含有 RNA 酶 RNAase A 的 PI 染液，在室温下孵育细胞30 min；用 PBS 除去多余 PI 染液，使用美国 BD 公司FACSCanto流式细胞仪测定细胞周期分布情况，利用ModFit LT3.3软件分析并计算G2/M期百分比。1.6细胞迁移能力检测采用划痕实验。取 5 组DU145细胞，以2105个/mL的浓度接种于6孔板，待细胞贴壁后用移液器吸头制造划痕，继续培养。于0、48 h使用倒置显微镜观察划痕情况并拍照，使用Im-age J 软件分析并计算细胞迁移率。细胞迁移率=0 h划痕宽度-培养 48 h 后划痕宽度）/0 h 划痕宽度100%。1.7c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin mRNA表达水平检测采用qRT-PCR法。取5组DU145细胞，以1106个/mL的浓度接种于60 mm3的培养皿，培养48 h后提取总RNA；使用NanoDrop-100微量核酸蛋白测定仪测定对应RNA的浓度和纯度；利用反转录试剂盒反转录1 mol/L RNA得到cDNA，使用qRT-PCR试剂盒进行反应。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参，使用2-Ct法计算目的基因mRNA表达水平。各基因引物列见表1。1.8c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin 蛋白表达水平检测采用 Western blot 法。取 5 组 DU145 细胞，以1106个/mL的浓度接种于100 mm3的培养皿，培养 48 h 后提取总蛋白；使用 RIPA 裂解液在冰上裂解40 min，离心收集上清蛋白；用美国Bio-rad公司蛋白电泳仪系统进行 SDS-PAGE 凝胶电泳并分离目标蛋白，利用湿法电转至聚偏二氟乙烯膜。膜上的蛋白用5%（w/v）脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗4 孵育8 h，加入二抗室温孵育1.5 h。使用增强化学发光液显色，利用美国Bio-rad公司Gel DocTMXR+凝胶成像系统检测条带灰度值，并用Image J软件处理数据，计算目的蛋白表达水平。1.9统计学处理采用 SPSS 26.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1SB-743921对DU145细胞增殖的影响5组细胞生长抑制率比较，差异有统计学意义（P0.05）；其中Eg5 siRNA 组、SB-743921（4 nmol/L）组、SB-743921（8nmol/L）组生长抑制率分别为（33.353.12）%、（34.232.38）%、（36.322.67）%，均高于对照组的（2.320.23）%，差异均有统计学意义（均P0.05）。2.2SB-743921对DU145细胞凋亡的影响5组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P0.05）；其中Eg5 siRNA组、SB-743921（4 nmol/L）组、SB-743921（8 nmol/L）组细胞凋亡率分别为（24.222.13）%、（18.791.33）%、（31.353.11）%，均高于对照组的（7.370.88）%，差异均有统计学意义（均P0.05），见图1。2.3SB-743921对DU145细胞周期的影响5组细胞G2/M期百分比比较，差异有统计学意义（P0.05）；其中 Eg5 siRNA 组、SB-743921（4 nmol/L）组、SB-743921（8 nmol/L）组 G2/M 期百分比分别为（13.291.23）%、（11.462.31）%、（15.612.47）%，均高于对照组的（1.790.43）%，差异均有统计学意义（均P0.05），见图2。2.4SB-743921 对 DU145 细胞迁移的影响5 组细胞迁移率比较，差异有统计学意义（P0.05）；其中Eg5 siRNA 组、SB-743921（4 nmol/L）组、SB-743921（8 nmol/L）组 细 胞 迁 移 率 分 别 为（2.350.52）%、（6.501.56）%、（5.401.30）%，均明显低于对照组的（25.325.80）%，差异均有统计学意义（均P0.05），表1引物序列基因c-MycSP1CDK1E-cadherinVimentinGAPDH反向引物（5-3）TACGCACAAGAGTTCCGTAGCTAGAGTCTGCCAACTGACCTGCCACACTTCATTATTGGGAGGCAATGCGTTCTCTATCCAGAAATCCTGCTCTCCTCGCCTTCACCACTGACACGTTGGCAG正向引物（5-3）ATACATCCTGTCCGTCCAAGCAGACCTTTACAACTCAAGCCATATTTGGAGTATAGGCACCATAGGCAAGGTTTTCTACAGCATCAAATGGCTCGTCACCTTCGTGAAACTGTGGCGTGATGGC注：CDK为周期蛋白依赖性激酶；E-cadherin为E-钙黏蛋白；Vimentin为波形蛋白；GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶 1611浙江医学2023年第45卷第15期见图3。2.5SB-743921对c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vi-mentin mRNA 表 达 水 平 的 影 响5 组 细 胞 c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin mRNA 表达水平比较，差异均有统计学意义（均P0.05）；其中Eg5 siR-NA组、SB-743921（4 nmol/L）组、SB-743921（8 nmol/L）组c-Myc、SP1、CDK1、Vimentin mRNA表达水平均明显低于对照组，E-cadherin mRNA 表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P0.05），见表2。2.6SB-743921 对 c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin 蛋白表达水平的影响5 组细胞 c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin 蛋 白 表 达 水 平 比注：Eg5为驱动蛋白5；siRNA为小干扰RNA；与对照组比较，aP0.05图1SB-743921对DU145细胞凋亡的影响细胞凋亡率（%）aaa注：Eg5为驱动蛋白5；siRNA为小干扰RNA；与对照组比较，aP0.05图2SB-743921对细胞周期的影响G0/G1:39.56%G0/G1:37.27%G0/G1:32.43%G0/G1:34.60%G0/G1:30.46%G2/M:1.79%G2/M:2.99%G2/M:13.29%G2/M:11.46%G2/M:15.61%数量G2M1（%）通道（PI-A）aS:58.65%S:59.74%S:54.28%S:53.95%S:53.93%aa 1612浙江医学2023年第45卷第15期较，差异均有统计学意义；其中 Eg5 siRNA 组、SB-743921（4 nmol/L）组、SB-743921（8 nmol/L）组c-Myc、SP1、CDK1、Vimentin蛋白表达水平均明显低于对照组，E-cadherin蛋白表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均 P0.05）；SB-743921（8 nmol/L）组CDK1、Vimentin 蛋白表达水平均明显低于 Eg5 siRNA组，差异均有统计学意义（均P0.05），见图4和表3。3讨论前列腺癌是男性泌尿系统常见的肿瘤。在前列对照组NC siRNA组Eg5 siRNA组SB-743921（4 nmol/L）组SB-743921（8 nmol/L）组0 h48 h注：Eg5为驱动蛋白5；siRNA为小干扰RNA；与对照组比较，aP0.05图3SB-743921对DU145细胞迁移的影响注：Eg5为驱动蛋白5；siRNA为小干扰RNA；CDK为周期蛋白依赖性激酶；E-cadherin为E-钙黏蛋白；Vimentin为波形蛋白；与对照组比较，aP0.05表2SB-743921对c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin mRNA表达水平的影响组别NC siRNA组Eg5 siRNA组SB-743921（4 nmol/L）组SB-743921（8 nmol/L）组对照组P值n33333c-Myc1.040.060.450.06a0.560.10a0.470.04a1.010.120.05SP11.050.130.560.07a0.660.08a0.340.09a1.020.130.05CDK10.940.050.690.07a0.740.11a0.660.04a1.110.140.05E-cadherin1.010.041.690.08a1.560.14a1.770.08a1.100.150.05Vimentin0.980.110.530.08a0.620.04a0.510.05a1.030.190.05c-MycSP1CDK1E-cadherinVimentin-actin对照组NC siRNA组Eg5 siRNA组SB-743921（4 nmol/L）组SB-743921（8 nmol/L）组注：Eg5为驱动蛋白5；siRNA为小干扰RNA；CDK为周期蛋白依赖性激酶；E-cadherin为E-钙黏蛋白；Vimentin为波形蛋白；-actin为-肌动蛋白图45组DU145细胞c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin蛋白表达的电泳图细胞迁移率（%）8040200NC siRNA组对照组Eg5 siRNA组SB-743921（4 nmol/L）组SB-743921（8 nmol/L）组aaa 1613浙江医学2023年第45卷第15期腺癌发生、发展过程中，细胞有丝分裂异常发挥着重要作用。研究表明，Eg5异常表达会引起细胞有丝分裂异常和细胞异常增殖，是一个有效的靶点10。但它与很多参与调节有丝分裂的因子不同，Eg5在正常组织细胞中的表达水平极低，但在恶性肿瘤细胞内的表达水平异常升高11。研究发现，Eg5 在正常细胞及恶性肿瘤细胞内的差异表达可导致靶向Eg5疗法的不良反应相对较少，是一个很好的抗有丝分裂基因12。CRPC 细胞内存在着 Eg5 过表达和活化13，因此探讨Eg5对CRPC细胞株DU145细胞恶性增殖、侵袭及转移的调节作用具有重要意义。本研究评价了Eg5小分子抑制剂SB-743921对DU145细胞增殖、凋亡、细胞周期及迁移的影响，同时初步探讨了相关分子机制。本研究发现，靶向沉默 Eg5 表达可明显抑制DU145 细胞恶性增殖，诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G2/M期，减弱肿瘤细胞迁移能力；Eg5小分子抑制剂 SB-743921 可以抑制 DU145 细胞恶性增殖和迁移。研究表明，Eg5表达和功能的抑制可引起转录因子SP1、CDK1表达水平降低14-15。SP1是c-Myc的下游靶基因，与肿瘤的恶性增殖、侵袭和转移密切相关16。SP1表达水平降低可导致肿瘤细胞增殖及转移能力减弱。CDK1是细胞有丝分裂的重要调节因子，其表达水平降低会导致细胞周期阻滞在 G2/M 期，继而导致细胞因无法进行有丝分裂而凋亡17。本研究进一步探讨相关分子机制发现，靶向沉默Eg5表达可下调c-Myc、SP1、CDK1、Vimentin mRNA 及蛋白表达水平，上调 E-cadherin mRNA 及蛋白表达水平；而 Eg5 小分子抑制剂SB-743921可进一步下调CDK1、Vimentin蛋白表达水平。综上所述，Eg5 小分子抑制剂 SB-743921 通过 c-Myc/SP1/CDK1信号通路阻断CRPC细胞的恶性增殖和迁移，诱导细胞凋亡并将细胞周期阻滞在G2/M期；提示SB-743921具有治疗CRPC的潜在价值。4参考文献1Gillessen S,Bossi A,Davis ID,et al.Management of patientswith advanced prostate cancer.part i:intermediate-/high-riskand 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nmol/L）组对照组P值n33333c-Myc0.630.060.250.03a0.430.05a0.270.04a0.640.070.05SP10.640.070.340.04a0.410.08a0.210.03a0.610.060.05CDK10.900.080.740.07a0.540.07a0.310.04ab0.940.070.05E-cadherin0.280.030.690.08a0.560.07a0.710.08a0.130.020.05Vimentin0.590.070.460.08a0.320.04a0.210.04ab0.600.090.05 1614浙江医学2023年第45卷第15期DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-9026.2021.10.015.3牛志强,莱智勇,高明,等.全身炎症反应指数评估消化系统恶性肿瘤患者预后的研究进展J.国际外科学杂志,2021,48(2):132-136.DOI:10.3760/cma.j.issn115396-20201124-00367.4王欣,张俊璇,高健,等.免疫营养改善肿瘤患者预后J.首都医科大学学报,2020,41(6):157-162.DOI:10.3969/j.issn.1006-7795.2020.06.027.5张春艳，刘明珠,侯宁,等.系统免疫炎症指数对放化疗老年食管癌患者预后的预测作用J.现代消化及介入诊疗,2021,26(3):314-318.DOI:10.3969/j.issn.1672-2159.2021.03.007.6赵彦,祝淑钗,宋春洋,等.放疗前预后营养指数对临床期食管癌患者生存的影响分析J.中华放射医学与防护杂志,2021,41(6):426-430.DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2021.06.005.7张敏,张红河,来茂德.肿瘤免疫编辑中肿瘤微环境的变化J.中华病理学杂志,2021,50(9):1098-1102.DOI:10.3760/112151-20201229-00981.8刘丽荣,刘译鸿.肿瘤炎性微环境及其对肿瘤相关巨噬细胞抑制的研究进展J.疑难病杂志,2020,19(2):193-197.DOI:10.3969/j.issn.1671-6450.2020.02.020.9陈清清,崔红霞,田野,等.SII-N评分模型预测老年食管癌预后的初步探讨J.中华放射肿瘤学杂志,2020,29(8):649-653.DOI:10.3760/113030-20190822-00340.10王彦,王彦文,郑智尧,等.治疗前系统免疫炎症指数与食管癌患者预后关系的 meta 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