KLF15_mTOR相关蛋白在有氧间歇性运动改善2型糖尿病大鼠骨骼肌病变中的作用.pdf

相关蛋白在有氧间歇性运动改善 型糖尿病大鼠骨骼肌病变中的作用廖忠鑫，黄蕾，朱洪竹，朱梅菊（井冈山大学体育学院，吉安 ；湖南医药学院，怀化 ）【摘要】目的：研究有氧间歇运动调节 相关蛋白表达改善 型糖尿病大鼠骨骼肌病变的作用。方法：采用高脂饲料喂养 周配合腹腔注射链脲佐菌素的方法制备 型糖尿病大鼠实验模型。成模后，大鼠随机分为 组：糖尿病模型组（）、糖尿病 运动组（），另设对照组（）。每组 只。组给予周有氧间歇跑台运动干预，组不施加任何干预。实验末，采用 法检测腓肠肌 、表达，染色、荧光染色法等分别观察腓肠肌形态结构，骨骼肌细胞凋亡和肌质量的变化，同时测试血糖、血胰岛素指标。结果：与 组比较，组腓肠肌湿重、体重和腓肠肌湿重 体重比值均显著降低（或 ）；与 组比较，组腓肠肌湿重、腓肠肌湿重 体重比值显著增加（均 ）。与 组比较，组空腹血糖显著升高（），胰岛素水平显著降低（）；与 组比较，组空腹血糖水平显著降低（），胰岛素水平显著增加（）。与 组比较，病理观察 组骨骼肌细胞形态异常，肌核增多，横纹模糊消失，肌节出现节断性损伤、部分肌纤维有溶解等现象；与 组比较，组的细胞形态异常、肌节的节断性损伤和肌纤维的溶解等现象均有一定程度改善，肌膜较完整、肌核排列渐趋整齐。与 组比较，组骨骼肌 、细胞凋亡率和 蛋白表达显著升高（），水平显著降低（）；与 组比较，组的 、细胞凋亡率和 表达显著降低（或 ），该组的 水平显著增加（）。结论：有氧间歇运动有利于改善 型糖尿病大鼠骨骼肌病变，其原因可能是通过有效调节 相关蛋白表达，一定程度减少细胞凋亡损伤实现。【关键词】型糖尿病；有氧间歇运动；骨骼肌病变；相关蛋白；大鼠【中图分类号】，【文献标识码】【文章编号】（）【】，（，；，）【】：（），：（），（），（），；，：，（）；，（），（），（）；，（），（），（），（）；，（）：，【】；【基 金 项 目】国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目（，）；江 西 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目（）；江 西 省 教 育 厅 科 技 计 划 资 助 项 目（）【收稿日期】【修回日期】【通讯作者】：（）；：糖尿病是一种常见的慢性代谢障碍性疾病，其引起的骨骼肌病变是糖尿病新的并发症。其发病率是健康人的 倍 ，可使患者跌倒、残疾和死亡风险增加，严重降低糖尿病患者的生活质量，加重医疗和社会负担。目前国内外尚无理想的治疗药物和尚缺乏有效的干预措施。样因子 （，）属于锌指结构的多功能转录因子，可参与许多生命活动进程，包括细胞代谢、细胞凋亡、修复等 ，其多表达于骨骼肌、脂肪细胞等。最新研究发现，的表达增加是糖尿病引起肌肉损失的关键蛋白质；而肌肉中缺乏 的小鼠可以对抗糖尿病引起的骨骼肌质量下降 。蛋白的调节可能是有效防治糖尿病骨骼肌病变及相关代谢性疾病的新靶点 。而有关 蛋白在国内外运动医学领域的研究鲜有报道。哺乳动物雷帕霉素靶点（，）在蛋白质合成中具有重要的作用，也是糖尿病状态下维持肌肉蛋白代谢平衡的必需途径 。磷酸化水平提高可以促进骨骼肌细胞增殖，维持骨骼肌的质量 。作为 的重要下游因子，在糖皮质激素刺激下，通过激活相关基因表达，抑制 信号活性减少肌肉蛋白的合成 ，引起肌质量减少。因此调控 相关蛋白表达可能是防治糖尿病骨骼肌病变的一个新思路。运动对增强身体健康具有显著作用，常用于多种慢病干预。规律运动是防治糖尿病骨骼肌病变的有效方法 ；为对抗肌肉损害、功能下降及恢复正常代谢的有效手段 。研究显示，运动能够通过活化 信号蛋白促进蛋白质合成，从而提高肌肉功能 。有氧运动在抑制型糖尿病小鼠骨骼肌分解系统的同时还能提高骨骼肌合成系统共同实现骨骼肌质量增长，后者主要与激活由 为核心组成的 的蛋白合成效应有关 。但运动对糖尿病骨骼肌的保护作用是否通过调控 蛋白来实现？目前研究尚不清楚。因此，本研究拟通过制备 型糖尿病大鼠模型，探讨长时间有氧间歇运动对 蛋白及细胞凋亡方面的调控作用。旨在为寻找新的改善糖尿病骨骼肌病变的方法提供实验数据。材料与方法 实验动物、造模与分组周龄 大鼠（）只，湖南斯莱克景达实验动物公司。大鼠正常喂养 周后，随机分为对照组（组，只，（）和糖尿病造模组（组，只，（），两组大鼠体重差异无显著性。参考本研究室前期实验复制糖尿病大鼠模型 ，组改喂高脂饲料；对照 组继续以标准啮齿类干燥普通饲料喂养。周后，以链脲佐菌素（）单次腹腔内注射 组大鼠，诱导建立 型糖尿病大鼠模型 。日后，只未成功和死亡大鼠剔除。造模成功后，将成模大鼠（只）随机再细分为 组，即模型对照组（组）、糖尿病 运动组（组）。每组 只。实验主要试剂与仪器兔抗鼠多克隆抗体 （批号：），北京博奥森生物公司；（，批号：）和 （批号：），均购于美国 公 司；（批 号：），购于北京博奥森生物公司。链脲佐菌素，公 司；血 清 胰 岛 素 测 定 试 剂 盒（批 号：），上海酶联生物科技公司；试剂盒（批号：），江苏凯基生物。型显微镜（公司，日本），凝胶成像仪（，美国），荧光显微镜（，德国），全自动生化分析仪（日立 ），酶标仪（型，美国 公司），动物跑台（型，安徽淮北正华生物仪器设备公司）。中国应用生理学杂志，（）运动方案 组大鼠在造模成功后 周开始运动干预，训练方案参加文献 ，：正式运动开始前先进行 、的热身运动；之后进行有氧间歇跑台运动：速度 ，时间 ；后间歇 ，速度 ，依次交替进行。每天总运动时间 ，次 日，持续运动 周。运动前 周，先让 大鼠进行速度 （，共 ）的适应性运动。同时 组、组不运动，正常环境饲养 周。实验取材末次运动后 ，所有大鼠分批麻醉。期间全部大鼠过夜禁食（不禁水），尾静脉采血，测试空腹血糖和血清胰岛素。冰浴上完整分离腓肠肌，用冷生理盐水（）清洗血液和毛发，置滤纸上吸干后称量。一侧腓肠肌入液氮速冻，后转移于 冻存，用于 实验；另一侧置多聚甲醛溶液（）中固定用做石蜡切片标本。血糖和胰岛素水平检测空腹血糖用 型葡萄糖测试仪（北京怡成生物电子技术有限公司）测定；血清胰岛素用双抗体夹心法检测。腓肠肌湿重 体重比值的计算湿重 体重比值 腓肠肌湿重 体重 。染色取材过程同上，固定后的肌肉样品按常规方法制备石蜡切片。切片脱腊至水、浸泡、漂洗、封片后，按照 测试盒对各组肌细胞凋亡情况进行检测。用荧光显微镜拍照。每张切片选取 个视野，行肌肉凋亡细胞分析。凋亡率 凋亡细胞数（呈绿色荧光）总细胞数 。苏木精 伊红（）染色将制备好的石蜡切片，在光学显微镜下拍照采集图像，每张图片选取 个视野。观察腓肠肌肌纤维、小血管、肌外膜等结构的变化。检测剪取冷冻腓肠肌组织（），加入 混合裂解缓冲液，上匀浆后离心（，），收集上清液，法检测总蛋白浓度。常规方法依次电泳、转膜、封闭，加 、一抗（抗体工作浓度分别为 、）、加二抗（）孵育。再 洗膜、显影、将胶片扫描存档。内参为 。使用 凝胶电泳成像分析软件进行定量分析。以目的蛋白和内参蛋白条带灰度值的比值作为蛋白表达水平。数据学处理实验数据均以均值 标准差（珋 ）表示，采用 统计软件包对所有数据进行处理。采用单因素方差分析法，组间差异两两比较采用 检验。结果 有氧间歇运动对大鼠体重、腓肠肌湿重和一般情况的影响与对照组（）相比，模型组腓肠肌湿重、体重和腓肠肌湿重 体重比值均显著降低（或 ）。经运动干预后，与 组相比，糖尿病运动组（）的腓肠肌湿重、湿重与体重的比值显著增加（均 ）；其体重有增加趋势，但差异无显著性（，表 ）。同时实验期间 大鼠体型消瘦、毛发色黄无光泽、行动缓慢，出现多饮、多食、多尿等症状；组的上述症状均有一程度改善。（珋 ，）（）（）（）：；：；：，；，有氧间歇运动对大鼠血糖浓度和胰岛素水平的影响如表 所示，与 组相比，组的空腹血糖浓度显著升高（）；其空腹胰岛素水平显著降低（）。与 组相比，运动组血糖浓度显著降低（），其胰岛素水平显著升高（）。运动组血糖浓度仍显著高于 组（），而该组的胰岛素水平则稍低于 组，差异无显著性（）。（珋 ，）（）（），；，（）有氧间歇运动对大鼠骨骼肌病理学形态的影响光学显微镜下，组大鼠骨骼肌形态为：纵切片可观察到骨骼肌细胞排列整齐，肌膜完整、清晰、明暗相间的横纹肌清晰可见，肌膜下的细胞核，大小正常，呈扁椭圆形，无明显水肿、断裂或萎缩；横切片可见肌细胞大小正常，呈多角形巢形分布（图 ）。组的形态则为：肌核增多，大小形态异常，横纹模糊消失，肌节出现节断性损伤、部分肌纤维有溶解等现象。与 组相比，组上述病理症状均有一定的修复，肌核排列渐趋整齐、肌膜较完整等（图 ）。（），有氧间歇运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡率的影响 法，是一种常用的检测细胞凋亡的方法。实验中的蓝色荧光代表细胞核，绿色荧光代表断裂或凋亡的 。如图 所示，显微镜下可见，组凋亡的骨骼肌细胞不明显，检出其细胞凋亡率为 。组和 组均可见凋亡的骨骼肌细胞，且荧光强度明显增强，其细胞凋亡率分别为 和 ；与 组相比，两组细胞凋亡率明显增多（）。与 组相比，组细胞凋亡率明显降低（）。有氧间歇运动对大鼠骨骼肌组织 相关信号蛋白表达的影响如图 和表 所示，与 组相比，、组骨骼肌 、蛋白表达水平显著升高（均 ）。各组大鼠骨骼肌中 总量之间没有显著差异。与 组相比，组的 水平显著降低（）。与 组相比，组骨骼肌组织 、表达显著降低（或 ），该组 水平显著增加（）。（），（珋 ，）（珋 ，），；，讨论骨骼肌是 型糖尿病慢性高血糖损害的主要靶器官之一。本研究结果显示，糖尿病模型大鼠已出现肌纤维变性，明暗相间的横纹不清晰，肌节出现节断性损伤、部分肌纤维有溶解等骨骼肌病变现象，与以往观察结果相似 ，。早有报道表明，肌纤维细胞凋亡可能与糖尿病骨骼肌病变密切相关，在树闙糖尿病模型研究中，发现其存在明显的肌组织线粒体损伤和细胞凋亡前状态 。研究指中国应用生理学杂志，（）出，在骨骼肌处于损耗性的分解代谢水平时，细胞凋亡信号至关重要并先于蛋白质降解发生，已证明有很多不同的凋亡介质参与其中。半胱氨酸天冬氨酸蛋白 酶 （，）是用于反映细胞凋亡的公认有效指标。本研究利用 荧光染色和 方法分别检测模型组骨骼肌细胞凋亡率和活化凋亡蛋白酶（）表达的结果表明，两种检测方法显示的实验结果趋势相一致，表现为细胞凋亡率明显升高和 表达明显增加。这进一步表明细胞凋亡参与糖尿病骨骼肌病变的发生 ，。也说明骨骼肌内细胞凋亡过度增加可能导致骨骼肌损伤，引起肌质量下降。有氧间歇运动在显著减少骨骼肌细胞凋亡的同时，也改善糖尿病引起的骨骼肌形态损伤和肌量减少。间歇有氧运动干预能通过抑制细胞凋亡来改善糖尿病骨骼肌病变，但其作用机制仍需进一步研究。锌指结构的转录因子 是 样转录因子家族中的一员，在许多生物过程中起重要而关键作用，包括细胞的增殖、分化、凋亡等。研究证实，一线降糖药物二甲双胍的降糖作用可通过降解和下调 的表达来实现 。在肝脏中特异性剔除 ，可通过降低糖异生和下调氨基酸降解酶基因表达，改善糖尿病小鼠高血糖状态 。进一步研究发现，在糖尿病实验模型中小鼠血糖浓度的上升可引起肌肉质量的降低，而肌肉中 蛋白在该现象中起重要作用 ，这提示 蛋白有可能是高血糖导致肌肉缺失的一个重要机制 。因此进一步研究 在糖尿病肌肉组织中的作用与调控将有助于阐明糖尿病骨骼肌等慢性代谢性疾病的发生机制及其防治新方法。以往研究结果表明，对所有细胞的蛋白质合成有调控作用，其磷酸化水平提高可以促进骨骼肌细胞增殖，维持骨骼肌的质量 ，。是 蛋白的负性调控因子，可通过调控相关基因表达，抑制 信号活性而减少肌肉蛋白的合成 ，引起肌肉损失。以上说明，信号蛋白表达变化与糖尿病骨骼肌病变关系密切。调节 信号蛋白表达，有可能改善和延缓糖尿病骨骼肌病变的发生。而至目前为止，有关 信号蛋白与糖尿病骨骼肌病变相关方面的研究报道甚少。运动能防治糖尿病骨骼肌病变，已得到广泛证实 。本研究实验结果显示，间歇运动后 蛋白表达减少，磷酸化 和 水平上升，肌纤维变性、坏死等现象明显好转，腓肠肌湿重 体重比值增加，提示间歇运动后 蛋白表达变化与糖尿病骨骼肌病变的改善密切相关，运动可能通过影响 相关蛋白表达变化达到改善糖尿病所致骨骼肌损伤的作用。本研究表明，运动能通过减少细胞凋亡改善糖尿病致骨骼肌病变。和 蛋白均被证实其在多种细胞中调控细胞凋亡。如：研究发现，通路活化在糖尿病小鼠坐骨神经中被明显抑制，其表现为磷酸化 显著减少，同时揭示其介导坐骨神经细胞凋亡增加 。在体外培养的糖尿病患者足细胞研究结果已证实其表达变化可引起足细胞凋亡，并揭示其参与地塞米松调控足细胞损伤的作用机制 。但目前少见有 表达变化与糖尿病骨骼肌细胞凋亡方面的研究报道。结合以上研究发现和本实验结果推测，糖尿病高血糖状态下可增加骨骼肌 蛋白表达，表达增多的 一方面可能通过抑制 活性，加速肌肉蛋白的分解；另一方面可能与 协同促进骨骼肌细胞凋亡的发生，引起骨骼肌损伤和肌量减少；而有氧间歇运动能通过下调 蛋白表达，提高磷酸化 水平，活化 通路，继而可能减少 介导的细胞凋亡，从而发挥改善糖尿病骨骼肌病变和平衡维持骨骼肌肌量的作用。这也提示，保持骨骼肌肌量，维持健康骨骼肌可能是防治糖尿病骨骼肌病变的主要措施 。然而具体机制仍有待进一步研究。要说明的是，本实验的间歇运动虽不能在 周的有限时间内把 组的血糖恢复到正常水平，但能提高其胰岛素水平，改善胰岛素抵抗。提示，糖尿病是一个持续进展性疾病，运动是慢病良药，糖尿病患者需坚持长期有规律的运动，如有氧间歇运动。由此可见，在本实验糖尿病状态下，信号相关蛋白表达变化可能与糖尿病致骨骼肌病变的发生密切相关；有氧间歇运动改善糖尿病大鼠骨骼肌病变，其原因可能是通过有效调节 相关蛋白表达，减少骨骼肌细胞凋亡损伤实现。信号蛋白有可能成为运动改善糖尿病骨骼肌病变的关键作用靶点。【参考文献】，：，（），（）：，（）：李丽，朱伟，魏盟，等 样因子 多功能转录因子的功能研究 医学综述，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：朱洪竹，朱梅菊，张莹有氧运动联合螺旋藻多糖对糖尿病大鼠学习记忆能力的影响及其机制 中国应用生理学杂志，（）：，：侯改霞，习雪峰，刘倩倩，等有氧间歇运动对 型糖尿病大鼠心肌线粒体自噬的影响 中国病理生理杂志，（）：项静燕，赵玉武，周健糖尿病大鼠骨骼肌病变发病机制初步探讨 上海医学，（）：，：蒙碧辉，刘红，梁莹，等型糖尿病树闙骨骼肌病变及其发病机制 中华糖尿病杂志，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：王继，杨中亚，张龙，等 在有氧运动改善 型糖尿病大鼠骨骼肌萎缩中的作用 中国组织工程研究，（）：朱琳 通路对糖尿病雪旺氏细胞凋亡影响的研究 河北：河北医科大学，窦曹帅转录因子 通过下调 保护足细胞细胞的机制研究 广东：华南理工大学，中国应用生理学杂志，（）