LncRNA-MIAT靶向miR-214-3p调控RA-FLS细胞生物学功能机制研究.pdf

Mod Diagn Treat现代诊断与治疗2023 Jul 34渊14冤LncRNA-MIAT 靶向 miR-214-3p 调控 RA-FLS 细胞生物学功能机制研究易金萍1袁黄自坤2袁罗清2袁余瑾2袁邹海虹2袁蔡庆2袁秦奇伟2袁郑悦3袁谭吉3渊1.南昌大学第一附属医院/赣江新区人民医院检验科曰2.南昌大学第一附属医院检验科曰3.南昌大学公共卫生学院袁江西 南昌 330000冤摘要院目的研究 LncRNA-心肌梗死相关转录本渊MIAT冤靶向 miR-214-3p 调控 RA-FLS 细胞生物学功能机制遥 方法选取我院 2021 年 1 月至 2022 年 12 月收治的 60 例类风湿关节炎渊RA冤患者袁所有受试者均拟行膝关节手术治疗袁体外培养 RA-FLS 细胞袁分别提取各患者的样本细胞袁均分成 3 组袁分别为 MIAT 过表达组尧shRNA 沉默组和对照组各 60 例遥 构建 MIAT 过表达尧shRNA 沉默及对照慢病毒载体袁包装慢病毒袁分别转染 RA-FLS 细胞袁检测 RA-FLS 细胞增殖尧凋亡尧侵袭尧迁移及细胞因子分泌的影响遥 结果MIAT 过表达组 LncRNA-MIAT 高于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组 LncRNA-MIAT 低于对照组曰MIAT 过表达组 miR-214-3p 表达低于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组 LncRNA-MIAT 高于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥MIAT 过表达组 RA-FLS 细胞增殖率尧迁移细胞数尧侵袭细胞数低于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组细胞增殖率尧迁移细胞数尧侵袭细胞数高于对照组曰MIAT 过表达组细胞凋亡率高于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组细胞凋亡率低于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥 MIAT 过表达组 IL-1茁尧IL-6 及 TNF-琢 水平均低于 shRNA 沉默组尧对照组袁且 shRNA 沉默组 IL-1茁尧IL-6 及 TNF-琢 水平均高于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥 结论 LncRNA-MIAT 靶向结合 miR-214-3p袁进而调控 RA-FLS 细胞的增殖尧迁移以及侵袭遥关键词院类风湿关节炎曰心肌梗死相关转录本曰miR-214-3p曰生物学功能中图分类号院R446.6文献标志码院B文章编号院1001轧8174渊2023冤14轧2142轧02心肌梗死相关转录本渊Myocardial infarction-as鄄sociated transcription袁MIAT冤是一种在 2006 年首次发现的保守的哺乳动物 lncRNAs袁在细胞核内表达的一个 lncRNA袁其位于人类染色体 22q12.1袁长度为30051bp袁它可与蛋白 NONO 相互作用袁促进了核内旁斑的形成咱1-3暂遥 MIAT 的具体功能尚未完全清楚袁但已有报道 MIAT 参与多种疾病的病理生理过程袁然而关于其在 RA 中的具体作用机制尚未彻底阐明遥鉴于此袁本文通过研究 LncRNA-MIAT靶向 miR-214-3p 调控 RA-FLS 细胞生物学功能机制遥 报道如下遥1资料与方法1.1一般资料选取我院风湿免疫科 2021 年 1 月至 2022年 12月收治的 60例 RA 患者遥 其中男 37例尧女 23 例曰年龄 34耀78渊50.94依5.28冤岁曰体质指数 18耀32渊23.51依2.05冤kg/m2曰接受文化教育年限 5耀16渊9.41依1.29冤年遥 入组人员均已签同意书袁本研究经我院医学伦理委员会审核批准遥1.2纳入与排除标准渊1冤所有受试者均经病理检查确诊为 RA遥 渊2冤均拟行外科手术治疗遥 渊3冤年龄逸18 岁遥 渊4冤入组前并未接受任何相关治疗遥 排除标准院渊1冤合并恶性肿瘤者遥 渊2冤肝尧肾尧肺等脏器功能严重异常者遥 渊3冤神志异常者遥1.3研究方法1.3.1标本的收集和人滑膜成纤维细胞的制备采集 RA 患者的膝/髋关节滑膜组织袁迅速移至实验室超净台袁无菌条件下剔除脂肪组织袁分离和体外培养人RA-FLS 细胞遥 将滑膜组织剪碎成 1耀2 mm3袁加入浓度为10 mg/mL 的域型胶原酶袁于 37益 5%CO2培养箱中孵育消化 4 h袁200 目筛网过滤后离心收集细胞遥将细胞维持在 10%胎牛血清渊FBS冤的 DMEM 培养基袁于 37益 5%CO2培养箱中培养遥 使细胞贴壁遥 待细胞成长到 85%袁以 25%胰蛋白酶消化细胞遥细胞进行传代渊1颐2冤袁传代到第三代到第五代之间时备用袁分别提取各患者的样本细胞袁均分成 3 组袁分别为 MIAT 过表达组渊60例冤尧shRNA 沉默组渊60例冤尧对照组渊60例冤遥1.3.2MIAT-shRNA 载体的构建并将验证干扰效果最好的 MIAT 的 siRNA 序列作为后续研究干扰序列袁以 pSico 质粒为载体构建 MIAT-shRNA 载体遥 此质粒转染后能够在细胞中干扰 MIAT 表达遥1.3.3MIAT 过表达载体构建将 MIAT 全长序列克隆构建到质粒载体 lncRNA 表达载体 pLCDH-L 上袁鉴定成功后将其命名为 pLCDH-L-MIAT袁此质粒转染后能够在细胞中高表达 MIAT遥1.3.4慢病毒包装常规培养 293T细胞袁取目的质粒尧包装质粒及包装质粒进行共转染袁包装病毒遥 设置框架质粒慢病毒对照遥浓缩后的病毒液分装后冻存于-80益备用遥 慢病毒滴度采用逐孔稀释滴度测定法进行遥 采用包装成功的慢病毒感染 RA-FLS 细胞袁验2142窑窑Mod Diagn Treat现代诊断与治疗2023 Jul 34渊14冤2.3各组细胞因子表达水平比较MIAT 过表达组IL-1茁尧IL-6 及 TNF-琢 水平均低于 shRNA 沉默组尧对照组袁且 shRNA 沉默组 IL-1茁尧IL-6 及 TNF-琢 水平均高于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥 见表 3遥3讨论在前期研究中袁通过生物信息学预测袁发现 MI鄄AT 序列中存在与部分 miRNA 分子互补结合的MREs遥 RT-qPCR 分析 RA 患者滑膜组织中 MIAT 以及潜在 miRNA 之间表达的相关性袁结果显示袁MIAT高表达袁而 miR-214-3p 低表达袁且两者表达呈负相关袁提示 miR-214-3p 可能是 MIAT 调控的靶标遥 已有的报道指出袁miR-214-3p 在多种肿瘤中表达下调袁过表达 miR-214-3p 可显著抑制肿瘤发生发展咱4暂遥目前袁尚未见有关 miR-214-3p 在 RA-FLS 细胞中的功能研究报道遥本文结果显示袁MIAT 过表达组 LncRNA-MIAT高于shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组 LncR鄄NA-MIAT 低于对照组渊P约0.05冤曰MIAT 过表达组 miR-214-3p 表达低于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA组别nLncRNA-MIATmiR-214-3pMIAT 过表达组shRNA 沉默组对照组FP6060605.34依0.681.40依0.213.66依0.5819.4820.0000.94依0.173.09依0.422.14依0.2514.1950.000表 1各组 LncRNA-MIAT尧miR-214-3p 表达情况比较渊x依s冤组别n细胞增殖率渊%冤细胞凋亡率渊%冤迁移细胞数渊个冤侵袭细胞数渊个冤MIAT 过表达组shRNA 沉默组对照组FP60606042.33依8.6088.47依15.9277.62依12.5812.7840.00035.62依3.2710.48依1.7416.24依2.3111.6720.000162.55依20.94468.17依52.79356.28依45.399.4870.00062.62依10.36246.71依31.48181.50依23.4210.5230.000表 2各组 RA-FLS 细胞增殖尧凋亡尧侵袭尧迁移情况比较渊x依s冤证其过表达或沉默 MIAT 效果遥1.3.5RA-FLS 细胞增殖检测RA-FLS 细胞接种于培养板袁将 MIAT 过表达尧沉默及对照慢病毒转染 RA-FLS 细胞袁转染不同时间点采用 CCK-8 法检测 RA-FLS 细胞增殖活性的变化遥1.3.6RA-FLS 细胞凋亡检测RA-FLS 细胞接种于培养板袁将 MIAT 过表达尧沉默及对照慢病毒转染RA-FLS 细胞袁转染不同时间点采用 AnnexinV/7-AAD 凋亡试剂盒上流式细胞仪检测 RA-FLS 细胞凋亡情况遥1.3.7侵袭与迁移试验RA-FLS 细胞接种于培养板袁将 MIAT 过表达尧沉默及对照慢病毒转染 RA-FLS 细胞袁经消化尧洗涤尧重悬尧计数袁把细胞悬液加入到Transwell 小室的上部袁下部的小室加入 10%FBS的培养基渊对于侵袭试验院在 Transwell 小室的聚碳酸酯膜上涂一层基质胶袁即 Matrigel 胶袁于 37益胶固定袁其余同迁移试验冤袁将 Transwell 小室置于 5%CO2培养箱中 37益培养 24 h遥 吸去 Transwell 上室里的培养液袁PBS 洗涤袁用棉签轻轻拭去上室中 Matrigel 基质胶以及残留细胞袁 预冷 4%多聚甲醛固定袁PBS 洗涤袁1%结晶紫染色袁计数并拍照遥 计数进入 Transwell下室的细胞数量直接反映了口腔鳞癌细胞的迁移尧侵袭能力遥1.3.8RA-FLS 细胞分泌炎性因子检测 RA-FLS 细胞接种于培养板袁将 MIAT 过表达尧沉默及对照慢病毒转染 RA-FLS 细胞袁采用 ELISA 检测上清液中细胞因子 TNF-琢尧IL-1茁尧IL-4尧IL-6尧IL-8尧IL-10 的水平遥1.4统计学处理数据采用 SPSS 24.0 统计学软件进行处理遥 计量资料采用渊x依s冤表示袁行 t 检验曰计数资料采用n渊%冤表示袁行 字2检验遥 P约0.05 表示差异有统计学意义遥2结果2.1各组 LncRNA-MIAT尧miR-214-3p 表达情况比较MIAT 过表达组 LncRNA-MIAT 高于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组 LncRNA-MIAT 低于对照组曰MIAT 过表达组 miR-214-3p 表达低于shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组 LncRNA-MIAT高于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥见表 1遥2.2各组 RA-FLS 细胞增殖尧凋亡尧侵袭尧迁移情况比较MIAT 过表达组 RA-FLS 细胞增殖率尧迁移细胞数尧侵袭细胞数低于 shRNA 沉默组尧对照组袁而shRNA 沉默组细胞增殖率尧迁移细胞数尧侵袭细胞数高于对 照 组 曰MIAT 过 表 达 组 细 胞 凋 亡 率 高 于shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组细胞凋亡率低于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥见表 2遥组别nIL-1茁IL-6TNF-琢MIAT 过表达组shRNA 沉默组对照组FP60606042.30依5.2671.77依10.3964.31依9.1114.2580.00050.03依4.2785.19依9.6776.23依8.4816.2730.00041.72依3.1886.25依10.0269.12依9.6210.8640.000表 3各组细胞因子表达水平比较渊x依s袁pg/mL冤2143窑窑Mod Diagn Treat现代诊断与治疗2023 Jul 34渊14冤EBV-DNA 载量尧TLR7mRNA尧ADA 及 HLA-G对儿童传染性单核细胞增多症的诊断效能分析李芳渊兰州市西固区人民医院袁甘肃 兰州 730060冤摘要院目的探究 EBV-DNA 载量尧TLR7mRNA尧腺苷脱氨酶渊ADA冤及白细胞抗原-G渊HLA-G冤对儿童传染性单核细胞增多症的诊断效能遥 方法选取 2018 年 10 月至 2022 年 10 月我院收治的 100 例传染性单核细胞增多症患儿作为观察组袁其中 EBV-DNA 高载量患儿 53 例袁低载量患儿 47 例遥 另选取同期在医院体检的 120 例健康儿童作为对照组遥所有研究对象均接受 EBV-DNA 载量尧TLR7mRNA尧ADA尧HLA-G 检测遥以临床诊断为金标准院渊1冤出现淋巴结肿大尧发热尧肝脾肿大尧咽峡炎等症状中的 3 项遥渊2冤抗 EBV-CA-IgM 和抗 EBV-CA-IgG 抗体阳性袁且抗 EBV-NA-IgG 阴性曰抗EBV-CA-IgM 阴性袁但抗 EBV-CA-IgG 抗体阳性袁且为低亲合力抗体遥 同时满足以上 2 条即可遥 比较观察组和对照组EBV-DNA 载量尧TLR7mRNA尧ADA尧HLA-G袁高载量组和低载量组 TLR7mRNA尧ADA尧HLA-G 及诊断效能遥 结果观察组 EBV-DNA 载量尧TLR7mRNA尧ADA尧HLA-G 高于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤遥 高载量组 TLR7mRNA尧ADA尧HLA-G 高于低载量组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤曰EBV-DNA 载量尧TLR7mRNA尧ADA尧HLA-G 联合检测诊断沉默组 LncRNA-MIAT 高于对照组渊P约0.05冤遥这提示了 NEAT 可能对 miR-214-3p 具有一定的靶向抑制作用袁通过过表达 NEAT袁可能对 miR-214-3p 产生抑制作用袁进而在 RA 发生尧发展过程中起着至关重要的作用遥 此外袁MIAT 过表达组 RA-FLS 细胞增殖率尧迁移细胞数尧侵袭细胞数低于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组细胞增殖率尧迁移细胞数尧侵袭细胞数高于对照组渊P约0.05冤曰MIAT 过表达组细胞凋亡率高于 shRNA 沉默组尧对照组袁而 shRNA 沉默组细胞凋亡率低于对照组渊P约0.05冤遥 提示了 NEAT异常表达会直接影响 RA-FSL 细胞生物学功能袁即抑制细胞增殖尧迁移以及侵袭袁促进细胞凋亡遥 考虑原因袁NEAT 可通过表观遗传以及转录调控等多个方面对靶基因实施调控袁如核内 NEAT 往往是通过调节信使 RNA 间接控制基因转录袁细胞之内的NEAT 则是通过影响信使 RNA 稳定性或 miRNA 活性调控基因表达遥 有研究表明咱5-7暂袁NEAT 可直接作用于 Bcl-2 以及 P53 等细胞凋亡相关蛋白中袁间接实现对细胞生物学功能产生调节作用袁这为本研究提供了佐证遥 而 miR-214-3p 作为非编码 RNA 家族成员之一袁可能通过调控下游靶基因或蛋白的表达袁或调控 Wnt/catenin 信号通路活性袁从而参与免疫反应过程袁介导组织的损伤遥本文结果还显示了袁MIAT 过表达组 IL-1茁尧IL-6 及 TNF-琢 水平均低于 shRNA沉默组尧对照组袁且 shRNA 沉默组 IL-1茁尧IL-6 及TNF-琢 水平均高于对照组渊P约0.05冤遥 分析原因袁可能是 NEAT 通过负调控 miR-214-3p 的表达袁进而对下游靶基因表达产生影响袁从而影响炎症细胞因子的大量合成尧分泌袁促进疾病的发生尧发展咱8-10暂遥综上所述袁LncRNA-MIAT 可通过靶向结合miR-214-3p袁进而调控 RA-FLS 细胞的增殖尧迁移以及侵袭袁有望成为 RA 诊治的新靶点遥参考文献咱1暂苏文晓,卢珺,甘晓雯,等.基于 LncRNA MIAT/miR-384-5p 研究九龙藤黄酮抑制自噬抗心肌缺氧损伤的作用机制咱J暂.中草药,2022,53(18):5701轧5711.咱2暂付长龙,谢新宇,邱志伟,等.基于 lncRNA NEAT1 与 Nrf2/ARE 通路研究荣筋拈痛方延缓膝骨关节炎软骨退变作用机制咱J暂.康复学报,2022,32(4):332轧337.咱3暂蔡梅芝,卢宝全,吴秀玲,等.长链非编码 RNA 核富集转录本 1 通过靶向微小 RNA-761 对缺氧/复氧大鼠星形胶质细胞损伤的影响咱J暂.解剖学报,2022,53(5):571轧577.咱4暂李险波,张志强,韩小勇,等.LncRNA NEAT1 通过调控 miR-124-3p对食管鳞状细胞癌细胞迁移尧侵袭的影响咱J暂.国际检验医学杂志,2022,43(22):2722轧2727.咱5暂卞龙艳,庄敏,李姝,等.长链非编码 RNA-心肌梗死相关转录本对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡和氧化应激的调控作用咱J暂.眼科新进展,2021,41(4):317轧322.咱6暂魏晓颖,王军涛,田景霞,等.微 RNA-214 靶向性别决定区 Y-box 4对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖凋亡的影响咱J暂.中华风湿病学杂志,2021,25(7):455轧460.咱7暂余晓明,袁雪凌,孟昊业,等.骨性关节炎患者膝关节软骨及软骨下骨中 miR-214 的表达咱J暂.解放军医学院学报,2015,36(11):1131轧1133.咱8暂任泰超,肖鹏.微小 RNA-214-3p 介导神经营养酪氨酸激酶受体 2型通路调节血管内皮生长因子旁分泌在骨关节炎发展中的作用咱J暂.中华实验外科杂志,2022,39(1):116轧119.咱9暂李合,黄亮,田由京,等.miR-214-3p 通过靶向 MFN2 诱导胃癌细胞线粒体分裂及凋亡的机制咱J暂.中国老年学杂志,2023,43(12):2961轧2967.咱10暂曹春.慢性心力衰竭患者血浆外泌体 miR-214-3p 和 miR-184 的表达及意义咱J暂.河北医药,2021,43(2):246轧249.收稿日期院2023轧04轧212144窑窑