HGF_c-Met信号通路与小鼠早期卵泡发育的相关性研究.pdf

实用医学杂志 2023年第39卷第20期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.20HGF/c-Met信号通路与小鼠早期卵泡发育的相关性研究黎明星1，2 李卓娴1 李康梅1 陈秀榕1 周艳平1 黄愉淋1，2白琳1 吴展帅1，2 夏猛1 何国珍11广西中医药大学基础医学院（南宁 530200）；2广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室（南宁 530200）【摘要】目的通过检测肝细胞生长因子（HGF）及其受体（c-Met）在早期小鼠卵巢组织的表达情况，探讨HGF/c-Met信号通路在小鼠早期卵泡发育的相关性，并通过生物信息学分析HGF/c-Met通路的生物学过程及涉及的细胞内信号通路，为后续研究HGF/c-Met通路调节早期卵泡发育的分子机制打下基础。方法选用昆明小鼠以雌雄（2 1）合笼，收集生后3、7、14、21 d卵巢，采用免疫组学、蛋白免疫印迹分别检测卵巢HGF和c-Met蛋白表达及表达水平；实时荧光定量PCR检测卵巢HGF、c-Met 的mRNA表达水平。结果HGF及c-Met蛋白在3、7、14、21 d卵巢中均有表达，且表达量随着小鼠日龄增长而增加（P 0.05），HGF、c-Met的mRNA水平也呈现相同的趋势（P 0.05）；生物信息学分析发现HGF/c-Met通路涉及了多种生物学过程及PI3K/AKT等信号通路。结论HGF/c-Met通路参与小鼠早期卵泡发育，并可能通过细胞内信号通路PI3K/AKT调控原始卵泡启动及卵泡发育的过程。【关键词】肝细胞生长因子；肝细胞生长因子受体；早期卵泡发育【中图分类号】R321.1Role of hepatocyte growth factor（HGF）/cMet signaling pathway in early follicular development in mice LI Mingxing*，LI Zhuoxian，LI Kangmei，CHEN Xiurong，ZHOU Yanping，HUANG Yulin，BAI Lin，WU Zhanshuai，XIA Meng，HE Guozhen.*Basic Medical College，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China；*Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating HighIncidence Infectious Diseases with Integrative Medicine，Nanning 530200，China Corresponding author：HE Guozhen Email：【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of hepatocyte growth factor and its receptor（c-Met）（HGF/c-Met）signaling pathway in early follicular development in mice via detecting the expression of HGF/c-Met in early mouse ovarian tissue and then analyze the biological process of HGF/c-Met signaling pathway and its possible involvement in intracellular signaling pathways by using bioinformatics for the purpose of further studying the molecular mechanism of the signaling pathway in the early follicle development.Methods Thirty-five female Kunming mice and 15 male ones were fed in 15 cages with the female-to-male ratio of 2 1.The ovaries of mice at 3，7，14 and 21 days after birth were collected.Immunohistochemical staining and Western blotting were applied to detect the expression levels of HGF and c-Met protein in the ovarian tissues.Quantitative Real-time PCR（q-PCR）was used to detect the expression levels of HGF and C-Met mRNA in the early ovarian tissues of mice.ResultsHGF and c-Met proteins were expressed in the ovarian tissues of the mice at 3，7，14 and 21 days，presenting an increasing trend with the increase of age by day（P 0.05）.The mRNA levels of HGF and c-Met also showed the same trend（P 0.05）.Bioinformatics analysis revealed that the HGF/c-Met signaling pathway involved in a variety of biological processes and signaling pathways such as PI3K/AKT.ConclusionsHGF/c-Met signaling pathway is involved in early follicular development in mice.It may regulate primal follicular initiation and follicular development through intracellular signaling pathway PI3K/AKT.【Key words】HGF；c-Met；early follicular development基 础 研 究doi：10.3969/j.issn.1006-5725.2023.20.002基金项目：国家自然科学基金项目（编号：81960794）；广西自然科学基金项目（编号：2020GXNSFBA159064）；广西中青年教师科研基础能力提升项目（编号：2019KY0320，2021KY0320）；广西中医药大学引进博士科研启动基金项目（编号：2018BS007，2018BS015）；广西中医药大学高层次人才培育创新团队资助项目（编号：2022B006）；广西中医药大学第二批“岐黄工程”高层次人才团队培育项目（编号：2021001）；广西中医药大学大学生创新创业训练计划项目（编号：S202110600092）；广西中医药大学大学生科研训练课题（编号：2022DXS04）通信作者：何国珍 E-mail：2566实用医学杂志 2023年第39卷第20期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.20女性不孕症现已成为全球第三大疾病，其中女性卵源性不孕的病因主要为卵泡过度启动引发的多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）以及原始卵泡启动障碍导致的卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）或卵巢功不全（premature ovarian insufficiency，POI）1。据统计，约有1/100的40岁以下、1/1 000的20 30岁及1/10 000的20岁以下的妇女因卵巢早衰而提前绝经2。原始卵泡启动募集是卵泡发生的最关键环节，卵泡从受抑制的原始卵泡进入生长卵泡的过程称为原始卵泡启动募集或原始卵泡到初级卵泡的转变，该过程直接影响女性一生中能提供的卵子数。一旦原始卵泡池耗竭或启动募集障碍，可引起卵巢早衰或卵巢功能低下导致不孕。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）为多肽生长因子，其受体为c-Met（HGF-receptor，也称c-Met），具备自主磷酸化活性3。HGF表达于卵巢中卵泡周围的间质细胞，可由卵泡膜细胞分泌4，c-Met 则多表达于上皮来源细胞，二者特异性结合后，可激发多条信号通路，发挥多种生物活性，参与调节胎盘滋养细胞、卵泡膜细胞、颗粒细胞等的发育与卵泡的成熟5。研究发现4HGF 和 c-Met 的 mRNA 在 2 d的小鼠卵巢中表达，且 HGF 促进颗粒细胞增殖、腔前和早期腔卵泡的数量增加，同时HGF也可刺激FSH受体的表达，提示HGF 可从多方面调控卵泡细胞功能，共同促进卵泡发育，而HGF/c-Met信号通路对早期卵泡发生的影响趋势鲜见报道。本课题组从HGF/c-Met信号通路为切入点，研究出生后不同鼠龄的小鼠卵巢中HGF/c-Met信号通路分子表达情况以及该信号通路的生物信息学分析，探讨HGF/c-Met信号通路与小鼠早期卵泡发育相关性和相关的分子机制，为后续研究HGF/c-Met信号通路启动原始卵泡募集的具体作用机制打下实验基础。1材料与方法1.1动物性成熟昆明（KM）雌性小白鼠 30 只，雄性小白鼠15只，由广西中医药大学动物实验中心提供（证号：2019-0004），饲养于广西中医药大学动物实验中心，恒温 23 25 C，12 h 光照/12 h黑暗交替，自由采食饮水。1.2主要试剂及仪器HGF抗体（索莱宝科技有限公司，货号：K002383P）；c-Met抗体（万类生物科技有限公司，货号：WL01758）；辣根过氧化物酶（HRP）-羊抗兔IgG（美国abcam科技有限公司，货号：ab6721）；多聚甲醛（上海国药集团，批号：20170413）；Trizol regent（solarbio，R1100）；RM2255型轮转式切片机（上海Leica仪器有限公司）；低温离心机（eppendorf公司）；超微量核酸检测仪（遂真公司）；Veriti 96-Well Thermal Cycler（Applied Biosystems 公司）；7500 实时荧光定量 PCR 系统（Applied Biosystems公司）。1.3小鼠卵巢组织采集雌性昆明小白鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）保证同步发情，48 h 后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）促排卵，以2 1比例将雌鼠与性成熟雄鼠合笼，24 h后分笼。待母鼠生产后将胎鼠饲养至所需日龄（3、7、14、21 d）后处死，分离小鼠卵巢，存于-80 冰箱。1.4免疫组织化学染色法检测4%多聚甲醛固定小鼠卵巢，取材、脱水、石蜡包埋并制成腊块。石蜡切片后脱蜡水化，EDTA-TRIS修复液进行抗原修复，PBS洗3次，3%5%H2O2-水（甲醇）溶液封闭内源性过氧化酶，PBS 洗 3 次，一抗（20 g/mL）覆盖切片，4 孵育过夜；PBS 洗 3 次，1 100 生物素标记的羊抗兔抗血清 37 孵育 20 min，PBS 洗3次，1 400二抗4 孵育60 min，PBS洗3次；DAB显色，苏木精复染，PBS返蓝，梯度酒精脱水；二甲苯透明；中性树胶封固。显微镜下读片，黄色为阳性表达。采用IPP 6.0（Image Pro Plus）测量HGF、c-Met蛋白表达，分析灰度值。1.5Western blotting检测RIPA裂解小鼠卵巢，BCA法测蛋白含量。等量的蛋白质提取物在5样品缓冲液中热变性，10聚丙烯酰胺凝胶上分离后转移到PVDF膜上。封闭后，一抗HGF（1 1 000），-actin（1 10 000），c-Met（1 1 500）孵育，4 摇床过夜。TBST清洗，二抗孵育。TBST清洗，显影，将目的蛋白条带与-actin条带的灰度比值作为各目的蛋白的相对表达水平。1.6qPCR 检测Trizol 裂解小鼠卵巢，混匀，加入50%体积的氯仿，离心，取上层水相，加入等体积异丙醇，离心得到RNA沉淀，70%酒精洗涤、晾干、无菌无酶水溶解，RNA浓度及纯度检测、逆转录，所得 cDNA 干-20 保存。Real-Time PCR 扩增：逆转录产物cDNA作为扩增反应的模版，加入目的基因与内参引物进行扩增；扩增条件：预变性95，30 s；变性 95，5 s；退火温度 60，30 s；延伸72，15 s；循环次数40个。引物序列：HGF上游引物 5-TGATTCTTTCAGCCCGGCAT-3，下游引物 5-CGACATGAAGCAGGAGGAGG-3，c-Met 上游引物5-GCTCTGGAGGACAAGACCAC-3，下游引物 5-GGTGGGAGCCTTCATTGTGA-3，内参-actin上游引物 5-CAGCCTTCCTTCTTGGGTAT-3，下游引物 5-TGGCATAGAGGTCTTTACGG-3。数据采2567实用医学杂志 2023年第39卷第20期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.20用 2-CT 法进行分析，公式为：Ct=（Ct gene-Ct-actin），Ct=（Ct treat-Ct control）。1.7HGF 与 cMet 的共同通路分析将 HGF 及c-Met 输入于 NCBI 数据库（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索并获得其对应 Gene ID 后，将 HGF、c-Met 依托于 DAVID 数据库（https：/david.ncifcrf.gov/）检索，将物种限定为Homo sapiens，进行基因本体（Gene Ontology）分析，其中涵括细胞组分（Cell Components）、分子功能（Molecular Function）、生物过程分析（Biological Process），同时进行了KEGG信号通路富集分析。相关结果可视化依托于微生信平台（http：/ SPSS 19.0统计软件。数据以（x s）表示，组间比较采用单因素方差分析，同组前后比较采用配对样本t检验，组间比较采用独立样本t检验。以P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1HGF和cMet蛋白在小鼠卵巢中的空间和时间表达规律在3、7、14、21 d的小鼠卵巢中HGF及c-Met均有不同程度的表达，并具有一定空间和时间表达规律。2.1.1时间表达规律（1）HGF 蛋白表达规律：HGF阳性表达的平均光密度值显示：3、7、14、21 d卵巢中HGF的表达随日龄的增加而升高，且21 d表达量最高，见图1；与3 d相比，7、14、21 d的HGF光密度差异有统计学意义（P 0.05），见表1。（2）c-Met蛋白表达规律：c-Met阳性表达的平均光密度值显示：与HGF相比，c-Met的表达较弱且规律性不如HGF明显，在3、7、14、21 d卵巢中c-Met的表达总体上随日龄增加而升高，也在21 d表达量最高，但在 7 d 内的表达略微降低，见图 1；与 3 d 相比，7、14、21 d 小鼠卵巢 c-Met 的光密度差异有统计学意义（P 0.05），见表1。2.1.2空间表达规律（1）HGF蛋白表达规律：3 d和 7 d 卵巢中主要是原始卵泡，可见早期初级卵泡，HGF主要表达于卵母细胞胞质中，在卵泡细胞和卵泡周围的基质细胞胞质内可见少量表达；14 d原始卵泡数量减少，主要看到的是体积明显较大、卵泡细胞增生至多层的晚期初级卵泡，HGF在卵母细胞胞质内表达显著，卵泡细胞和卵泡周围的基质细胞内表达较 3 d 增强；21 d 仍以晚期初级卵泡为主，开始出现含有卵泡腔、体积更大的次级卵泡，HGF在卵母细胞胞质内的表达相对于14 d更为强烈，且在颗粒细胞和基质细胞内表达增强。（2）c-Met 蛋白表达规律：各日龄小鼠卵巢c-Met与HGF蛋白表达相似，3 d与7 d同样以大量密集的原始卵泡为主，少量的早期初级卵泡，但表达程度明显比同日龄卵巢HGF 的表达弱；14 d主要是体积大且含有较多初级卵泡，表达较3、7 d明显增强，颗粒细胞层内也有明显的表达；21 d中c-Met的表达量最高。2.2HGF和cMet蛋白在早期小鼠卵巢中的表达变化与3 d相比，HGF和c-Met蛋白在7、14、21 d卵巢中表达水平显著提高（P 0.05），并随小鼠日龄的增加而上升，其中以 21 d 表达量最高（P 0.05），见图2。2.3HGF 及 cMet 的 mRNA 在早期小鼠卵巢中的表达变化qPCR结果显示，与3 d相比，HGF和c-Met的mRNA在7、14、21 d卵巢中表达水平显著上升（P 0.05），且随小鼠日龄呈上升趋势，其中以21 d表达量最高，差异最显著（P 0.05），见图3。2.4HGF/cMet的GO富集分析与KEGG通路分析利用DAVID数据库对HGF及c-Met进行了GO功能富集与KEGG通路富集。GO富集分析三大结果中仅有生物过程分析具有差异显著性（P 0.05），包括过氧化氢介导的程序性细胞死亡的负调控（negative regulation of hydrogen peroxide-mediated programmed cell death）、肝细胞生长因子受体信号 通 路（hepatocyte growth factor receptor signaling pathway）、正趋化性（positive chemotaxis）、自噬的负调控（negative regulation of autophagy）、肝脏发育（negative regulation of autophagy）等，见图4，纵坐标所展示为GO功能的具体名称。KEGG富集到16条信号通路，其中15条具有显著差异性（P 0.05），主要包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗通路（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、Rap1信号通路（Rap1 signaling pathway）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）、MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。见图 5，纵坐标所展示为通路的具体名称。3讨论在哺乳动物的卵巢中，原始卵泡不断地被募集到发育卵泡库中。这些卵泡的特征是存在快速增殖的颗粒细胞和出现外层卵泡膜细胞。上皮源性颗粒细胞和间质源性卵泡膜细胞之间的相互作用对卵泡发育的协调至关重要。这些细胞间的相互作用主要是通过卵巢局部产生的各种生长因子调控作用。原始卵泡生长的启动和卵泡发生的早期阶段与促性腺激素无关，即使在垂体切除2568实用医学杂志 2023年第39卷第20期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.20和促性腺激素分泌不足的动物中也可观察到卵泡生长。HGF为间质来源的多效性生长因子，由-链（69 kD）和-链（34 kD）亚基组成。可由卵巢细胞（包括卵泡膜细胞、颗粒细胞等）分泌。c-Met属于受体酪氨酸激酶家族，是一种异源二聚体，由高糖基化的50 kD 亚基和跨膜的145 kD 亚基组成，主要通过二硫键连接6。c-Met 为 HGF 的唯一受体，具备自主磷酸化活性和高亲和力，含细胞外配体结合区、细胞内胞质蛋白激酶结构区以及跨膜螺旋结构7。HGF可能在小鼠卵巢卵泡发育的早期阶段与后继卵泡发育过程中起一定作用，与其受体c-Met在颗粒细胞上的结合导致c-Met活化4。二者结合后形成的HGF/c-Met信号通路可调控原始卵泡发育、颗粒细胞增殖与分化，并通过促进卵母细胞生长、颗粒细胞增殖来调控卵泡闭锁环节，以延缓卵泡退化、闭锁与卵巢衰老8。UZUMCU等9研究表明 HGF/c-Met 信号通路可调控卵泡发ABCDEFGHIJ注：A、E，3 d卵巢；B、F，7 d卵巢；C、G，14 d卵巢；D、H，21 d卵巢；A-D，HGF在3、7、14 d卵巢组织的分布；E-H，c-Met在3、7、14 d卵巢组织的分布；I，HGF 阳性片；J，c-Met 阳性片；O，卵母细胞；TC，膜细胞；GC，颗粒细胞，标尺=100 m图1HGF和c-Met在早期小鼠卵巢组织中的表达位置Fig.1The expression location of HGF and c-Met in early mouse ovarian tissues表1不同日龄小鼠卵巢组织中HGF表达的平均光密度Tab.1The average optical density of HGF expression in ovarian tissue of different days in mice x s日龄3 d7 d14 d21 dHGF平均光密度0.245 8 0.092 420.333 3 0.003 13*0.347 2 0.034 68*0.418 2 0.688 90*c-Met平均光密度0.289 8 0.044 420.259 1 0.018 76*0.327 8 0.075 23*0.330 8 0.069 79*注：与3 d日龄组比较，*P 0.05Day3Day7Day14Day21HGFcMetactinDay3Day7Day14Day21图2早期小鼠卵巢组织中HGF和c-Met蛋白的表达变化Fig.2The expression of HGF and c-Met protein in early mouse ovarian tissue2569实用医学杂志 2023年第39卷第20期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.20育的各个主要阶段，包括类固醇生成、卵泡膜和颗粒细胞的生长以及颗粒细胞的凋亡。此外，HGF/c-Met信号通路参与调控原始卵泡库的激活，对原始卵泡库的维持有重要作用。因此，本研究采用免疫组化、qPCR和WB检测小鼠卵巢 HGF 及 c-Met 的 mRNA 与蛋白表达的位置及水平，结果表明在 3、7、14、21 d 小鼠卵巢组织中均有 HGF 及其受体 c-Met 的表达，且蛋白水平和 mRNA 表达随日龄的增加呈不断增长趋势，在卵母细胞、基质细胞和颗粒细胞均有表达，这与SAHIN等10的研究结果，c-Met在成熟卵母细胞中的表达水平是未成熟卵母细胞的 2 倍相符，表明HGF不仅可以介导卵泡膜细胞和卵巢颗粒细胞的相互作用来促进卵泡发生和卵母细胞的成熟，同时也可以通过旁分泌直接作用在卵母细胞上，卵母细胞本身也可通过自分泌作用来促进卵泡发生以及卵母细胞的成熟。生后3 21 d，是原始卵泡激活启动募集并发育到次级卵泡的阶段，即原始卵泡启动和早期卵泡发育的阶段，结合我们实验结果提示HGF/c-Met通路参与了原始卵泡启动和早期卵泡发育的过程，与早期卵泡发育过程具有一定的相关性。随着卵泡的不断发育，生后 3、7、14、21 d 小鼠卵巢HGF和c-Met的整体水平大致呈不断增长趋势，但表达程度略有不同，这可能与c-Met为HGF的唯一受体，但HGF并非c-Met的唯一配体，且c-Met可不HGFcMET*3 d7 d14 d21 d2.01.51.00.50.0Relative Normalized Expression2.01.51.00.50.0Relative Normalized Expression*3 d7 d14 d21 d 注：与3 d比较，*P 0.05图3早期小鼠卵巢HGF和c-Met的mRNA表达变化Fig.3The expression of HGF and c-Met mRNA in early mouse ovarian tissueBiological processCellular componentMolecular function252015105024681012-log10值Gene count222222222negative regulation of hydrogen peroxidemediated programmed cell deathhepatocyte growth factor receptor signaling pathwaypositive chemotaxisnegative regulation of autophagyliver developmentpositive regulation of transcription from RNA polymerase promoterextracellular regionmembraneidentical protein binding图4GO功能富集分析Fig.4GO functional enrichment analysis2570实用医学杂志 2023年第39卷第20期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.20依赖于 HGF 而被激活相关11。前期实验发现小鼠约在4周龄便有生殖能力，本次实验也证实21 d（3周）卵巢内开始出现次级卵泡，28 d（4周）可发育到成熟卵泡进行排卵而具有生殖能力。卵泡发育阶段分为促性腺激素非依赖时期与促性腺激素依赖时期，前者主要受多种局部卵巢因子和细胞因子等调控，而后者则以下丘脑-垂体-性腺轴调节为主。本实验结果HGF与c-Met的表达随着小鼠日龄的增加而呈不断升高的趋势，进一步说明HGF/c-Met通路参与调控卵泡发育的早期阶段。通过 HGF/c-Met 的通路富集分析结果与相关文献检索分析结合，我们关注到HGF/c-Met所涉及通路中的PI3K-Akt信号通路。PI3K/Akt信号通路是细胞内的信号传导途径，可响应胞外信号而促进代谢、存活、增殖、生长及血管生成。近年来多有研究证实12，PI3K/Akt 信号通路和其下游效应分子所构建而成的通路在卵泡的形成、生成、排卵以及黄体化过程中都发生了变化，并参与并调控了卵母细胞的成熟，PI3K/Akt 通路在卵泡发育及卵母细胞成熟中扮演了重要角色，但具体调控机制仍有待进一步探索。当HGF与c-Met相结合时，会引发c-Met 胞质内的酪氨酸残基出现自身磷酸化，从而激活酪氨酸激酶，最终激活PI3K/Akt等信号通路13。提示HGF/c-Met通路调控卵泡发育的作用可能与PI3K/Akt信号通路的激活密切相关。综上所述，HGF/c-Met 通路可能通过自/旁分泌等途经参与调控了小鼠卵巢的早期卵泡发育过程，尤其是原始卵泡的激活和募集的调控，其具体的细胞内信号转导通路以及与其他卵巢局部因子的相互作用机制或与 PI3K/Akt 信号通路密切相关，为后续研究HGF/c-Met通路启动原始卵泡募集的具体机制打下实验基础，也为阐明女性卵源性不孕的具体机制提供研究基础。【Author contributions】LI Mingxing performed the experiments and wrote the article.LI Zhuoxian performed the experiments and bioinformatics analysis.LI Kangmei and CHEN Xiurong performed the experiments.ZHOU Yanping，HUANG Yulin and BAI Lin performed protein validation.WU Zhanshuai performed Q-PCR.XIA Meng performed project administration and supervision.HE Guozhen reviewed and edited the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.参考文献1 JOHAM A E，TEEDE H J，RANASINHA S，et al.Prevalence of infertility and use of fertility treatment in women with polycystic ovary syndrome：data from a large community-based cohort studyJ.J Womens Health（Larchmt），2015，24（4）：299-307.2 CORDTS E B，CHRISTOFOLINI D M，DOS SANTOS A A，et al.Genetic aspects of premature ovarian failure：a literature reviewJ.Arch Gynecol Obstet，2011，283（3）：635-643.3 李康梅，陈秀榕，戴明明，等.HGF/c-Met信号通路调控生殖细胞发生的研究进展 J.实用医学杂志，2019，35（21）：3413-3417.4 GUGLIELMO M C，RICCI G，CATIZONE A，et al.The effect of hepatocyte growth factor on the initial stages of mouse follicle development J.J Cell Physiol，2011，226（2）：520-529.5 RICCI G，CATIZONE A.Pleiotropic Activities of HGF/c-Met System in Testicular Physiology：Paracrine and Endocrine Implications J.Front 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