FADD基因对宫颈癌细胞凋亡和侵袭及NF-κB信号通路的影响.pdf

基金项目：陕西省重点研发计划项目（）作者简介：康媛，女，生，学士，副主任医师，：收稿日期：基因对宫颈癌细胞凋亡和侵袭及 信号通路的影响康媛，唐阳芳，高雪，程柳，刘玉，马素叶，张玮，王金声，李佩（陕西省第二人民医院妇产科，西安 ；西安医学院第一附属医院妇科；西安市第四医院妇产科；西安新长安妇产医院妇科；通讯作者，：）摘要：目的探讨 相关死亡结构域（）基因对宫颈癌细胞凋亡和侵袭及 信号通路的影响。方法 检测 例宫颈鳞癌患者的癌组织及配对癌旁组织，人宫颈鳞癌细胞系 及人宫颈上皮永生化细胞系 中 水平。将 细胞分为对照组、组、组、组和 组。对照组 细胞正常培养，不进行转染；组、组、组和 组 细胞分别使用 试剂转染 慢病毒阴性对照（）、慢病毒（）、过表达慢病毒阴性对照（）和 过表达慢病毒（）。通过 法和集落形成实验检测细胞增殖。通过 双染色法检测细胞凋亡。通过 检测细胞侵袭。通过 检测 水平。通过 检测 、基质金属蛋白酶（）、核因子（）和 的表达水平。结果与配对癌旁组织相比，宫颈鳞癌组织中 水平降低（，）。与 细胞相比，细胞中 水平降低（，）。与 期相比，期患者癌组织中 水平降低（，）。与淋巴结未转移患者相比，淋巴结转移患者癌组织中 水平降低（，）。与 组比较，组细胞的 和蛋白相对表达量降低（），相对细胞活力和集落数量升高（），细胞凋亡率、和 蛋白相对表达量降低（），侵袭细胞数量、和 蛋白相对表达量升高（），相对磷酸化水平升高（）。与 组比较，组细胞的 和蛋白相对表达量升高（），相对细胞活力和集落数量降低（），细胞凋亡率、和 蛋白相对表达量升高（），侵袭细胞数量、和 蛋白相对表达量降低（），相对磷酸化水平降低（）。对照组、组和 组上述指标均差异无统计学意义（）。结论 在宫颈癌中下调，并且与 分期和淋巴结转移有关，宫颈癌中 的表达缺失可能通过激活 信号通路抑制癌细胞的凋亡并促进侵袭。关键词：宫颈癌；相关死亡结构域；凋亡；侵袭；核因子 中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，；，；，；，：）：（），（），（），（）（），（），（），（，），（，）山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 ，（，），（，），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）：；宫颈癌（，）是世界范围内女性生殖系统第二常见的恶性肿瘤。年中国宫颈癌死亡人数占全球宫颈癌死亡人数的 ，近年来宫颈癌死亡率呈上升趋势 。人类乳头瘤病毒（，）感染是宫颈癌的主要危险因素 。相关死亡结构域（，）是一种进化上保守的含有死亡结构域的细胞质接头蛋白，在多种物种中广泛表达 。介导死亡受体诱导的外源性细胞凋亡 ，它也是非凋亡性细胞过程的关键调节器，如增殖、细胞周期和自噬 。已被证明在各种生理和病理过程中发挥重要作用，包括胚胎发育、先天免疫和炎症 。因此，的调节失调与许多疾病密切相关，特别是癌症 ，。在胶质瘤、非小细胞肺癌和肝细胞癌等多种实体瘤中均有异常表达 。失调会影响癌细胞行为的许多方面（包括增殖、凋亡、细胞周期、自噬、炎症和耐药性），进而促进癌症的进展 。然而，影响癌症进展的确切机制仍然不完全清楚。最近研究显示，宫颈癌组织中 发生了失活突变，通过与 结合而被招募到死亡受体上，随后启动 介导的细胞凋亡，基因功能的丧失可能通过增强癌细胞的抗凋亡活性而促进癌症的发生 。本研究旨在探讨 与宫颈癌进展的关系，并揭示其调控癌细胞增殖和凋亡的可能机制。材料与方法 材料 标本收集收集 年 月至 年 月陕西省第二人民医院妇产科确诊的 例宫颈鳞癌患者的癌组织及配对癌旁组织，所有患者均未接受任何治疗，临床基线资料完整。例宫颈鳞癌患者中包括 例 分期为 期的患者，例 期的患者；例未发生淋巴结转移的患者，例发生淋巴结转移的患者。期患者与 期患者、未发生淋巴结转移患者与发生淋巴结转移患者的临床基线资料差异无统计学意义（），具有可比性。本研究获得陕西省第二人民医院医学伦理委员会的批准（伦批 ），入组患者样本采集前均签署知情同意书。实验细胞人宫颈鳞癌细胞系 和人宫颈上皮永生化细胞系 购于美国 公司。实验材料阴性对照 慢病毒（）、慢病毒（）、阴性对照过表达慢病毒（）、过表达慢病毒（）均购于吉玛基因公司。胎牛血清（，货号：）、培养基（货号：）、试剂盒（货号：）、凋亡检测试剂盒（货号：）、结晶紫染色液（）（货号：）均购于北京索莱宝科技有限公司。（货号：）购 于 美 国 公 司。（孔径，货号：）购于美国 公司。（货号：）、裂解液（货号：）和 蛋白测试盒（货号：）购于碧云天生物技术研究所。（货号：）和 （货号：）购于日本 公司。一抗（货号：）、一抗（货 ，号：）、基质金属蛋白酶 （）一抗（）、一抗（）、一抗（货号：）均购于英国 公司。一抗（货号：）、核因子 （）一抗（货号：）、（）一抗（货号：）、标记的 二抗（货号：）购于美国 公司。实验仪器 酶标仪购于美国 公司。流式细胞仪购于美国 公司。倒置显微镜购于日本奥林巴斯公司。超微量分光光度计购于美国 公司。荧光定量 仪购于美国 公司。方法 和 细胞培养将 和 细胞加入含有 、双抗的 培养基中，于、环境条件的细胞培养箱中培养。每组 个复孔。细胞分组和转染将 细胞分为对照组、组、组、组和 组，每组 。将对数生长期的 细胞接种于 孔板（孔），汇合后使用 试剂进行转染。对照组 细胞正常培养，不进行转染。组、组、组和 组 细胞分别转染 慢病毒阴性对照（）、慢病毒（）、过表达慢病毒阴性对照（）和 过表达慢病毒（），转染时间为 。通过 验证转染效率。法检测 细胞增殖 细胞转染 后，将 细胞接种到 孔板中（孔），每孔 ，、培养 。弃上清，加入 新鲜培养液，然后加入 的 继续培养孵育 。弃上清，加入 的 溶解液，室温振荡 ，使用酶标仪检测 处光密度值（）。每组 个复孔。集落形成实验检测 细胞增殖 细胞转染 后，洗涤，胰酶消化，完全培养基重悬细胞并计数。将 细胞接种到 孔板中（孔）培养 周。出现集落后，用 洗涤两次，并用 甲醇固定 ，弃去甲醇，加入 的 结晶紫染色 。显微镜下计数含有 个以上细胞的集落。每组 个复孔。双染色法检测 细胞凋亡 细胞转染 ，用不含 的胰酶消化细胞，离心 沉淀细胞。加入 的 重悬细胞，再次离心弃上清。用 结合缓冲液重悬细胞，调整 细胞浓度为 。取 细胞悬液加入 流式管中，然后加入 ，室温避光孵育 。加入 和 ，立即进行流式细胞仪检测。每组 个复孔。检测 细胞侵袭 细胞转染 ，洗涤，胰酶消化，离心沉淀细胞，无血清培养基重悬，调整 细胞浓度为 。将 的 （）铺在 小室上。取 细胞重悬添加到上室。取 含 的培养液添加到下室。、孵育 ，多聚甲醛固定 ，结晶紫染色 。倒置显微镜下计数细胞。每组 个复孔。检测 基因表达使用 试剂提取总 ，使用分光光度计测定总 的浓度和纯度，通过逆转录试剂盒进行逆转录。使用 在 系统上进行扩增，扩增条件为：，个循环。引物序列如下：正向：，反 向：；正向：，反 向：。通过 方法计算基因相对表达量。作为内参基因。每组 个复孔。检测 、和 蛋白表达使用 裂解液提取组织和细胞总蛋白，使用 试剂盒检测总蛋白浓度，然后取 总蛋白在 上电泳并转移到 膜上，脱脂牛奶封闭 后，将膜与 （）、（）、（）、（）、（）、（）、（）和 （）一抗 孵育过夜。然后将膜与 标记的二抗（）室温孵育。显影。软件定量条带灰度值。作为对照。每组 个复孔。统计学分析实验均重复 次。使用 软件分析数山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期据，通过配对 检验比较宫颈鳞癌组织与癌旁组织中 水平的差异，通过独立样本 检验比较 细胞与 细胞、期与 期患者癌组织以及淋巴结未转移患者与淋巴结转移患者癌组织中 水平的差异，通过单因素方差分析及 检验比较不同 细胞处理组间的差异。表示差异具有统计学意义。结果 宫颈鳞癌组织和细胞系中的 水平与癌旁组织相比，宫颈鳞癌组织中 水平降低（，见图 ）。与 细胞相比，细胞中 水平降低（，见图 ）。与癌旁组织比较，；与 细胞比较，图 宫颈鳞癌组织和细胞系中的 相对表达量 与宫颈鳞癌患者 分期和淋巴结转移的关系与 期相比，期患者癌组织中 水平降低（，见图）。与淋巴结未转移患者相比，淋巴结转移患者癌组织中的 水平降低（，见图 ）。与 期比较，；与淋巴结未转移比较，图 不同 分期和淋巴结转移患者癌组织的 相对表达量 对 细胞增殖的影响对照组、组和 组 和蛋白相对表达量差异无统计学意义（）；与 组比较，组 和蛋白相对表达量降低（）；与 组比较，组 和蛋白相对表达量升高（，见图 ）。对照组、组和 组相对细胞活力和集落数量差异无统计学意义（）；与 组比较，组相对细胞活力和集落数量升高（）；与 组比较，组相对细胞活力和集落数量降低（，见图 ）。，与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 不同处理组 细胞的 和蛋白相对表达量 与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 对 细胞增殖的影响 对 细胞凋亡的影响对照组、组和 组的细胞凋亡率、和 蛋白相对表达量差异无统计学意义（）；与 组比较，组的细胞凋亡率、和 蛋白相对表达量降低（）；与 组比较，组的细胞凋亡 率、和 蛋白相对表达量升高（，见图 ）。对 细胞侵袭的影响对照组、组和 组侵袭细胞数量、和 蛋白相对表达量差异无统计学意义（）；与 组比较，组侵袭细胞数量、和 蛋白相对表达量升高（）；与 组比较，组侵袭细胞数量、和 蛋白相对表达量降低（，见图 和图 ）。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 对 细胞凋亡的影响 与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 对 细胞侵袭的影响（）（）对 细胞 信号通路的影响对照组、组和 组的 相对磷酸化水平差异无统计学意义（）；与 组比较，组 相对磷酸化水平升高（）；与 组比较，组 相对磷酸化水平降低（，见图 ）。，与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 对 细胞 和 蛋白表达的影响 与对照组比较，；与 组比较，；与 组比较，图 对 细胞中 磷酸化的影响 讨论临床、分子和流行病学研究已证实高危人乳头瘤病毒（，）持续感染是宫颈癌的主要病因。可通过影响多种基因（如 ）的遗传多态性或表达水平来诱发宫颈癌，是一种参与多种癌症发生发展的基因 ，。据报道，主要通过激活 、和 病毒癌蛋白导致宫颈癌的发生，在 感染后，病毒癌蛋白通过利用泛素蛋白酶体途径或通过与形成死亡诱导信号复合体的蛋白质（如肿瘤坏死因子 ）相互作用，使 蛋白失活，从而抑制细胞凋亡 。目前，在宫颈癌进展中的具体作用尚无文献报道，因此，本研究探讨了 与宫颈癌进展的关系。研究显示，宫颈鳞癌组织和细胞系中 转录水平显著降低，并且随着 分期升高和淋巴结转移的发生，的转录水平也随着降低，这些结果提示 参与了宫颈癌的发生发展。其他学者在 的宫颈癌样本中观察到了 基因的杂合性丢失和缺失 。基因遗传多态增加了宫颈癌的患病风险 。宫颈癌组织中 主要为失活突变 。这些文献报道均支持本研究结果。本研究通过对 细胞转染靶向 的 和过表达慢病毒调控其表达水平，研究显示，下调 促进了 细胞增殖，诱导了细胞凋亡，降 低 了 促 凋 亡 蛋 白 和 的表达水平，上调 对 细胞增殖和凋亡的影响正好相反。其他文献报道 ，病毒癌蛋白的激活可快速降低 和 的蛋白水平，抑制 、和 的激活。激活的 通过与 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期结合而被招募到死亡受体上，随后启动 介导的细胞凋亡 。缺失阻止了 的成熟，表明 处于 的上游 。因此，结合本研究结果可知，在宫颈癌中发挥促凋亡作用，宫颈癌中 的表达缺失可能抑制了 介导的细胞凋亡途径，从而促进了宫颈癌的进展。本研究还观察到下调 促进了 细胞的侵袭，升高了侵袭相关蛋白 和 的表达水平，上调 对 细胞侵袭的影响正好相反。其他学者报道，尿激酶型纤溶酶原激活物受体（）和 的同时下调诱导胶质瘤中 的过度表达并激活 介导的细胞凋亡 。因此，本研究推测 可能与 具有相互作用，宫颈癌中 的表达缺失可能通过上调 的表达促进癌细胞的侵袭。与 信号通路等肿瘤相关的信号通路的交叉作用被认为是 参与癌症进展的主要机制。信号通路在调节多种生物学过程中发挥重要作用，包括免疫反应、炎症、细胞分化、增殖、存活和侵袭 。的活化通过上调 和 等 的表达促进癌细胞的浸润和转移 ，。的失调与宫颈癌密切相关。感染引发的 激活在宿主的先天和适应性免疫反应中起着重要作用。通过诱导 下调从而消除免疫系统对其复制的抑制活性，导致持续的 感染状态。在宫颈癌发展的过程中，可再次被组织性激活 。本研究观察到下调 促进了 细胞中 的活化，上调 则抑制了 的活化，说明 具有抑制 活化的作用。等 发现在人乳腺癌细胞系 和人结直肠癌细胞系 中，的过表达阻止了 的激活和从细胞质到细胞核的易位。等 将 蛋白与反式转录激活因子短肽进行化学偶联（）并移入癌细胞中，双荧光素酶报告基因和 分析表明，显著降低了 细胞中 的活性，导致了抗凋亡基因如 的表达抑制。结合本研究结果推测，宫颈癌中 的表达缺失可能通过激活 信号通路抑制癌细胞的凋亡并促进侵袭。本研究存在以下局限性：首先，本研究纳入的临床病例数较少，且未比较不同宫颈疾病中 的表达模式，也未分析 与患者预后的关系；其次，本研究证明 的表达缺失可能通过激活 信号通路参与宫颈癌进展，然而，参与宫颈癌进展的机制可能不仅于此，也可能通过其他途径影响癌细胞行为。在今后的研究中，本课题组将进一步检测 在不同宫颈疾病、宫颈癌前病变和宫颈癌中的表达模式，从而深入探讨 在宫颈癌发展中的作用。另外，本课题组将进一步探讨 调控宫颈癌凋亡和侵袭的其他途径。综上所述，本研究表明 在宫颈癌中下调，并且与 分期和淋巴结转移有关，宫颈癌中 的表达缺失可能通过激活 信号通路抑制癌细胞的凋亡并促进侵袭。参考文献：，：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：王光海 基因遗传多态与子宫颈癌易感性 北京：中国协和医科大学，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，：，：，（）：山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期