miR-4465对喉癌Hep-2细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制.pdf

基金项目：上海市青浦区卫生健康委员会基金项目（）作者简介：高天乐，男，生，学士，主治医师，：收稿日期：对喉癌 细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制高天乐，郭志强，孙青，刘建，李俊（复旦大学附属中山医院青浦分院耳鼻喉科，上海 ）摘要：目的探讨 调控第 号染色体同源丢失性磷酸酶 张力蛋白基因（，）甲基化对喉癌 细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法选取 年 月至 年 月复旦大学附属中山医院青浦分院耳鼻喉科手术治疗患者的喉癌组织及相应的癌旁组织 例，实时荧光定量 检测组织中 和 的表达，甲基化特异性 检测 甲基化水平，法分析癌组织中 和 的相关性，并分析 基因启动子甲基化率与性别、年龄、临床分型、肿瘤分期、淋巴结转移的关系。将 细胞分为空白组、对照组（转染 ）、组（转染 ），检测 细胞中 表达，检测 细胞中 蛋白表达，检测 细胞增殖，实验检测 细胞侵袭，细胞划痕愈合实验检测 细胞迁移。再将 细胞分为 组（转染 质粒）和 组（转染 质粒），检测细胞增殖，实验检测细胞侵袭，细胞划痕愈合实验检测细胞迁移。结果喉癌组织中 和 的相对表达低于癌旁组织（）；癌组织中 的表达与 呈正相关性（，）；在癌组织的甲基化率明显高于癌旁组织（）；基因启动子甲基化率与性别、年龄、临床分型无相关性（），与肿瘤分期、淋巴结转移具有一定的关系（）。与空白组和对照组相比，组 和蛋白相对表达显著升高（），组 细胞增殖能力明显降低（），细胞侵袭能力明显降低（），细胞迁移率明显降低（）。与 组相比，组 细胞增殖、侵袭、迁移能力明显降低（）。结论 在喉癌组织中低表达，过表达 可以抑制 细胞的增殖、侵袭和迁移，这可能与 启动子甲基化程度降低和 表达增加有关。关键词：喉癌；甲基化；增殖；侵袭；迁移中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，）：（），（），（），（）（），（）（，）（），（）（），山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 （），（），（），（），（），：；喉癌是起源于喉腔黏膜的一种恶性肿瘤，其主要类型是黏膜来源的鳞状细胞癌，大约占 左右 。近年来喉癌的发病率居高不下，呈现上升趋势，而且死亡率占所有癌症死亡率的 。喉癌的发病风险因素主要受吸烟、酒精、空气污染和病毒性感染的影响，据统计，以上的病例和吸烟有关，其次是酒精、空气污染和人乳头状瘤病毒（）的病毒性感染 ，感染多见于不吸烟和不饮酒的年轻人，通常预后良好 。喉癌早期可以通过手术或者放射治疗的方式达到临床治愈，晚期需要多模式的联合治疗，而且留喉率低，严重影响了患者的生活质量，预后较差。因此继续寻找喉癌发生发展的相关分子生物学机制，早期诊断对于喉癌的临床治疗具有重要意义。是数据基因中最丰富的调控基因，降解靶基因或者抑制其翻译，实现对靶基因水平的转录和调控，从而参与细胞代谢、分化、增殖和凋亡等多种生物学过程 。相关研究表明，抑制表达能增强喉癌 细胞增殖，抑制细胞凋亡 ，说明 可能与喉癌头颈肿瘤的发生和发展有关。第 号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白（）基因是具有磷脂酶活性的抑癌基因，具有抑制肿瘤细胞生长、血管生成、转移和促进凋亡等作用 ，它的甲基化与多种肿瘤的发生关系密切 。家族在肿瘤调控过程中具有重要的作用，属于肿瘤的一致因子 。属于 家族，相关研究表明，可以抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭 。基于上述研究结果，本研究拟探讨 调控 甲基化对喉癌 细胞增殖、侵袭和迁移的影响，为喉癌的诊治提供新的思路。材料和方法 实验材料人喉鳞状细胞癌 细胞系购买于中科院上海细胞库。喉癌组织及相应的癌旁组织 例，均来自 年 月至 年 月本院耳鼻咽喉头颈外科手术治疗的患者，均经喉镜下病理组织活检确诊，属于冻存标本，采用 检测 和 的表达。主要试剂和仪器胎牛血清、培养基购自美国 公司；胰蛋白酶购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；、质粒、质粒购自上海生工生物工程股份有限公司；抗体、山羊抗鼠二抗购自北京中杉生物技术公司；裂解液、蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；细胞增殖检测试剂盒购自江苏凯基生物有限公司；离心机购自美国 公司；仪购自美国 公司。实验方法 细胞培养和分组将人喉鳞状细胞癌 细胞系置于含 胎牛血清的 完全培养基中，置于 、孵箱中培养。当细胞融合度达到 以上时进行转染。首先将 细胞分为空白组（不进行任何转染处理）、对照组（转染 ）、组（转 染 ），采用 检测 表达，检测 蛋白表达，检测细胞增殖，实验检测细胞侵袭，细胞划痕愈合实验检测细胞迁移。再将 细胞分为 组（转染 质粒）和 组（转染 质粒），检测细胞增殖，实验检测细胞侵袭，细胞划痕愈合实验检测细胞迁移。按照脂质体 说明书进行严格操作。实时荧光定量 （）检测 和 的表达称取喉癌组织和癌旁组织适量，振荡研磨，采用 试剂盒分别抽提组织和细胞中总 ，逆转录制备好 ，放在 冰箱中保存。引物序列 ：，：，；引物序列 ：，：。总反应体系 ，上游 下游引物混合物（）为 ，为 ，水为 ，为 。反应步骤：预变性 后，变性 ，退火 ，延伸 ，共进行 个循环，最后 终末延伸 。采用 计算 和 的相对表达变化。甲基化状态的检测采用 组织试剂盒提取喉癌组织和癌旁组织 ，放于 保存，采用亚硫酸氢盐对甲基化与非甲基化的 样品修饰作为对照。对喉癌组织和癌旁组织的 提纯和亚硫酸氢盐修饰、测序。基因甲基化引物，正向：，反向：；基因非甲基化引物，正向：，反 向：；按照试剂盒的使用说明进行扩增。总反应体系：为 ，为 ，混合基因引物为 ，甲基化回收产物为 ，为 。扩增反应条件为：进行预变性 ；进行变性 ；延伸 ；操作 次后，温度 进行末端延伸 ；保持温度 ，。得到的产物进行焦磷酸法测序，取下结合珠与 产物，冷却后，室温进行杂交。在反应仪器中加入底物混合物、脱氧核苷酸和所需要的酶，将 孔板和试剂舱置于焦磷酸测序检测仪中检测，应用 软件对甲基化位点进行检测。本次检测的甲基化率的位点为连续的胞嘧啶和胸腺嘌呤片段，片段中有 个胞嘧啶和胸腺嘌呤，样本中 个胞嘧啶和胸腺嘌呤位点的甲基化率总和即为样本中 基因启动子区甲基化率。检测 蛋白的表达将转染后细胞以 个细胞的密度接种到 孔板中，加入 裂解液进行蛋白提取，法蛋白定量，聚丙烯酰胺凝胶（）电泳，转膜，封闭，加入含有 一抗（稀释）的 脱脂奶粉中，放入 冰箱过夜，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（浓度 ），室温孵育 后，洗膜 次，作为内参，化学发光，将条带扫描至计算机，用 软件分析目的蛋白灰度值。检测细胞增殖细胞转染 后，胰酶消化，以 个细胞 孔的浓度平铺在 孔板中，设置 个复孔，分别培养 ，每个反应孔中加入 的 溶液，下避光培养，在 采用酶标仪测定 值。实验检测细胞侵袭将转染后细胞置于 小室置于 孔板内，采用无血清的培养基制成单细胞悬液，以 个 的浓度接种于 小室的上室，小室的上室底部的膜表面涂抹 胶，下室内加入 含 的培养基。后取出 孔板，洗涤 次，多聚甲醛固定 ，吉姆萨染色约 ，显微镜下随机选取 个视野照相并计数。细胞划痕愈合实验检测细胞迁移收集生长旺盛的细胞，以 个细胞 铺至 孔板中，后，以直尺辅助，使用 枪头在每孔内垂直背侧标记线划痕。洗涤 次，按照划痕后 和 两个时间点进行漂洗细胞并拍照取样测距，计算迁移率，其公式如下：迁移率 （原始划痕距离 后划痕距离）原始划痕距离 。统计学处理采用 软件进行数据处理。计量资料以均数 标准差（珋 ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 检验。相关分析 和 的相关性，为差异有统计学意义。结果 和 在喉癌组织和癌旁组织中的差异表达和相关性喉癌组织中 和 的相对表达低于癌旁组织（，见图 ）。相关分析结果显示，癌组织中 表达和 呈正相关性（，见图 ）。喉癌组织 基因甲基化的情况及其与临床病理学的相关性 在癌组织的甲基化率明显高于癌旁组织（）；基因启动子甲基化率与性别、年龄、临床分型无相关性（）；与肿瘤分期、有无淋巴结转移具有一定的关系（，见表 ）。对 和蛋白表达的影响与空白组和对照组相比，组 细胞中 相对表达显著升高（），蛋白表达显著升高（，见图）。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期与癌旁组织相比，图 和 在癌组织和癌旁组织中的表达和相关性 表 基因启动子甲基化率与临床病理学的相关性 临床病理参数 基因启动子甲基化率（）性别男 女 年龄 岁 岁 临床分型声门上型 声门型 肿瘤分期 淋巴结转移有 无 过表达 对 细胞增殖的影响 ，时，空白组与对照组 细胞增殖能力比较，差异无统计学意义（）；组 细胞增殖能力明显低于对照组（，见图 ）。过表达 对 细胞侵袭的影响空白组与对照组 细胞侵袭能力相比，差异无统计学意义（），组 细胞侵袭能力明显低于空白组和对照组（，见图 ）。过表达 对 细胞迁移的影响与空白组和对照组相比，组 细胞迁移率明显降低（，见图 ）。与对照组相比，图 细胞过表达 对 的影响 与对照组相比，图 过表达 对 细胞增殖的影响 ，与对照组相比，图 过表达 对 细胞侵袭的影响 图 过表达 对 细胞迁移的影响 对 细胞增殖的影响与 组相比，组 ，的 细胞增殖能力明显降低（，见图 ）。与 组相比，图 对 细胞增殖的影响 对 细胞侵袭的影响与 组相比，组 细胞侵袭能力明显降低（，见图 ）。与 组相比，图 对 细胞侵袭的影响 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 对 细胞迁移的影响与 组相比，组 细胞迁移能力明显降低（，见图 ）。图 对 细胞迁移的影响 讨论 在喉癌中的治疗、监测复发和判断预后方面也有着广阔的应用前景，很多研究表明，在喉癌的转移、复发上具有一定的预测作用，而且可以通过基因靶向调控喉癌的多耐药性 。除此之外，还可以通过其启动子区的甲基化修饰来促进喉癌的发展。喉癌是喉部的恶性肿瘤。近年来，喉癌的发病率虽然呈现下降趋势，但是喉癌患者的总生存率并未得到提高，而且该病有 的喉癌患者一旦确诊即为晚期，甚至发生了转移 ，严重影响了患者预后。目前喉癌的发病机制尚不明确，并且在诊断、治疗和预后方面仍缺少有效的生物标志物，所以探索喉癌的分子发病机制，提高喉癌患者的临床疗效，对于喉癌的诊断和潜在的靶向治疗具有重要意义。研究表明，在喉癌的进展中起着关键作用 。越来越多的研究表明，参与肿瘤的各个过程，包括肿瘤发生、增殖、转移、复发和耐药等 。可以反映起源组织的病理生理状况，可能成为新的有前途的生物标志物。多项研究报道，在喉癌中的表达差异 ，喉癌中 表达显著下调，过表达 可以显著抑制喉癌细胞的增殖、影响喉癌细胞周期、促进喉癌细胞凋亡以及抑制喉癌细胞迁移 。在喉癌组织中的表达量明显升高，下调 能降低 细胞的增殖、迁移、侵袭能力，并使细胞周期主要阻滞于 期 。但目前关于 在喉癌的相关报道较少，属于 家族的主要成员，家族主要有 个成员，包括 、和 ，在乳腺癌、肝癌、胃癌在内的多种实体肿瘤都出现低表达，属于抑癌基因 ，所以推测 在喉癌中也具有类似的作用。本研究首先验证 和 在喉癌组织和癌旁组织中的表达，结果显示，喉癌组织中 和 的相对表达低于癌旁组织，提示 和 在喉癌中均有可能属于抑癌基因。相关分析结果显示，和 又呈现正相关性。而且与 组相比，组 细胞增殖、侵袭、迁移能力明显降低。甲基化属于表观遗传学的一种，是胞嘧啶转变为 甲基胞嘧啶的一种反应，被甲基化后将与蛋白结合，高度紧密排列，结果无法生成转录复合物，影响基因表达 。甲基化修饰作为基因表达调控的关键方式，在分化、发育和维持组织特异性等许多方向起着关键的作用 。甲基化与许多种疾病的发生有关，研究表明，抑制 基因启动子甲基化来减缓慢性粒细胞白血病的进展 。甲基化与多种肿瘤的发生关系密切，已有研究表明，在乳腺癌、结肠癌等肿瘤中均存在 甲基化异常的情况 。本研究结果显示，在癌组织的甲基化率明显高于癌旁组织，而且与肿瘤分期、淋巴结转移具有一定的关系。相关研究表明，组织学分级为 级和淋巴结转移阳性的患者的膀胱组织中 基因启动子甲基化率显著高于组织学分级为 级和淋巴结转移阴性的患者 ，与本研究结果类似。本研究采用模拟体 在 细胞中成功过表达 后，明显提高了 ，和蛋白表达，抑制了 细胞的增殖、侵袭和迁移。提示 可能在喉癌的发生和发展的过程中起着抑癌基因的作用，为临床喉癌的治疗提供新靶点。相关研究表明，能够抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭 ；也有研究表明，过表达能够降低结肠癌细胞活性，促进细胞凋亡并抑制细胞侵袭 ，与本研究在肿瘤中的验证结果相似。综上所述，在喉癌组织中低表达，过表达 可以抑制 细胞的增殖、侵袭和迁移，这可能与 启动子甲基化程度降低，促进 表达有关。本研究为临床上喉癌的治疗提供了有利的依据，但关于 降低 启动子甲基化水平的相关机制还需要进一步研究。本研究存在一定的局限性，本研究只进行了体外实验研究，下一步将探讨临床样本中的 的表达，以及对喉癌预后的影响，以期为喉癌的临床治疗提供依据。参考文献：，（）：，（）：，（）：，（）：许咪咪，卢仲明，张思毅，等 喉鳞状细胞癌淋巴结转移相关 差异表达谱分析 实用医学杂志，（）：黄非，王建洪，毛贺娟，等 调控 参与喉癌 细胞增殖及凋亡过程研究 临床和实验医学杂志，（）：张军军，梁乐平 末端对鼻咽癌细胞迁移及增殖能力的影响 癌变 畸变 突变，（）：王一冉，汪月静，何杰 降低 甲基化及组蛋白乙酰化促进入胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭 现代肿瘤医学，（）：，（）：于利，张明，王迪 靶向 调控宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭的机制研究 中国实验诊断学，（）：，（）：郝芳，单春光，贾巧静，等 喉癌组织中 与 的表达及临床价值 西部医学，（）：，（）：，：，（）：徐志远，秦永 喉鳞状细胞癌患者血清中 表达谱分析 医学综述，（）：郭有新，陈宝刚，刘建伟，等 对喉癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及机制研究 安徽医科大学学报，（）：赵娟霞，龚勇，杨淑梅，等 靶向 调控喉癌细胞 增殖与迁移的机制 临床与实验病理学杂志，（）：孙峰，谢玮 脐带间充质干细胞外泌体携载 抑制食管癌细胞的侵袭及迁移 医学研究生学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：李凯，王元林，徐元高，等 甲基化、异常表达与膀胱移行细胞癌发生的相关性 东南大学学报（医学版），（）：于利，张明，王迪 靶向 调控宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭的机制研究 中国实验诊断学，（）：杨继岚，李杨，邓明佳，等 对结肠癌细胞凋亡和侵袭的影响 肿瘤防治研究，（）：山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期