lncRNA LINC02381通过miR-133a-3p_MGMT轴对脑胶质瘤细胞替莫唑胺抵抗的影响.pdf

通过 /轴对脑胶质瘤细胞替莫唑胺抵抗的影响陈 静董善武陶 双罗 超陈 玲刘 娜付 阳武汉市第四医院儿科湖北 武汉【摘要】目的:探讨 通过 /轴对脑胶质瘤细胞替莫唑胺()耐药性的影响 方法:体外培养人脑胶质瘤细胞株、耐 细胞/将/细胞分为/组、组、组、组、组、.组、.组、.组 法检测、/细胞对 的耐药性 检测、水平流式细胞仪检测细胞凋亡双荧光素酶报告实验验证 与 、与 的靶向关系 法检测、蛋白表达 结果:与 细胞相比/细胞中、和 、蛋白表达升高(.)表达降低(.)与/组、组相比 组表达降低(.)表达、细胞凋亡率、和 表达升高(.)与/组、组相比 组、表达降低(.)细胞凋亡率、和 表达升高(.)与、均存在靶向关系、过表达均可逆转 过表达对/细胞 耐药性的影响 结论:沉默可能通过使 表达升高进而抑制 表达降低/细胞对 的耐药性【关键词】脑胶质瘤 【中图分类号】.【文献标识码】:./.【文章编号】()/.【】:()/.:/./.:/(.)(.)./(.)(.)./【收稿日期】【修回日期】【基金项目】湖北省武汉市医学科研项目(编号:)【作者简介】陈静()女湖北人主治医师主要从事实验肿瘤学研究 :.【通信作者】陶双()女湖北人副主任医师主要从事实验肿瘤学研究 :.现代肿瘤医学 年 月 第 卷第 期 .(.)(.)./.:/.【】():脑胶质瘤是常见的大脑恶性肿瘤起源于神经系统胶质细胞约占颅内肿瘤的一半 临床脑胶质瘤的治疗方式多为手术切除联合放化疗可延长患者生存期 替莫唑胺()是脑胶质瘤的标准化疗方案药物之一安全有效临床应用广泛但药物的长期使用会使部分患者发生药物抵抗性无法长期获益 因此明确脑胶质瘤 耐药机制十分必要 长链非编码()已被证实在多种药物的耐药性中发挥作用在多种癌细胞亲本细胞与耐药细胞中存在差异表达 研究显示 在骨肉瘤中表达升高上调 可加速骨肉瘤的发生但其在脑胶质瘤中研究进展较少 可海绵化吸附 促使 难以发挥作用经生信软件分析 与 存在结合位点且 在脑胶质瘤中低表达 研究显示 启动子甲基化可抑制 蛋白表达有利于脑胶质瘤患者预 后 此外生信软件显示 与 存在结合位点 本研究以脑胶质瘤细胞 为研究对象观察 通过 /轴在 细胞抗 药物中的作用并对其机制进行初步探讨 材料和方法.主要试剂与仪器 细胞()、细胞()购自北纳生物公司()购自江西瑞威尔生物 ()、()、()、()、.载体()均 购自百奥迈 科生物 技 术 有 限 公司.()、.()由武汉金开瑞生物工程有限公司合成 培养基()、转染试剂盒()、试剂盒()、海萤荧光素酶辉光检测试剂盒()购自 试剂盒()、蛋白提取试剂盒()、细胞凋亡与坏死检测试剂盒()、()购自上海碧云天兔抗()、()、()、()、()购自山羊抗兔()购自美国 公司培养箱()购自浙江钠德科学仪器有限公司流式细胞仪()购自贝克曼库尔酶标仪()购自美谷分子仪器(上海)有限公司.方法.、/耐药细胞系建立及培养将 细胞在培养瓶()中培养培养基为 培养基 胎牛血清()双链霉素()培养箱条件设置为 、按照常规方法进行传代 对 细胞进行 梯度诱导梯度设置为、/待细胞在最低浓度稳定生长一周后再进行下一个浓度处理至 细胞在/浓度下稳定生长时此时为建立了/细胞系 将/在/下维持耐药性.法检测、/细胞对 的耐药性将、/细胞在 孔板上接种(细胞密度为 个/孔)等细胞贴壁后弃去上清液加入不同浓度的 处理(、.、/)每组 个平行每孔加入适量 溶液()后酶标仪测定吸光度 值按照细胞生存曲线计算细胞半数抑制浓度()实验重复 次.细胞分组收集.节中/细胞将细胞浓度调整至 个/孔在 孔板中接种待融合至 时更换为无血清培养基 通过 转染细胞细胞分组为/组、组、组、组、组、.组、.组、.组.检 测、水平试剂盒提取.、.节中各组细胞总 将一定量 反转录成 并利用 荧光定量检测试剂盒进行 扩增之后进行 预变性 (变性 退火 延伸 )根据 公 式 计 算 相 对 表 达 量、以 为内参 以 为内参 引物序列见表 表 引物序列.()()陈 静等 通过 /轴对脑胶质瘤细胞替莫唑胺抵抗的影响.流式细胞仪检测细胞凋亡收集.节中各组细胞细胞经消化后离心收集加入 室温条件下加入 孵育()再加入 孵育()上流式细胞仪测定各组细胞凋亡比例.双荧光素酶报告实验验证 与 、与 的靶向关系经 网站查找 与 靶向关系经 网站查找 与 关系分别构建 、质粒对其进行定点突变构建 和 质粒将 和 分别与 、共转染至/细胞中通过双荧光素酶报告基因检测各组相对活力 通过 法检测 沉默表达对 以及 过表达对 的影响.法检测、蛋白表达收集.、.节中各组细胞调整浓度(个/孔)加入 孔板经洗涤、重悬细胞后提取细胞总蛋白 试剂盒对总蛋白定量 经 凝胶电泳、转膜、封闭等一系列常规操作后加入()、()、()、()、()一抗稀释液 孵育过夜 洗膜加入二抗()分析蛋白表达水平.统计学方法采用 .统计学软件分析数据计量资料均符合正态分布以均数 标准差()表示组间比较采用独立样本 检验多组间比较采用单因素方差分析进一步两两比较采用 检验.为差异有统计学意义 结果.与 在/细胞中高表达细胞存活率 检测结果显示与 相比干预后/细胞存活率升高(.)且 干预后 /细胞 明显高于 细胞(.)/(.)/提示/细胞对 具有耐药性 结果和 结果显示与 细胞相比/细胞中 和、蛋白表达升高(.)表达降低(.)提示、和 可能参与 细胞对 的耐药性(图)图 与/细胞存活率及、和 蛋白表达水平的比较:、/细胞存活率 :与/细胞中 、表达以及 蛋白表达 与 细胞相比./:/.:/.过表达促进/细胞凋亡 结果显示与/组、组相比 组细胞中 表达升高(.图)提示 过表达细胞转染成功 过表达对/细胞凋亡情况通过流式细胞仪检测结果显示与/组、组相比 组细胞凋亡率明显升高(.图 )进一步通过 结果显示与/组、组相比 组细胞促凋亡蛋白、表达升高(.)抗凋亡蛋白 表达降低(.)(图 )表明 过表达促进/细胞凋亡.沉默 促进/细胞凋亡 结果显示与/组、组相比 组细胞中 表达降低(.)提示沉默 细胞转染成功(图)沉默 对/细胞凋亡情况通过流式细胞仪检测结果显示与/组、组相比 组细胞凋亡率明显升高(.图 )进一步通过 结果显示 组细胞促凋亡蛋白、表达升高(.)抗凋亡蛋白 表达降低(.)(图)表明沉默促进/细胞凋亡.与、存在靶向关系数据库预测 与、之间的靶向关系结果显示 与 存在靶向结合位点 与 存在靶向结合位点提示 可能通过靶向调控 进而调控 发挥耐药性作用(图 )通过双荧光素酶报现代肿瘤医学 年 月 第 卷第 期 .告实验验证后 与 靶向结果显示与 组对比 组相对荧光素酶活性降低(.)表明 可靶向调控 (图)结果显示与/组、组比较 组/细胞中 表达水平升高(.)提示 可负向调控 (图)通过双荧光素酶报告实验验证后 与 靶向结果显示与 组对比 组相对荧光素酶活性降低(.)表明 可靶向调控(图)结果和 结果显示与/组、组比较 组/细胞中 与 蛋白表达水平降低(.)提示 靶向负向调控(图 )图 过表达促进/细胞凋亡:各组细胞 表达 :各组细胞凋亡情况 :各组细胞凋亡蛋白表达情况 与/组相比.与 组相比./:.:.:./.图 沉默 促进/细胞凋亡:各组细胞 表达 :各组细胞凋亡情况 :各组细胞凋亡蛋白表达情况 与/组相比.与 组相比./:.:.:./.陈 静等 通过 /轴对脑胶质瘤细胞替莫唑胺抵抗的影响图 与、的靶向关系 :与、靶向结合位点:各组细胞荧光素酶活性(与 组相比.):沉默 对 表达的影响(与/组相比.与 组相比.):各组细胞荧光素酶活性(与 组相比 .):过表达对 表达的影响(与/组相比 .与 组相比.).:.:(.).:(/.).:(.).:(/.).过表达 逆转 过表达对/细胞凋亡的促进作用 结果显示与 组、.组相比 .组中 表达降低(.图)表明 通过调控 发挥作用 通过流式细胞仪检测细胞的凋亡情况结果表明与 组、.组 相 比 .组细胞凋亡率明显降低(.图 )进一步通过 结果显示/细胞抗凋亡蛋白 表达升高(.)促凋亡蛋白、表达降低(.)(图 )表明过表达 可逆转 过表达对/细胞凋亡的促进作用.过表达逆转 过表达对/细胞凋亡的促进作用 结果显示与 组、.组相比 .组 表达升高(.图)表明 通过调控 发挥作用 通过流式细胞仪检测细胞的凋亡情况结果表明与 组、.组相比 .组/细胞凋亡率明显降低(.图 )进一步通过 结果显示/细胞抗凋亡蛋白 表达升高(.)促凋亡蛋白、表达降低(.)(图 )表明 过表达会逆转 过表达对/细胞凋亡的促进作用 讨论 是脑胶质瘤行之有效的化疗方案之一可控制肿瘤增长转移速度其耐药性是影响患者继续受益的原因是癌症治疗中的难点以及热点之一 探讨脑胶质瘤细胞对 药物的耐药机制可为脑胶质瘤患者延长生存期提供帮助 本研究以 细胞为基础进行探讨 参与细胞的耐药性已经多方验证 在多种癌中异常表达如胃癌、食管癌 在胶质瘤中 表达降低其有希望成为胶质瘤诊断和预后分子生物标志物 本研究发现与 细胞相比/细胞对 的 显著升高 表达降低提示 可能与 的 耐药性有关 过表达 后/细胞、较单纯耐药株降低细胞凋亡率、和 表达升高提示 过表达可显著降低/细胞的 耐药性可能为潜在胶质瘤治疗靶点 在多种肿瘤的恶性生物学进程中发挥作用可通过影响细胞凋亡参与多种肿瘤细胞的耐药机 制如 在胃癌组织中异常高表达且通过靶向调节 激 活 胃 癌 细 胞 自 噬 并 诱 导 细 胞 耐 药性 沉默通过抑制 磷酸化使自噬失活从而降低非小细胞肺癌细胞的耐药性 通过竞争性与 结合阻碍 调控靶基因 发挥作用 生信分析显示 与 有靶结合位点本研究经双荧光素酶也验证了二者存在靶向调控关系本研究结果显示沉默 表达可降低/细胞的 耐药性、增加/细胞的凋亡提示 可能在/细胞的 耐药性中发挥负面作用沉默 更有利于 在癌细胞中发挥作现代肿瘤医学 年 月 第 卷第 期 .用 为进一步探讨 过表达是否经 调控发挥增敏作用本研究发现 过表达可逆转 对/细胞的促凋亡、增敏作用提示 可能通过竞争性结合 从而增加/细胞对 的耐药性图 过表达 逆转 过表达对/细胞凋亡的促进作用:各组细胞 表达 :各组细胞凋亡情况 :各组细胞凋亡蛋白表达情况 与 组相比.与 .组相比./:.:.:.图 过表达逆转 过表达对/细胞凋亡的促进作用:各组细胞 相对表达情况 :各组细胞凋亡情况 :各组细胞凋亡蛋白表达情况 与 组相比.与 .组相比./:.:.:.陈 静等 通过 /轴对脑胶质瘤细胞替莫唑胺抵抗的影响 基因位于人 号染色体是 甲基转移酶编码基因在调控基因转录过程中发挥关键作用其编码的蛋白可通过修复 中甲基化残基保护 免于损伤脑胶质瘤中 显著上调可作为分子标志物预测脑胶质瘤预后情况 动物实验表明脑瘤一号与 联用可增加胶质瘤小鼠的疗效并降低副作用可能与下调 表达并增加/比例实现的 本研究中脑胶质瘤耐药株/中 与 蛋白水平均显著高于亲本株 提示 与 的 耐药性有关 通过与下游靶基因 端结合阻碍靶基因的转录抑制靶基因的翻译 生信分析与双荧光素酶报告基因显示 与 靶向联系 过表达可缓解 过表达对/细胞的促凋亡、增敏作用 结合以上研究我们认为 沉默可通过 /轴降低/细胞对的抵抗 综上所述 沉默可能通过使 表达升高进而抑制 表达降低/细胞对 耐 药 但 本 研 究 仅 从 细 胞 水 平 上 分 析 了 及 /轴在胶质瘤细胞对 耐药的可能机制下一步本研究将进一步增加检测方法并结合体内实验进一步探讨其对耐药性胶质瘤细胞凋亡的具体机制【参考文献】王宏欣付苏淳雪莉等.通过靶向作用于叉头盒转录因子 抑制胶质瘤细胞生长的实验研究.中国比较医学杂志():.():.:.刘正泰肖方祥王俊杰等.在卵巢癌组织中的表达及对卵巢癌细胞顺铂耐药的作用.肿瘤():.():.李吉徐莹褚以忞等.调节细胞自噬功能在肠癌细胞 氟胞嘧啶耐药性中的作用.现代生物医学进展():.():.:.:.():.():.段然颜成睿王磊.通过调节 的表达影响高级别脑胶质瘤细胞对替莫唑胺耐药.中国肿瘤生物治疗杂志():.():.丁吉涛李明浩李琳坤等.替莫唑胺治疗神经胶质瘤患者疗效与安全性的回顾性分析.现代肿瘤医学():.():.卫润斐梁洪磊曹付强等.立体定向放射治疗联合替莫唑胺治疗复发性脑胶质瘤的疗效.现代肿瘤医学():.():.阮庆芬杨德祥杨理伟.对胃癌细胞增殖和凋亡影响及其作用机制研究.中国比较医学杂志():.():.():.刘亮朱正权阿满哈迪尔别克等.甲基化对 表达及胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响.现代肿瘤医学():.():.().():.():.():.朱鸣峰.基因在脑胶质瘤组织中表达变化突变及功能的生物信息学分析.山东医药():.():.袁洁张珏费智敏.脑瘤一号方联合替莫唑胺对裸鼠脑胶质瘤模型、和 蛋白表达的影响.中国中西医结合杂志():.():.(编校:蔺玥)现代肿瘤医学 年 月 第 卷第 期 .