AMPK通过下调CCL2抑制舌鳞状细胞癌肿瘤微环境中M2巨噬细胞的极化.pdf

基金项目：江西省自然科学基金（编号：，）；美捷登青年科学家创新基金（编号：）作者单位：济南，山东省立第三医院药学部（唐显帅）；赣南医学院第一附属医院（邹军荣）通信作者：邹军荣 ：通过下调 抑制舌鳞状细胞癌肿瘤微环境中 巨噬细胞的极化唐显帅邹军荣【摘要】目的：探究单磷酸腺苷激酶（）在舌鳞状细胞癌（）中的作用及与肿瘤微环境（）巨噬细胞分化的关系。方法：免疫组化检测 在舌癌组织的磷酸化水平及与患者预后的关系。多重免疫荧光检测 的磷酸化水平与肿瘤微环境巨噬细胞极化的关系。通过条件性共培养，观察 激活后，对单核细胞体外诱导成功率的影响。结果：免疫组织化学检测结果发现，在舌癌组织中 磷酸化水平显著高于其癌旁组织。多重免疫荧光显示 的磷酸化水平与 型巨噬细胞浸润呈正相关，与 型巨噬细胞浸润呈负相关。及体外条件性共培养实验提示肿瘤细胞 激活后趋化因子（基序）配体（）的表达下降，促进巨噬细胞向 极化，抑制 极化。结论：可以通过下调舌癌细胞的 的表达抑制 中巨噬细胞的 极化。【关键词】单磷酸腺苷激酶；肿瘤微环境；型巨噬细胞极化；【中图分类号】【文献标志码】【】，；，【】：（）（）：（）：，：【】；舌癌（，）的发生将严重影响舌癌患者的正常生活。且 具有非常强的侵袭、转移和复发性，肿瘤早期区域淋巴结转移率很高，严重影响患者生存率 。临床上，对于通过组织学检测确诊的舌鳞癌患者，主要采用以手术和放、化疗的综合治疗为主，然而治疗后患者的 年生存率仅为 左右 。因此，深入研究舌鳞癌发生、发展的分子机制，寻找能更好改善患者预后的治疗方式对舌癌的治疗具有重要意义。口腔是直接与外部环境连接的重要通道，舌癌组织具有大量的单核细胞浸润。肿瘤相关巨噬细胞（，）是肿瘤微环境实用口腔医学杂志（），（）的最常见单核细胞，为响应肿瘤基质特殊的抑制肿瘤微环境（，）的改变，可以分化为 型和 型 。目前主流观点认为，型 能释放多种促炎因子、免疫激活因子和趋化因子（，等），通过急性促炎反应、免疫活化反应以及细胞吞噬功能，发挥抗肿瘤的作用。而 型巨噬细胞可通过分泌细胞因子直接促进癌细胞的增殖、调节肿瘤微血管的形成等多种方式促进癌症的进展 。因此，有研究团队提出了多种基于巨噬细胞的癌症免疫治疗方法，比如嵌合抗原受体（，）巨噬细胞等 。然而，参与 巨噬细胞的极化的调控方式极其复杂。其中，癌细胞对巨噬细胞的驯化是最受关注的机制之一。研究显示，舌癌细胞的代谢重编程是癌症重要的特征，可通过激活炎症信号通路调节 至适宜自身生长的环境 。单磷酸腺苷激酶（，）作为肿瘤能量感受器，对肿瘤糖酵解获取能量的方式（效应）具有抑制作用 。然而，其作为肿瘤治疗靶标越来越受到质疑，比如一项关于二甲双胍对乳腺癌风险的影响的研究显示，二甲双胍的使用与 阳性乳腺癌风险降低有关，但三阴性乳腺癌的风险反而有了大幅度升高 。目前文献对 在舌癌中的作用报道不一。其是否参与调节舌癌的 巨噬细胞的极化，尚未见文献报道。为此，本研究主要探究了 的磷酸化水平对患者预后的影响，及肿瘤细胞的 的激活状态对 中浸润的单核细胞极化的影响。材料与方法 主要试剂多重免疫荧光所使用 多重免疫荧光染色试剂盒（公司，美国）；多重免疫荧光组织芯片（，上海芯超公司）；胎牛血清（）（，北京索莱宝）；免疫组化二抗（）及其相关试剂（北京中杉金桥）。实验方法 免疫组织化学收集 例 年 月 年 月在南昌大学病理科术前未进行放疗和化疗的舌癌患者手术切除标本，其中男性 例，女性 例，年龄 （）岁。标本为手术切除后内获得，立即放入福尔马林固定过夜，蜡块包埋切片。患者基本资料见表 。本研究由南昌大学第一附属医院伦理委员会批准（批准号：）。采用免疫组织化学法检测舌癌组及癌旁组的组织中 的蛋白表达水平（抗体来源于 ，浓度 ），免疫组化染色方法参考本文作者已经发表论文，采用德国半定量评分法 ，以“”和“”为 低表达组（），以“”和“”为 高表达组（）。并对患者进行随访，比较两组患者的生存时间。多重免疫荧光通过免疫组化预实验初步确定各个抗体的浓度，单荧光预实验确定多色荧光浓度。多色荧光预实验确定各个抗体的通道组合。多色荧光实验步骤：组织脱蜡水化、柠檬酸修复液微波加热抗原修复，胎牛血清室温封闭液 ，滴加一抗，过夜，洗涤（）。滴加二抗孵育 ，洗涤。染料孵育 ，洗涤，再次微波炉加热修复，滴加一抗，重复上述步骤，直至最后一个抗体结束，染核，荧光封片剂封片。所使用一抗及其对应的 染料如下表 。表 一抗及其对应的 染料 一抗厂家及货号抗体浓度 染料 ，实验结束后，染色好的组织芯片用 组织全景多光谱扫描及 分析系统（）进行分析。阳性率以阳性细胞数 总细胞数代表某指标的阳性率，以 代表 型巨噬细胞，以 代表 型巨噬细胞。细胞培养人舌癌细胞 （上海交通大学医学院第九人民医院口腔医学重点实验室）。将细胞在 中培养，用含 ，双抗（）的 培养基进行培养。人 细胞（武汉 公司），用含 ，以及 的 进行培养。细胞培养环境为 ，。或者 （）刺激 细胞 ，时间到了后收集细胞，裂解 。使用 蛋白质测定法（）定量蛋白质浓度。将等量的蛋白质（约 ）在 中电泳，随后转移到 膜上。在 脱脂奶粉中室温封闭 ，置于相应的目的蛋白抗体中 下摇床孵育过夜。洗涤次，二抗室温孵育 ，洗涤次，每次实用口腔医学杂志（），（），使用 检测系统进行曝光。使用 软件定量免疫反应条带。实验接种细胞 后，用二甲双胍（）处理 细胞，观察细胞 的细胞增殖。药物处理结束后，向每个孔中加入 （），并将板在 下孵育 。然后弃去 培养基混合物并向每个孔中加入 二甲基亚砜。酶标仪检测 的吸光度。检测 转录水平在 中，接种 个 细胞，使用二甲双胍（）处理 细胞，使用 提取试剂盒（北京天根）提取总 ，并逆转录为 备用。使用荧光定量 试剂盒（）进行 检测细胞 的转录水平。引物序列如表 。表 引物序列 基因正向序列反向序列 检测细胞培养上清 水平取上述 实验所培养细胞的上清。将上清于 离心 去除死细胞，取上清，混匀后取 备用。使用人 检测试剂盒（，百奥莱博，），按照试剂盒说明书步骤检测细胞培养上清中 的水平。细胞体外分化实验人单核细胞 细胞购于武汉 。型巨噬细胞的分化：细胞分化先用 的佛波醇 肉豆蔻酸酯 乙酸盐（，美国）处理 ，然后在 培养基中孵育 ，使细胞分化成 巨噬细胞。然后用 （，）和 （，美国）进一步刺激细胞 。型巨噬细胞在的分化：细胞用 刺激 ，然后在没有 的 培养基中静置 后，用 （，）和 （，）进一步刺激细胞 。流式检测巨噬细胞的分化情况细胞的分化情况采用流式细胞术检测细胞的分化。在细胞实验结束后，取 个细胞，洗涤 次，先用同源血清室温封闭 ，在 和 分化实验样品中分别加入 抗体（，美国）和 抗体（荧光，美国）。孵育 ，洗涤次上机检测（，）。在本实验中，以 为 型巨噬细胞，为 型巨噬细胞。实验结束后，将数据导出为 格式文件，用 软件分析数据。统计学分析数据采用 软件进行统计分析。实验结果采用珋 表示计量资料，对数据进行方差齐性检验与正态性检验后；两组间连续型资料采用 检验进行两组间比较，多组间连续型资料采用 分析两两间差异；计数资料率的比较采用检验，细胞增殖速度采用 分析两组间差异。两变量间的相关性采用 相关分析与 等级相关分析。患者生存时间进行 分析，两组间比较采用 检验和 检验。时为有统计学意义。结果 舌癌组织中 活性显著低于正常组织为探究 在舌癌患者中的表达及与预后的关系。本研究采集了本院 例舌癌患者的石蜡标本进行免疫组化染色。免疫组化结果显示，阴性 例（），阳性 例（）（表 ）。其表达强弱与不同性别、不同年龄和不同 分期组中无显著性差异，但是在分化程度上，的表达呈现显著性差异（图 ）。统计学分析结果显示，在高分化与中低分化组中，有显著性差异（）（图 ）。并且其修饰水平与分化程度（，）和 分期（，）呈现负相关（表 ）。为进一步观测患者预后与 激活状态的关系，将上述纳入研究的患者分成 磷酸化修饰水平高和低两组（和 ），对患者生存时间进行了随访。结果显示，虽然 的磷酸化修饰水平与患者的总生存率（）无统计学差异，但是 的磷酸化修饰水平越高，患者的实用口腔医学杂志（），（）平均生存时间越长（个月），差异具有统计学意义（检验，图 ）。患者总生存率无统计学差异（检验，）。表 免疫组化临床信息 临床特征 合计性别男女 年龄 岁 岁 分期 分化程度高分化中 低分化 图 的磷酸化水平在不同分化程度的舌癌组织中的表达情况 磷酸化修饰的激活剂 抑制舌癌细胞株的增殖课题组长期从事 在癌症中作用的研究。为明确 在舌癌中的作用，并确定本研究后续实验最佳的给药浓度，本研究给予 细胞 浓度的 刺激 。相较于 对照组，该给药方式能显著激活 （图 ）。同时，激活后，对 增殖速度有明显抑制（图 ）。上述实用口腔医学杂志（），（）结果 提 示 的 二 甲 双 胍 能 很 好 的 激 活 ，同时，的激活将抑制舌癌细胞的增殖能力。图 磷酸化修饰与患者预后的关系 的活化水平与舌癌组织中的 型巨噬细胞浸润呈正相关为了进一步探究 与肿瘤微环境中的巨噬细胞的分化的关系，本研究在一商品化的组织芯片中，通过多重免疫荧光染色，观察 的磷酸化水平与 和 型巨噬细胞浸润的关系。结果显示，在 （绿色）高表达的患者癌组织中，呈现更高的 型巨噬细胞浸润，以及更低的 型巨噬细胞浸润。而在 高表达的患者中，这种趋势正好相反（图 ）。对染色结果进行软件扫描阅片，统计每个癌组织的阳性细胞比例，并用 检验 与巨噬细胞浸润的关系。结果提示，高表达预示着更高的 型巨噬细胞浸润（图 ）和更低的 型巨噬细胞浸润图 ）。遗憾的是，这种关系并无统计学意义。图 抑制舌癌细胞株的增殖 舌癌细胞中 激活后的培养上清抑制 巨噬细胞的分化为进一步验证上述现象，本研究采用体外诱导的方法，观察舌癌细胞在肿瘤微环境中对巨噬细胞分化的影响。结果提示，细胞在用 细胞培养上清处理后，相对于正常诱导条件下，诱导成功率更高，而用二甲双胍处理后的 细胞培养上清处理 细胞，其诱导成功率下降（图 ）。在 型巨噬细胞诱导实验中，情况刚好相反（图 ）。抑制 的表达可能与 信号通路的抑制有关课题组在一项关于巨噬细胞的研究中发现，激活后可以抑制巨噬细胞的 信号通路的激活以及 的表达 。为探究 与巨噬细胞浸润关系可能的机制，以及 是否也对舌癌细胞的 表达起调控作用，本研究通过给予 细胞二甲双胍处理，观察 的激活以及 的表达情况。结果提示，当 被激活后，信号通路受到抑制（图 ），同时 的转录水平（图 ）以及分泌（图 ）都受到相应的抑制。讨论 作为肿瘤的能量感受器以及重要的蛋白激酶，参与调节了肿瘤的增殖、迁移等过程，但同时其临床价值越来越受到质疑 。其在舌癌的作用研究主要集中在通过抑制癌细胞的增殖抑制癌症的进展等方面。本文通过检测了临床患者的 的激活状态，并通过患者术后随访，验证了 的磷酸化水平越低，患者的预后越差。虽然本研究中，由于纳入研究的病例有限，患者的总生存率与 的磷酸化水平无显著差异，但是与患者的总生存时间呈现正相关，提示 可抑制舌癌的进展。实用口腔医学杂志（），（）图 多重免疫荧光染色及相关性分析结果 图 影响 体外诱导成功率 实用口腔医学杂志（），（）图 激活 抑制舌癌细胞 信号通路及 表达 已经被诸多研 究 证 实 能 够 通 过 影 响 、家族和过 等，抑制炎症因子的表达影响肿瘤细胞炎症信号通路的激活 。为证实这一现象，本研究通过组织芯片多重免疫荧光染色观察到 磷酸化水平低的患者，其 巨噬细胞浸润率也更低，而 型巨噬细胞浸润率增加。即 的磷酸化水平与 型巨噬细胞浸润呈现负相关。虽然在本研究中，二者的相关性并无统计学意义（可能 和 的特异性有关），但是该结果提示了二者的间接关系。为明确 激活后对巨噬细胞极化是否直接相关，采用了单核细胞株体外条件性共培养观察肿瘤细胞 激活后对巨噬细胞的极化的影响。结果显示，当用二甲双胍处理舌癌细胞株后的上清处理诱导的 细胞，其 诱导成功率下降。上述结果提示，的磷酸化可能抑制巨噬细胞的 极化。课题组前一项研究提示在巨噬细胞中 的激活将导致 信号通路的抑制及其相关趋化因子的表达 。为探究 介导 巨噬细胞极化的可能机制，本研究采用二甲双胍激活 后，细胞的 信号通路激活受到抑制。同时，其下游巨噬细胞趋化因子 的表达下降。研究显示，可以招募巨噬细胞，同时促进巨噬细胞向 型极化。综上，本研究认为 激活后通过抑制 信号通路下调 的表达，进而抑制 型巨噬细胞的极化。鉴于 信号通路的广泛作用，可能不是其唯一的调节方式，尚需后续的进一步明确。综上所述，作为细胞的能量感受器和重要的蛋白激酶，参与了癌症的能量代谢和细胞增殖、迁移等多个细胞重要生物学过程，参与了复杂的信号通路交叉调控。然而，正是由于 的作用复杂性，其作为肿瘤的治疗靶点尚需进一步的探索。认为其作为肿瘤治疗的辅助靶点可能是今后的重要方向，正如 通过调控舌癌细胞表达 参与调控肿瘤微环境，可作为药物发挥肿瘤抑制作用的协同给药策略。参 考 文 献 ，（）：，（）（），（）：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，：（）？，（）：，实用口腔医学杂志（），（）（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：（），（）：（收稿：修回：）檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱檱殗殗殗殗本刊参考文献著录格式参考文献请按 文后参考文献著录规则 著录。请参阅近 年公开发表的文章。著录格式如下：书籍 序号 主要责任者 题名：其他题名信息 文献类型标志（电子文献必备，其他文献任选）其他责任者（任选）版本项 出版地：出版者，出版年：引文页码 引用日期（联机文献必备，其他电子文献任选）获取和访问路径（联机文献必备）期刊 序号 作者（位作者以内者全列出，中间加逗号；位以上作者，写出前 位作者，后加“，等”或外文与之相应之词，西文作者姓名写法应姓前名缩写于后）题名 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