GA∕T 1784-2021 法庭科学 疑似毒品中α-PBP、α-PVP和4-F-α-PVP检验 液相色谱和液相色谱-质谱法(公共安全).pdf

ICS 13.310 CCS A 92 GA 中 华 人民 共 和国 公 共安 全 行业 标 准 GA/T 法庭科学 疑似毒品中-PBP、-PVP 和4-F-PVP 检验 液相色谱和液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for -PBP, -PVP and 4-F-PVP in suspected drugsLC and LC-MS -发布 -实施 中华人民共和国公安部 发 布 GA/T I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 （SAC/TC 179/SC 1） 提出并归口。 本文件起草单位： 公安部物证鉴定中心、 黑龙江省公安厅刑事技术总队、 公安部禁毒情报技术中心。 本文件主要起草人：钱振华、杨虹贤、赵彦彪、郑珲、张春水、张吉林、张大雷、乔宏伟、赵阳、常颖、李彭、郑晓雨、闻武、翟晚枫、刘克林、高利生。 GA/T 1 法庭科学 疑似毒品中 -PBP、-PVP 和 4-F-PVP 检验 液相色谱和液相色谱-质谱法 1 范围 本文件规定了法庭科学领域疑似毒品样品中1-苯基-2-(N-吡咯烷基)-1-丁酮（-PBP）、1-苯基-2-(N-吡咯烷基)-1-戊酮 （-PVP） 和1-(4-氟苯基)-2-(N-吡咯烷基)-1-戊酮 （4-F-PVP） 的液相色谱-质谱 （LC-MS）定性检验方法和液相色谱（LC）定量检验方法。 本文件适用于法庭科学领域疑似毒品样品中-PBP、-PVP和4-F-PVP的定性分析和定量分析。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27418 测量不确定度评定和表示 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 对疑似毒品样品中的 -PBP、-PVP、4-F-PVP（化合物基本信息参见附录 A）进行提取。采用液相色谱-质谱检测，以保留时间、质谱特征离子对和离子对丰度比作为定性判断依据；采用液相色谱检测，以色谱峰面积作为定量依据，用外标单点法或外标标准曲线法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为色谱纯，试剂包括： a） 乙腈； b） 甲醇； c） 浓磷酸； d） 三乙胺； e） 甲酸； f） 0.1%（v/v）甲酸水溶液：以配制1000mL为例，量取甲酸1mL，加水定容至1000mL的容量瓶中，摇匀，用真空抽滤泵过滤，超声波清洗器超声，即可使用； GA/T 2 g） 磷酸-三乙胺缓冲液：以配制1000mL为例，量取浓磷酸4.12mL，加入200mL水稀释；量取三乙胺5.56mL， 滴入上述磷酸溶液中； 加水定容至1000mL的容量瓶中， 摇匀， 用真空抽滤泵过滤，超声波清洗器超声，即可使用； h） 甲醇-磷酸-三乙胺缓冲液混合溶液：以配制500mL为例，量取100mL甲醇和400mL磷酸-三乙胺缓冲液，配制成甲醇：磷酸-三乙胺缓冲液=1:4（v/v）的混合溶液，摇匀，即可使用； i） 标准溶液： 1） 标准物质储备液： 1.0mg/mL-PBP、 -PVP、 4-F-PVP标准物质储备液， 04冷藏保存，有效期12个月； 2）标准工作溶液按实验需求分为以下四类： 定性用标准工作溶液： 移取-PBP、 -PVP、 4-F-PVP标准物质储备液各适量， 用0.1%甲酸水溶液稀释， 分别配制成100ng/mL的-PBP、 -PVP、 4-F-PVP标准工作溶液。 04冷藏保存，有效期7天； 定性质控标准工作溶液：移取-PBP、-PVP、4-F-PVP标准物质储备液各适量，用0.1%甲酸水溶液稀释， 分别配制成1ng/mL的-PBP、 -PVP、 4-F-PVP标准工作溶液。随用随配； 外标单点法定量用标准工作溶液：移取适量-PBP、-PVP、4-F-PVP标准物质储备液， 用甲醇稀释， 配制成0.1mg/mL的-PBP、 -PVP、 4-F-PVP标准工作溶液。 04冷藏保存，有效期3个月； 外标标准曲线法定量用标准工作溶液：使用-PBP、-PVP、4-F-PVP标准物质储备液，按标准物质储备液：磷酸-三乙胺缓冲液=1:4（v/v）的比例进行稀释，配制成0.5mg/mL的-PBP、-PVP、4-F-PVP标准工作溶液；再使用甲醇-磷酸-三乙胺缓冲液 混 合 溶 液 对 上 述 0.5mg/mL 的 标 准 工 作 溶 液 进 行 稀 释 ， 配 制 成 浓 度 为0.01mg/mL0.5mg/mL范围的-PBP、-PVP、4-F-PVP标准工作溶液，至少配制5个浓度。 5.2 材料 材料包括： a） 具盖离心管； b） 容量瓶； c） 有机系微孔滤膜：0.22m 或 0.45m； d） 水系微孔滤膜：0.22m。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a） 液相色谱仪（LC）：配有二极管阵列（DAD）或紫外检测器（UV）； b） 液相色谱-质谱仪（LC-MS）：配电喷雾离子源，具备MRM检测模式； c） 电子天平：定性检验实际分度值d0.1mg，定量检验实际分度值d0.01mg； d） 离心机； e） 振荡器； f） 真空抽滤泵； GA/T 3 g） 超声波清洗器； h） 移液器或移液管。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品制备 样品充分均质化，称取约 10mg 于具盖离心管中，加入 10mL 甲醇，密封并振荡 5min，以不低于4000r/min 离心 5min，取上清液，用 0.1%甲酸水溶液稀释 1000 倍，稀释液经 0.22 m 的水系微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液，供 LC-MS 分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 液相色谱-质谱仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a） 色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18 （1.7m，100mm2.1mm）或其他等效柱； 注： ACQUITY UPLC CSH C18柱为 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b） 柱温：40 C； c） 流动相：A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈； d） 洗脱：梯度洗脱程序见表 1； 表 1 梯度洗脱程序 时间 min 流动相 A 流动相 B 0 98% 2% 1.5 98% 2% 6.5 10% 90% 8.0 10% 90% 8.1 98% 2% 12 98% 2% e） 流速：0.4mL/min； f） 进样量：1L； g） 离子源：电喷雾离子源； h） 检测模式：正离子模式； i） 离子喷雾电压：5500V； j） 离子源温度：550 C； k） 碰撞气（CAD） 、气帘气（CUR） 、雾化气（GS1） 、辅助气（GS2）均为高纯氮气，使用前调节各气流的流量以使质谱灵敏度达到检测要求； l） -PBP、-PVP和4-F-PVP的离子对、去簇电压（DP）和碰撞能量（CE） ：见表2。 GA/T 4 表 2 质谱参考条件 名称 母离子 m/z 子离子 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV -PBP 218.1 91.1 46 31 112.1 23 -PVP 232.1 126.1 30 33 161.1 25 4-F-PVP 250.1 109.1 41 31 126.1 35 7.1.2.2 进样 分别吸取样品空白（0.1%甲酸水溶液）、样品溶液、标准溶液空白（0.1%甲酸水溶液）和定性用标准工作溶液， 按7.1.2.1条件进样分析。 或根据实际需求， 再分别吸取标准溶液空白 （0.1%甲酸水溶液）和定性质控标准工作溶液，按7.1.2.1条件进行分析。 7.2 定量分析 7.2.1 外标单点法 7.2.1.1 含量预分析 根据实际需求，称取 10mg100mg 样品置于具盖离心管中，加入 10mL 甲醇，密封并振荡 10min，以不低于 4000r/min 离心 5min，取上清液作为样品溶液，按上清液：磷酸-三乙胺缓冲液=1:4（v/v）的比例进行稀释，稀释液经有机系微孔滤膜过滤，供 LC 分析。或根据实际需要，当样品溶液中目标物的浓度过高时，将上清液用甲醇稀释后作为样品溶液，按稀释液：磷酸-三乙胺缓冲液=1:4（v/v）的比例进行再稀释， 经有机系微孔滤膜过滤， 供 LC 分析。 采用外标单点法定量用标准工作溶液作为定量参照。标准工作溶液采用同样方式稀释，移取 0.1mg/mL 标准工作溶液适量，按标准工作溶液:磷酸-三乙胺缓冲液=1:4（v/v）的比例进行稀释，稀释液经有机系微孔滤膜过滤，供 LC 分析。 按照公式（1）计算样品中目标物的预分析百分含量。 ()302+=100%CAVVVAVm012（1） 式中： 样品中目标物的百分含量，用百分比（%）表示； C0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； A 样品溶液中目标物的色谱峰面积值； A0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积值； V1样品初次定容体积，单位为毫升（mL）； V2从 V1中移取的体积，单位为毫升（mL）； V3将 V2稀释时加入甲醇的体积，单位为毫升（mL）； m样品的称量重量，单位为毫克（mg）。 GA/T 5 7.2.1.2 准确定量 7.2.1.2.1 称量重量的计算 根据预分析中目标物含量测定结果，选择合适的定容体积、稀释倍数（样品提取操作参数参见附录B 中表 B.1） ，并按照公式（2）计算出样品称量重量（m） ，使样品溶液中目标物的浓度在所用标准工作溶液浓度的（10030）%范围内。 0CVDm=（2） 式中： m称量重量，单位为毫克（mg） ； C0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL） ； V初次定容体积，单位为毫升（mL） ； D稀释倍数； 样品中目标物的预分析百分含量，用百分比（%）表示。 7.2.1.2.2 样品制备 根据7.2.1.2.1计算结果， 平行称取样品2份于具盖离心管中 （需要对定量结果进行不确定度评定时，至少平行称取 6 份） ，根据预分析含量结果，加入相应初次定容体积的甲醇，密封并振荡 10min，以不低于 4000r/min 离心 5min，取上清液作为样品溶液，按上清液：磷酸-三乙胺缓冲液=1:4（v/v）的比例进行稀释，稀释液经有机系微孔滤膜过滤，供 LC 分析；当样品溶液需要稀释时，移取上清液至另一试管中，按照稀释倍数用甲醇进行稀释定容，按稀释液：磷酸-三乙胺缓冲液=1:4（v/v）的比例进行再稀释，经有机系微孔滤膜过滤，供 LC 分析。 7.2.1.2.3 仪器检测 7.2.1.2.3.1 液相色谱仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a） 检测器：二极管阵列或可变波长紫外检测器； b） 色谱柱：C18 （5m，150mm 4.6mm） ； c） 柱温：35 C； d） 流动相：A：磷酸-三乙胺缓冲液，B：乙腈； e） 洗脱：梯度洗脱程序见表 3； 表 3 梯度洗脱程序 时间 min 流动相 A 流动相 B 0 80% 20% 7.5 80% 20% 7.7 20% 80% 9.5 20% 80% 9.7 80% 20% 15 80% 20% GA/T 6 f） 流速：1.0mL/min； g） 进样量：5L； h） 检测波长：254nm，带宽：4nm。 7.2.1.2.3.2 进样 分别吸取样品空白（甲醇-磷酸-三乙胺缓冲液混合溶液）、样品溶液、标准溶液空白（甲醇-磷酸-三乙胺缓冲液混合溶液）和外标单点法定量用标准工作溶液，按7.2.1.2.3.1条件进样分析。当称取2份样品时，每份样品进样23针。 7.2.1.2.4 计算含量 按照公式（1）计算样品中目标物百分含量。 7.2.2 外标标准曲线法 7.2.2.1 标准工作曲线绘制 采用5.1中配制的外标标准曲线法定量用标准工作溶液及标准溶液空白（甲醇-磷酸-三乙胺缓冲液混合溶液）分别绘制成线性范围为0.01mg/mL0.5mg/mL的-PBP、-PVP、4-F-PVP标准工作曲线。 7.2.2.2 样品制备 平行称取样品2份各约25mg于具盖离心管中， 加入10mL甲醇， 密封并振荡10min， 以不低于4000r/min离心5min，离心后取上清液，按上清液：磷酸-三乙胺缓冲液=1:4（v/v）的比例进行稀释，稀释液用有机系微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液，供LC分析。 7.2.2.3 仪器检测 7.2.2.3.1 液相色谱仪条件 同7.2.1.2.3.1。 7.2.2.3.2 进样 分别吸取样品空白（甲醇-磷酸-三乙胺缓冲液混合溶液） 、样品溶液，按7.2.2.3.1条件进样分析，每份样品平行进样23针。 7.2.2.4 计算含量 以外标标准曲线法定量用标准工作溶液中目标物的峰面积值为纵坐标、 外标标准曲线法定量用标准工作溶液中目标物的浓度为横坐标进行线性回归，得到线性方程。根据样品溶液中目标物的峰面积值，按公式（3）计算出样品中目标物的百分含量。 D100%Y -bV=am（）（3） 式中： 样品中目标物的百分含量，用百分比（%）表示； Y 样品溶液中目标物的峰面积值的平均值； b 线性方程的截距； V样品溶液的定容体积，单位为毫升（mL） ； GA/T 7 D样品溶液的稀释倍数，等于 5； a 线性方程的斜率； m样品的称量重量，单位为毫克（mg） 。 8 结果评价与表述 8.1 定性结果评价 阳性结果评价： 在相同条件下进行测定时， 样品溶液中目标物与浓度接近的定性用标准工作溶液中的目标物相比，色谱峰保留时间一致（相对误差在 2.5%之内）、定性离子对（至少两对）一致，且离子对丰度比相对偏差不超过表4规定的范围，样品空白无干扰，则可判断样品中检出目标物。-PBP、-PVP、4-F-PVP的MRM色谱图参见附录C。 表 4 离子对丰度比的最大允许相对偏差范围 离子对丰度比 50% 20%50% 10%20% 10% 最大允许相对偏差 20% 25% 30% 50% 阴性结果评价： 样品溶液中未检出目标物特征离子对， 定性质控标准工作溶液中检出目标物特征离子对，标准溶液空白无干扰，则可判断样品中未检出目标物。 8.2 定量结果评价 8.2.1 相对相差检验 平行称取2份样品时，测定数据按照公式（4）计算相对相差（RD）。 12100%-RD= （4） 式中： RD相对相差，用百分比（%）表示； 1、2两份样品平行定量测定的含量数值； 两份样品平行定量测定的含量平均值。 当RD10%时，数据有效；当RD10%时，需要重新检验。 8.2.2 异常值检验 平行称取6份样品时，测定数据按照公式（5）进行Grubbs可疑值判别。 i0i-G =s（5） 式中： i可疑值； 06 个（5 个）数据的平均值； s6 个（5 个）数据的单次测定标准差； GiGrubbs 统计值。 当测定次数n=6时，G6（95）=1.822；当测定次数n=5时，G5（95）=1.672。 GiGn（95）时，数据有效，GiGn（95）时，应剔除该数据，但只能剔除1个数据，否则本次测定无效，需要重新检验。 GA/T 8 8.2.3 定量结果计算 平行称取 2 份样品时，以 2 份样品含量测定的平均值作为定量结果。 平行称取 6 份样品时，以 6 份（5 份）样品含量测定的平均值作为定量结果。 8.3 结果表述 阳性结果应表述为：从样品中检出-PBP/ -PVP/ 4-F-PVP成分。含量用百分比表示。 阴性结果应表述为：从样品中未检出-PBP/ -PVP/ 4-F-PVP成分。 8.4 测量不确定度的评定与表述 如需提供测量不确定度，定量结果的不确定度评定与表述按 GB/T 27418 执行。 GA/T 9 附录 A （资料性） 化合物基本信息 -PBP、-PVP、4-F-PVP 基本信息见表 A.1。 表 A.1 -PBP、-PVP、4-F-PVP 基本信息 中文名称 英文名称 化学式 结构式 CAS 号 1-苯基-2-(N-吡咯烷基)-1-丁酮 1-Phenyl-2-(1-pyrrolidinyl)butan-1-one C14H19NO 13415-82-2 1-苯基-2-(N-吡咯烷基)-1-戊酮 1-Phenyl-2-(1-pyrrolidinyl)pentan-1-one C15H21NO 14530-33-7 1-(4-氟苯基)-2-(N-吡咯烷基)-1-戊酮 1-(4-Fluorophenyl)-2-(1-pyrrolidinyl)pentan-1-one C15H20FNO 850352-62-4 GA/T 10 附录 B （资料性） 外标单点法样品提取操作参数 外标单点法样品提取操作参考参数见表 B.1。 表 B.1 外标单点法样品提取操作参考参数 预分析含量 初次定容体积 mL 稀释倍数 外标单点法定量用 标准工作溶液浓度 mg/mL 50%100% 20 21 0.1 30%50% 20 11 0.1 10%30% 10 11 0.1 5%10% 30 - 0.1 2%5% 20 - 0.1 1%2% 10 - 0.1 GA/T 11 附录 C （资料性） -PBP、-PVP 和 4-F-PVP 相关谱图 C.1 -PBP、-PVP 和 4-F-PVP 的液相色谱图见图 C.1图 C.3。 图 C.1 -PBP 液相色谱图 图 C.2 -PVP 液相色谱图 0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min-0.2-0.10.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0mAU(x100)检测器 A Ch1:254nm 3.6610.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0.00.51.01.52.02.53.03.54.0mAU(x100)检测器 A Ch1:254nm 5.281GA/T 12 图 C.3 4-F-PVP 液相色谱图 C.2 -PBP、-PVP 和 4-F-PVP 的 MRM 色谱图见图 C.4图 C.6。 图 C.4 -PBP MRM 色谱图 0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0.00.51.01.52.02.53.03.54.0mAU(x100)检测器 A Ch1:254nm 6.657GA/T 13 图 C.5 -PVP MRM 色谱图 图C.6 4-F-PVP MRM色谱图