A1类清道夫受体通过促进M2型巨噬细胞极化增加脂肪组织产热能力.pdf

基金项目 国家自然科学基金（82170444）；江苏省高等学校自然科学研究重大项目（20KJA310007）通信作者（Corresponding author），Email：A1类清道夫受体通过促进M2型巨噬细胞极化增加脂肪组织产热能力张天天，李金杰，柏雪雅，柏惠，陈琪，朱旭冬*江苏省心血管病靶向干预研究重点实验室，南京医科大学基础医学院病理生理学系，江苏南京211166摘要 目的：探讨A1类清道夫受体（macrophage scavenger receptor 1，MSR1）在低温刺激诱导白色脂肪产热进程中的作用及其机制。方法：正常饮食（common diet，CD）的野生型小鼠（MSR1+/+）和MSR1缺失表达小鼠（MSR1-/-）分别给予低温刺激1 d或者 14 d 后，通过 qRTPCR、Western blot 和免疫组织化学染色检测皮下白色脂肪组织（subcutaneous white adipose tissue，scWAT）和棕色脂肪组织（brown adipose tissue，BAT）中脂肪产热能力标志物（UCP1、Cidea和Cox8b）的表达。qRTPCR和流式细胞术检测正常饮食的MSR1+/+和MSR1-/-小鼠给予低温刺激14 d后，小鼠scWAT中巨噬细胞极化情况。建立高脂饮食（highfat diet，HFD）诱导的小鼠肥胖模型，监测CD和HFD 12周的MSR1+/+和MSR1-/-小鼠体重变化，并使用代谢笼监测小鼠耗氧量和产热量变化；qRTPCR和免疫组织化学染色检测HFD 12周的小鼠给予低温刺激7 d后，小鼠scWAT和BAT中产热基因表达。体外实验应用巨噬细胞条件培养基刺激小鼠前脂肪细胞分化，待分化成熟后应用qRTPCR检测产热基因表达。结果：慢性低温刺激下，与MSR1+/+小鼠相比，MSR1-/-小鼠脂肪组织产热基因表达明显降低。进一步，MSR1-/-小鼠scWAT中M2型巨噬细胞数量明显减少。HFD喂养12周后，MSR1-/-小鼠体重增加更为明显，并且耗氧量和产热量明显降低。低温刺激下，与MSR1+/+HFD小鼠相比，MSR1-/-HFD小鼠脂肪产热能力明显降低。体外细胞研究发现，与MSR1+/+小鼠腹腔巨噬细胞条件培养基诱导的成熟脂肪细胞相比，MSR1-/-小鼠腹腔巨噬细胞条件培养基诱导的成熟脂肪细胞产热基因表达明显降低。结论：低温刺激下，MSR1通过增加M2型巨噬细胞极化促进小鼠脂肪组织产热。关键词 A1类清道夫受体；低温刺激；脂肪产热；巨噬细胞M2型极化中图分类号 R329.2文献标志码 A文章编号 10074368（2023）10133309doi：10.7655/NYDXBNS20231001MSR1 increases the thermogenic capacity of adipose tissue by promoting the polarizationof M2 macrophagesZHANG Tiantian，LI Jingjie，BAI Xueya，BAI Hui，CHEN Qi，ZHU Xudong*Key Laboratory of Targeted Intervention of Cardiovascular Disease，Department of Pathophysiology，School of BasicMedicine，Nanjing Medical University，Nanjing 211166，ChinaAbstract Objective：This study aims to investigate the role and mechanism of macrophage scavenger receptor 1（MSR1）in theprocess of white adipose thermogenesis induced by cold exposure.Methods：The expression of MSR1 and markers of the thermogeniccapacity of adipose（UCP1，Cidea，Cox8b）in subcutaneous white adipose tissue（scWAT）and brown adipose tissue（BAT）of wild typemice（MSR1+/+）and MSR1 knockout mice（MSR1-/-）fed with common diet（CD）were detected by qRTPCR，Western blot andimmunohistochemistry after 1 or 14 days of cold exposure.The polarization of macrophages in scWAT of MSR1+/+and MSR1-/-mice fedwith CD after 30 days of cold exposure were detected by qRTPCR and flow cytometry.Obese mouse model was established by high fatdiet（HFD），the weight changes were monitored in MSR1+/+and MSR1-/-mice fed with CD or HFD for 12 weeks，and the metabolic cagemethod was used to monitor the changes of O2consumption and heat production.The expression of thermogenic genes in scWAT andBAT of mice fed with HFD for 12 weeks were detected by qRTPCR and immunohistochemistry after 7 days of cold exposure.In vitro，macrophage conditioned medium was used to stimulate the differentiation of mouse preadipocytes，and the expression of thermogenic基础研究南京医科大学学报（自然科学版）Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences）第43卷第10期2023年10月1333南京医科大学学报第43卷第10期2023年10月genes of mature adipocytes were detected by qRTPCR.Results：Compared with MSR1+/+mice，the expression of thermogenic genes inadipose tissue of MSR1-/-mice was significantly decreased.Further，the number of M2 macrophages in scWAT of MSR1-/-micedecreased significantly.After fed with HFD for 12 weeks，MSR1-/-mice had significantly higher weight，lower O2consumption and heatproduction.The thermogenic capacity of adipose tissue in MSR1-/-HFD mice was significantly reduced compared with MSR1+/+HFDmice after cold exposure.In vitro cell studies，compared with the mature adipocytes induced by peritoneal macrophage conditionedmedium in MSR1+/+mice，the expression of thermogenic genes in mature adipocytes induced by peritoneal macrophage conditionedmedium in MSR1-/-mice was significantly reduced.Conclusion：After cold exposure，MSR1 increases the thermogenic capacity ofadipose tissue by promoting the polarization of M2 macrophages.Key words macrophage scavenger receptor 1；cold exposure；adipose thermogenesis；macrophage M2 polarizationJ Nanjing Med Univ，2023，43（10）：13331341心血管疾病发病率和死亡率在世界范围内仍在逐年上升。肥胖、高血压和糖尿病等多种危险因素都与心血管疾病发生相关1。其中，肥胖可归因于能量摄入与消耗失衡，表现为过多脂质在脂肪组织的异常积聚，并伴随有大量免疫细胞浸润。肥胖可导致2型糖尿病、高血压、脑卒中和多种类型癌症（胃癌、肝癌、胆囊癌、卵巢癌等）的发生2。与主要负责能量存储的白色脂肪细胞不同，棕色脂肪细胞由于富含有大量的线粒体，具备较强的产热能力3。近年的研究表明，白色脂肪细胞在特殊条件刺激下可以转化为具有产热能力的米色脂肪细胞4。米色脂肪细胞可能成为治疗糖尿病、慢性炎症和肥胖等代谢紊乱疾病的新型靶细胞5。A1类清道夫受体（macrophage scavenger receptor 1，MSR1）是一类巨噬细胞表面的模式识别受体，可以介导巨噬细胞多种功能，包括脂质摄取、细胞凋亡、细胞趋化和极化分型等6。MSR1在动脉粥样硬化、心肌梗死和肥胖诱导的高血压等心血管疾病发生发展中发挥重要保护作用。已有研究表明，慢性低温刺激诱导下，皮下白色脂肪组织（subcutaneouswhite adipose tissue，scWAT）中的M2型巨噬细胞大量积聚，并促进脂肪细胞的活化和产热7-8。本课题组前期研究发现，MSR1可以促进肥胖小鼠附睾脂肪组织中巨噬细胞的M2型分化，发挥拮抗炎症的作用，提示 MSR1 也可能调控脂肪细胞的产热能力。因此，本研究拟探讨MSR1在低温刺激诱导脂肪产热进程中的作用及其机制，寻找新的肥胖相关性疾病干预靶点。1材料和方法1.1材料C57BL/6背景的MSR1基因敲除小鼠（MSR1-/-）购自美国Jackson动物研究中心。C57BL/6小鼠购自江苏省医药动物实验中心。UCP1抗体（Abcam公司，英国）；牛血清白蛋白、HEPES酸（Biosharp公司，美国）；BCA Protein AssayReagent Kit（Pierce 公司，美国）；Electrochemi Luminescence（ECL）（Amersham Biosciences公司，美国）；免疫组化ABC染色试剂盒（Santa Cruz Biotechnology公司，美国）；RNA提取试剂（TaKaRa公司，日本）；实 时 荧 光 定 量 PCR（realtime quantitative PCR，qRTPCR）试剂盒（Roche公司，美国）；各种 qRTPCR引物序列由美国Invitrogen公司合成。1.2方法1.2.1实验动物模型及分组选取8周龄正常饮食（common diet，CD）的雄性MSR1+/+小鼠作为野生型对照组，MSR1-/-小鼠作为敲除型实验组，分别将两种小鼠置于室温（25）或低温条件（6）下持续刺激1 d或者14 d，或给予两种小鼠连续12周的高脂饮食（high fat diet，HFD）后置于室温或低温条件下持续刺激7 d（HFD喂养的肥胖小鼠因代谢紊乱，冷刺激14 d后整体状态不佳，故采用冷刺激7 d方案）。正常饮食实验模型分为4组：MSR1+/+25 组、MSR1-/-25 组、MSR1+/+6 组、MSR1-/-6 组；高脂饮食实验模型分为 4 组：MSR1+/+HFD 25 组、MSR1-/-HFD 25 组、MSR1+/+HFD 6 组、MSR1-/-HFD 6 组。所有实验操作均获得南京医科大学动物伦理委员会批准（IACUC2009003）。1.2.2MSR1-/-小鼠基因型鉴定提取 MSR1-/-小鼠鼠尾 DNA，设定 PCR 反应体系扩增产物，配制3%琼脂糖凝胶，待胶凝固后上样，插上电极，DNA 由负极向正极电泳，电压为200 V。当条带电泳至胶2/3处时，观察DNA成像，1334表1qRTPCR引物序列Table 1Primer sequences used in qRTPCR基因UCP1CideaCox8bCd68TnfaIL6Mgl118S上游引物（53）AGGCTTCCAGTACCATTAGGTTGCTCTTCTGTATCGCCCAGTGAACCATGAAGCCAACGACTCTTCCCACAGGCAGCACAGACGGCATGGATCTCAAAGACGTTCTCTGGGAAATCGTGGATGAGAAAGGCTTTAAGAACTGGGCATTCGAACGTCTGCCCTATC下游引物（53）CTGAGTGAGGCAAAGCTGATTTGCCGTGTTAAGGAATCTGCTGGCGAAGTTCACAGTGGTTCCAATGATGAGAGGCAGCAAGAGGAGATAGCAAATCGGCTGACGGGAAATTGGGGTAGGAAGGAGACCACCTGTAGTGATGTGGGCCTGCTGCCTTCCTTGGA其中MSR1+/+为154 bp；MSR1-/-为202 bp。1.2.3小鼠巨噬细胞清除实验给予野生型小鼠尾静脉注射氯膦酸盐脂质体（clodronate liposomes）或对照脂质体（PBS liposomes）（200 L/只），用以清除巨噬细胞。1.2.4造模小鼠体重监测与代谢笼检测每周检测对照组与实验组小鼠体重并做好记录。CD和HFD小鼠造模结束后，送至南京医科大学实验动物中心进行代谢笼检测，包括小鼠耗氧量、产热量。1.2.5小鼠造模标本收取与处理造模结束后麻醉小鼠，进行眼球后静脉丛取血，并收取小鼠scWAT和棕色脂肪组织（brown adiposetissue，BAT），经液氮速冻，置于-80 保存，部分标本置于4%多聚甲醛溶液中进行固定。1.2.6冰冻组织免疫荧光染色选取小鼠脂肪组织冰冻切片，室温放置30 min后，PBS清洗，10%牛血清封闭，加入巨噬细胞标志物F4/80抗体（Abcam公司，英国）4 孵育过夜。清洗，二抗室温避光孵育12 h，PBS清洗，封片，滴加12滴DAPI覆盖组织切片，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。1.2.7免疫组织化学染色选取小鼠脂肪组织进行石蜡切片，将切片脱蜡至水，依次用3%H2O2消除内源性过氧化物酶活性，10%牛血清封闭，加入UCP1抗体（Abcam公司，英国）4 孵育过夜。清洗，生物素标记工作液室温避光孵育20 min，PBS清洗，碱性磷酸酶标记的工作液室温孵育20 min，PBS冲洗，显色剂显色15 min，充分清洗，复染，脱水，透明，封片，荧光显微镜下观察。1.2.8qRTPCR实验TRIzol法提取小鼠脂肪组织总RNA，测定RNA浓度，随后逆转录为cDNA。通过qRTPCR扩增目的基因，指标18S作为内参，校正每个样本目的基因的Ct值，以2-Ct值表示基因的相对表达水平，引物序列见表1。1.2.9Western blot实验提取小鼠脂肪组织总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度，每个样品孔按40 g蛋白总量上样，随后进行电泳、转膜、封闭、一抗4孵育过夜、二抗室温孵育2 h，最后进行显色成像。1.2.10流式细胞术检测小鼠脂肪组织中血管基质成分收取小鼠scWAT置于1%FBS中，滤纸吸干，充分剪碎组织，移至离心管中。使用型胶原酶消化60 min。200目筛网过滤至EP管，离心。加入1 mL红细胞裂解液，离心，PBS洗3遍。加入200 L PBS重悬，加入相应抗体，室温避光孵育60 min，离心，PBS洗3遍。加入250 L PBS重悬并上机检测。1.2.11小鼠原代白色前脂肪细胞分离并诱导分化小鼠处死后75%乙醇浸泡，收取小鼠scWAT置于预冷的PBS中。消化、过滤、种板。细胞生长完全融合后进行诱导分化。1.2.12小鼠原代腹腔巨噬细胞分离与培养小鼠处死后 75%乙醇浸泡，用注射器将含有100 g/mL肝素的PBS注入小鼠腹腔中进行冲洗，将冲洗液吸取入针管内，注入离心管中。离心后弃上清，加入培养液重悬，放置在 37 培养箱中培养。1.3统计学方法使用GraphPad Prism 8软件进行数据分析。数据均用均数标准误（x sx）表示。在统计分析前对数据的分布进行假设检验后，对满足正态性和方差齐性的数据采用两样本独立t检验或单因素方差分析，对不满足正态性或方差齐性的数据采用KruskalWallis H检验。P 0.05为差异有统计学意义。第43卷第10期2023年10月张天天，李金杰，柏雪雅，等.A1类清道夫受体通过促进M2型巨噬细胞极化增加脂肪组织产热能力 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1333-13411335南京医科大学学报第43卷第10期2023年10月ABCDEPBS liposomes 25 Clodronate liposomes 25 PBS liposomes 6 Clodronate liposomes 6 20151050Cidea mRNA相对表达量*PBS liposomes 25 Clodronate liposomes 25 PBS liposomes 6 Clodronate liposomes 6 20151050Cox8b mRNA相对表达量*PBS liposomes 25 Clodronate liposomes 25 PBS liposomes 6 Clodronate liposomes 6 A：免疫荧光染色检测清除野生型小鼠巨噬细胞并低温刺激14 d后小鼠scWAT中F4/80+（绿色荧光）巨噬细胞，比例尺为50 m（n：35）；BD：qRTPCR 检测清除 MSR1+/+小鼠巨噬细胞并低温刺激 14 d 后，小鼠 scWAT 中 UCP1（B）、Cidea（C）和 Cox8b（D）表达量。两组比较，*P 0.05，*P 0.001（n：68）；E：qRTPCR检测低温刺激野生型小鼠14 d后，小鼠scWAT中MSR1表达量（n=6）。图1清除野生型小鼠巨噬细胞并低温刺激14 d后小鼠scWAT的产热能力以及低温刺激14 d后小鼠scWAT中MSR1的表达Figure 1The thermogenic capacity of scWAT of WT mice after macrophages clearance and 14 days of cold exposure，andMSR1 expression in adipose tissue of mice after 14 days of cold exposure6040200UCP1 mRNA相对表达量*PBS liposomes 25 Clodronate liposomes 25 PBS liposomes 6 Clodronate liposomes 6 43210*25 6 MSR1 mRNA相对表达量2结果2.1清除巨噬细胞可以抑制低温刺激诱导的scWAT产热能力且低温刺激促进小鼠scWAT中MSR1的表达为了研究巨噬细胞在低温刺激诱导的脂肪组织产热中的作用，给予8周龄雄性野生型小鼠氯膦酸盐脂质体处理，清除巨噬细胞。免疫荧光结果显示F4/80+巨噬细胞清除成功（图1A）。随后置于室温或寒冷条件下处理14 d，期间正常饮食喂养。造模结束后，提取小鼠scWAT总RNA。qRTPCR结果显示，野生型小鼠清除巨噬细胞后scWAT产热能力标志物（UCP1、Cidea、Cox8b）基因的表达明显低于对照小鼠（图1BD）。为了进一步探究低温刺激对小鼠脂肪组织MSR1表达的影响。将8周龄雄性野生型小鼠置于室温或寒冷条件下处理14 d，期间正常饮食喂养。造模结束后，提取小鼠scWAT总RNA。qRTPCR结果显示，小鼠给予寒冷刺激后scWAT中MSR1表达量明显高于对照小鼠（图1E）。2.2MSR1不影响急性低温刺激情况下小鼠脂肪组织的产热能力为了探究 MSR1 在小鼠脂肪产热过程中的作用，使用MSR1-/-小鼠进行研究。首先对MSR1-/-小鼠进行基因型鉴定（图2A），并通过Western blot检测了小鼠脂肪组织中MSR1的表达情况（图2B）。将8周龄雄性MSR1+/+和MSR1-/-小鼠置于室温或寒冷条件下处理1 d（短期急性冷刺激），期间正常饮食喂养。造模结束后，提取4组小鼠scWAT和BAT总RNA。qRTPCR结果显示，置于6 条件下小鼠scWAT和BAT中产热指标（UCP1、Cidea和Cox8b）表达量均高于室温条件下小鼠（部分指标未达到统计学差异）；MSR1表达缺失小鼠与野生型对照小鼠相比差异无统计学意义（图2CH），说明在短期（1 d）寒冷刺激条件下MSR1不影响脂肪组织产热能力。2.3低温刺激14 d后MSR1-/-小鼠脂肪组织的产热能力显著降低将8周龄雄性MSR1+/+和MSR1-/-小鼠置于室温或寒冷条件下处理14 d（长期慢性冷刺激），期间正常饮食喂养。14 d后，提取小鼠scWAT和BAT总RNA以及小鼠scWAT总蛋白。qRTPCR结果显示，置于低温条件下，小鼠脂肪组织中UCP1、Cidea和Cox8b1336ABCDEFGH86420MSR1+/+25UCP1 mRNA相对表达量MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*543210MSR1+/+25Cidea mRNA相对表达量MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*43210MSR1+/+25Cox8b mRNA相对表达量MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*86420MSR1+/+25UCP1 mRNA相对表达量MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*43210MSR1+/+25Cidea mRNA相对表达量MSR1-/-25MSR1+/+6*MSR1-/-686420MSR1+/+25Cox8b mRNA相对表达量MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6MSR1+/+MSR1-/-202 bp154 bpMSR1+/+MSR1-/-70 kDa37 kDaMSR1GAPDHA：MSR1+/+和MSR1-/-小鼠基因型鉴定（n=3）；B：Western blot检测MSR1+/+和MSR1-/-小鼠scWAT中MSR1的表达（n=3）；CE：qRTPCR检测小鼠给予低温刺激1 d后，scWAT中UCP1（C）、Cidea（D）和Cox8b（E）表达量；FH：qRTPCR检测小鼠给予低温刺激1 d后，BWT中UCP1（F）、Cidea（G）和Cox8b（H）表达量。两组比较，*P 0.05，*P 0.01（n：46）。图2低温刺激MSR1+/+和MSR1-/-小鼠1 d后小鼠脂肪组织的产热能力Figure 2The thermogenic capacity of adipose tissue of MSR1+/+and MSR1-/-mice after 1 day of cold exposure表达量明显高于室温条件下小鼠；MSR1-/-小鼠给予6 处理，scWAT和BAT中UCP1、Cidea和Cox8b表达量明显低于MSR+/+6 小鼠（图3AF）。Westernblot 结果同样显示，置于低温环境下 MSR1+/+和MSR1-/-小鼠脂肪组织中 UCP1 表达水平显著高于室温条件下小鼠；与MSR+/+6 小鼠相比，MSR1-/-6 小鼠scWAT中UCP1表达水平明显降低（图3G、H），说明MSR1可以促进慢性冷刺激诱导的脂肪组织产热。2.4低温刺激情况下，与对照组相比MSR1-/-小鼠scWAT中M2型巨噬细胞数量降低为了探究低温刺激下MSR1对小鼠脂肪组织巨噬细胞极化的影响，进一步检测了给予小鼠低温刺激14 d后，小鼠脂肪组织中M2型巨噬细胞的数量情况。14 d低温刺激后，提取小鼠scWAT总RNA和基质血管成分（stromal vascular fraction，SVF），qRTPCR结果显示，MSR1-/-6 小鼠scWAT中Mrc2和Mgl1的表达量均明显低于MSR+/+6 小鼠（图4A、B）。对scWAT中的SVF进行流式细胞术检测，结果同样显示，与MSR+/+6 小鼠相比，MSR1-/-6 小鼠F4/80+CD11b+CD206+M2 型巨噬细胞比例明显降低，F4/80+CD11b+CD11c+M1型巨噬细胞比例增高（图4C、D）。以上结果表明，低温刺激下，MSR1促进小鼠脂肪组织产热是通过诱导脂肪组织M2型巨噬细胞的极化实现的。2.5MSR1-/-肥胖小鼠脂肪组织产热能力显著降低为了进一步探究MSR1对肥胖小鼠脂肪组织产热的影响。给予6周龄雄性MSR1+/+和MSR1-/-小鼠CD 或 HFD 连续喂养 12 周，每周监测小鼠体重变化。12周后，使用代谢笼法监测小鼠耗氧量和产热量变化。将高脂造模MSR1+/+和MSR1-/-小鼠分别置于常温或低温环境刺激7 d后，提取小鼠scWAT和第43卷第10期2023年10月张天天，李金杰，柏雪雅，等.A1类清道夫受体通过促进M2型巨噬细胞极化增加脂肪组织产热能力 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1333-13411337南京医科大学学报第43卷第10期2023年10月ABCDEFGH151050MSR1+/+25MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*UCP1 mRNA相对表达量33 kDa37 kDaUCP1GAPDHMSR1+/+25 MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-686420MSR1+/+25Cidea mRNA相对表达量MSR1-/-25MSR1+/+6*MSR1-/-686420MSR1+/+25MSR1-/-25MSR1+/+6*MSR1-/-6Cox8b mRNA相对表达量151050MSR1+/+25MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*UCP1 mRNA相对表达量86420MSR1+/+25MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*Cidea mRNA相对表达量86420MSR1+/+25MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*Cox8b mRNA相对表达量0.100.080.060.040.020MSR1+/+25MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*UCP1相对表达量AC：qRTPCR检测小鼠给予低温刺激14 d后，scWAT中UCP1（A）、Cidea（B）和Cox8b（C）表达量；DF：qRTPCR检测小鼠给予低温刺激14 d后，BAT中UCP1（D）、Cidea（E）和Cox8b（F）表达量。两组比较，*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001（n=6）；G、H：Western blot检测小鼠给予低温刺激14 d后，scWAT中UCP1表达水平（G）和统计图（H）。两组比较，*P 0.05，*P 0.01（n=3）。图3低温刺激MSR1+/+和MSR1-/-小鼠14 d后小鼠脂肪组织的产热能力Figure 3The thermogenic capacity of adipose tissue of MSR1+/+and MSR1-/-mice after 14 days of cold exposureA、B：qRTPCR检测小鼠给予低温刺激14 d后，scWAT中Mrc2（A）和Mgl1（B）表达量。两组比较，*P 0.05，*P 0.01（n=6）；C、D：流式细胞术检测F4/80+CD11b+CD206+M2型巨噬细胞（C）和F4/80+CD11b+CD11c+M1型巨噬细胞（D）比例。两组比较，*P 0.05，*P 0.01（n=4）。图4低温刺激14 d MSR1+/+和MSR1-/-小鼠scWAT中M2型巨噬细胞数量Figure 4The numbers of M2 macrophage in scWAT of MSR1+/+and MSR1-/-mice after 14 days of cold exposure43210Mrc2 mRNA相对表达量*MSR1+/+25MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-643210Mgl1 mRNA相对表达量*MSR1+/+25MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*100500（F4/80+CD11b+CD206+）/（F4/80+CD11b+）（%）*MSR1+/+25MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*403020100（F4/80+CD11b+CD11c+）/（F4/80+CD11b+）（%）*MSR1+/+25MSR1-/-25MSR1+/+6MSR1-/-6*1338ABCDEFGHIJ0246810126040200体重（g）*MSR1+/+CDMSR1+/+HFDMSR1-/-CDMSR1-/-HFD时间（周）6 0004 0002 0000耗氧量 mL/（kgh）MSR1+/+CDMSR1+/+HFDMSR1-/-CDMSR1-/-HFD6：437：498：5510：0111：0712：1313：1914：4615：5216：5818：0419：1020：166：105：043：582：521：460：4023：3422：2821：2250403020100MSR1+/+HFD25UCP1 mRNA相对表达量*MSR1-/-HFD25MSR1+/+HFD6MSR1-/-HFD686420MSR1+/+HFD25Cidea mRNA相对表达量*MSR1-/-HFD25MSR1+/+HFD6MSR1-/-HFD63020100产热量 kcal/（kgh）MSR1+/+CDMSR1+/+HFDMSR1-/-CDMSR1-/-HFD6：437：498：5510：0111：0712：1313：1914：4615：5216：5818：0419：1020：166：105：043：582：521：460：4023：3422：2821：2243210MSR1+/+HFD25Cidea mRNA相对表达量*MSR1-/-HFD25MSR1+/+HFD6MSR1-/-HFD6*43210MSR1+/+HFD25Cox8b mRNA相对表达量*MSR1-/-HFD25MSR1+/+HFD6MSR1-/-HFD686420MSR1+/+HFD25UCP1 mRNA相对表达量*MSR1-/-HFD25MSR1+/+HFD6MSR1-/-HFD6*43210MSR1+/+HFD25Cox8b mRNA相对表达量*MSR1-/-HFD25MSR1+/+HFD6MSR1-/-HFD6*MSR1-/-HFD256MSR1+/+HFD256151050MSR1+/+HFD25UCP1阳性率（%）*MSR1-/-HFD25MSR1+/+HFD6MSR1-/-HFD6*A：CD和HFD连续喂养MSR1+/+和MSR1-/-小鼠12周，每周监测小鼠体重变化；B：代谢笼法监测连续喂养12周小鼠耗氧量；C：代谢笼法监测连续喂养12周小鼠产热量（n=5）；DI：qRTPCR检测高脂饮食12周的小鼠给予低温刺激7 d后，scWAT中UCP1（D）、Cidea（E）和Cox8b（F）表达量及BAT中UCP1（G）、Cidea（H）和Cox8b（I）表达量（n=6）；J：组织免疫化学检测HFD 12周的小鼠给予低温刺激7 d后，scWAT中UCP1表达情况，比例尺为50 m（n：35）。两组比较，*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001。图5低温刺激HFD喂养的MSR1+/+和MSR1-/-小鼠7 d后小鼠脂肪组织的产热能力Figure 5The thermogenic capacity of adipose tissue in MSR1+/+and MSR1-/-mice on HFD after 7 days of cold exposureBAT总RNA。结果显示，HFD 12周后，与野生型对照组相比，MSR1-/-小鼠体重增加更为显著（图5A），耗氧量和产热量降低（图5B、C）。qRTPCR结果显示，低温刺激情况下，HFD喂养的MSR1-/-小鼠脂肪组织中产热标记物（UCP1、Cidea和Cox8b）含量明显低于MSR+/+HFD 6 小鼠（图5DI）。免疫组化结果显示，置于6 条件下小鼠scWAT中UCP1表达量明显高于室温条件下小鼠；而MSR1-/-HFD 6 第43卷第10期2023年10月张天天，李金杰，柏雪雅，等.A1类清道夫受体通过促进M2型巨噬细胞极化增加脂肪组织产热能力 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1333-13411339南京医科大学学报第43卷第10期2023年10月小鼠scWAT中UCP1表达量明显低于MSR1+/+HFD6 小鼠（图5J）。结果表明，MSR1能促进肥胖小鼠脂肪组织的产热能力。2.6MSR1表达缺失显著抑制巨噬细胞条件培养基诱导小鼠前脂肪细胞分化的脂肪细胞产热能力为了进一步确认MSR1表达缺失巨噬细胞可以降低脂肪细胞产热能力，使用了巨噬细胞条件培养基（PEM）进行了离体细胞实验。应用PEM分别培养34周龄雄性MSR1+/+或MSR1-/-小鼠scWAT中的前脂肪细胞，诱导分化为成熟脂肪细胞，并提取脂肪细胞总 RNA。qRTPCR 结果显示，PEM 诱导的MSR+/+成熟脂肪细胞中UCP1和Cox8b表达量明显高于DMEM对照组；PEM诱导的MSR1-/-成熟脂肪细胞中 UCP1 和 Cox8b 表达量明显低于 PEM 诱导的MSR1+/+成熟脂肪细胞，说明巨噬细胞MSR1可以促进脂肪细胞产热能力（图6A、B）。3讨论巨噬细胞是免疫系统的重要组成部分，具有许多重要功能。它可以通过吞噬作用清除病原体，还可以通过抗原摄取和处理来调节各种病原体的适应性免疫反应9-11。已有研究指出，巨噬细胞的这些功能与其极化状态密切相关12。巨噬细胞 M1极化的特征是产生促炎细胞因子（IFN、TNF和IL1等）参与调节机体炎症反应，而巨噬细胞的M2极化则与免疫抑制、肿瘤发生、伤口修复和清除寄生虫有关。M1/M2巨噬细胞平衡极化决定了器官在炎症或损伤中的命运13-14。因此，巨噬细胞极化分型的动态平衡对治疗相关疾病具有重要意义。巨噬细胞在脂肪组织产热过程中起到关键作用。已有研究表明，钠葡萄糖共转运体（SGLT2）抑制剂通过提高脂肪利用率和促进脂肪棕色化来抑制体重增加，并通过在 scWAT 和肝脏中极化M2 型巨噬细胞来减弱肥胖引起的炎症和胰岛素抵抗15。因此，调节巨噬细胞的M1/M2极化分型是代谢相关疾病治疗的重要靶点。在单核细胞分化为巨噬细胞进程中，大量清道夫受体得以表达。其中，MSR1是一种主要在巨噬细胞中表达的模式识别受体，参与调控巨噬细胞的多种生物学功能，如参与巨噬细胞趋化募集和与其他先天受体的相互作用，以及抗原摄取、处理和呈现，调节 T 细胞