BCG感染对小鼠肺组织中NLRP3炎性小体相关分子表达的影响.pdf

第 卷 第期宁夏大学学报(自然科学版)年月V o l N o J o u r n a l o fN i n g x i aU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c eE d i t i o n)S e p 文章编号:()B C G感染对小鼠肺组织中N L R P 炎性小体相关分子表达的影响苗申奥,聂雪伊,马伯利,徐金瑞,杨易(宁夏大学 生命科学学院,宁夏 银川 )摘要:探究牛分枝杆菌减毒株卡介苗(B a c i l l u sC a l m e t t e G u r i n,B C G)感染C B L雌性小鼠后,小鼠肺组织中NO D样受体热蛋白结构域相关蛋白(N O D l i k er e c e p t o rp y r i nd o m a i n c o n t a i n i n g,N L R P)炎性小体相关分子的表达水平设置B C G感染组和对照组,B C G感染组小鼠经气管滴注B C G菌液,对照组小鼠经气管滴注P B S缓冲溶液 B C G感染 d后处死小鼠并摘取肺组织经HE染色法观察并鉴定小鼠肺组织的损伤程度,通过W e s t e r nb l o t和q R T P C R实验检测N L R P 炎性小体相关分子的表达水平结果表明,B C G感染后,小鼠肺组织发生炎性细胞浸润,N L R P,A S C,C a s p a s e ,C a s p a s e 蛋白及m R NA表达量上调,表现出极显著差异(P )表明B C G感染后,小鼠肺组织发生炎性病变,并上调N L R P 炎性小体相关分子的表达水平关键词:牛分枝杆菌减毒株卡介苗;N L R P;C B L小鼠分类号:(中图)Q 文献标志码:A收稿日期:基金项目:宁夏大学生创新创业训练计划基金资助项目(S )作者简介:苗申奥(),男,本科生,(电子信箱)q q c o m通信联系人:杨易(),女,副教授,主要从事动物生理学研究,(电子信箱)y a n g y i n x u e d u c n 结核病是一种病变主要发生在肺组织、气管、支气管和胸膜的慢性传染病 年全球约有 万人死于结核病结核分枝杆菌(M y c o m b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s,M t b)的主要宿主细胞是巨噬细胞,当M t b感染巨噬细胞会影响巨噬细胞凋亡并活化多种细胞因子表达,引发一系列炎症反应炎症对早期抑制结核分枝杆菌的繁殖与传播有积极作用,但过量的炎症因子表达也会造成肺组织损伤,破坏肺功能炎性小体相关分子的表达与肺结核病的发生和发展密切相关炎性小体(i n f l a mm a s o m e)是指通过应激、组织损伤和细胞内感染等途径激活的多蛋白复合物,是先天免疫系统中的一部分研究表明,结核分枝杆菌感染的进程与NO D样受体热蛋白结构域相关蛋白(NO D l i k er e c e p t o rp y r i nd o m a i nc o n t a i n i n gt h r e e,N L R P)和黑色素瘤缺乏因子(A b s e n t i n m e l a n o m a,A I M)的 炎 性 小 体 有 关N L R P 的结构和功能是目前研究较清楚的炎性小体 N L R P 被激活后,信号转导通路使I L ,I L 等促炎细胞因子有效释放,引发炎性反应和细胞焦亡针对肺结核的研究主要集中在结核病检测、治疗和耐药方面,对疾病的发生机制研究较少,尤其是关于免疫机制的研究牛分枝杆菌减毒株卡介苗(B a c i l l u sC a l m e t t e G u r i n,B C G)是预防结核病的减毒活疫苗,除了用于预防结核病外,还常用于炎症疾病研究研究发现,从B C G感染的巨噬细胞中提取的凋亡囊 泡,对结核 病有较好的预 防、控制作用因此B C G感染后引起的免疫反应机制研究具有重要意义笔者以B C G感染小鼠为例,对小鼠肺组织中N L R P 炎性小体相关分子进行检测,探究B C G感染对小鼠肺组织炎性病变及N L R P 炎性小体相关分子表达水平的影响,为结核病的发生、发展机制研究提供参考,并为结核病的预防提供新思路 材料与方法 试剂与仪器反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司);T r i z o l试剂(美国Am b i o n公司);q R T P C R检测试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司);B C A蛋白含量检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限 公 司);M P E R蛋 白 裂 解 液(美 国T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公司);P r o t e a s e i n h i b i t o rC o c k t a i l蛋白酶抑制剂(美国S i g m a A l d r i c h公司);一抗为第期苗申奥等:B C G感染对小鼠肺组织中N L R P 炎性小体相关分子表达的影响兔抗 鼠 a c t i n单 克 隆 抗 体(美 国P r o t e i n t e c h公司);兔抗鼠N L R P 单克隆抗体、兔抗鼠A S C单克隆抗体、兔 抗鼠C a s p a s e 单克 隆抗体(美 国C e l lS i g n a l i n gT e c h n o l o g y公司);兔抗鼠C a s p a s e 单克隆抗体(美国A b c a m公司);二抗为荧光素偶联的羊抗兔I g G抗体(美国P r o t e i n t e c h公司)实时 荧 光 定 量P C R仪(Q u a n t i t yS t u d i o,N a n o D r o p ,美国T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公司);Am e r s h a mI m a g e r 自 动 化 学 发 光 成 像 仪(美国G e n e r a lE l e c t r i cC o m p a n y公司);E n s p i r e荧光酶标仪(美国P e r k i nE l m e r公司)材料五周龄C B L雌性小鼠(江苏集萃药康生物科技股份有限公司),B C G(成都生物制品研究所)B C G感染实验对饲养一周的小鼠进行随机分组,分为B C G组与对照组,两组均为只 B C G感染组经气管滴注 L的B C G菌液(C F U/只),对照组经气管滴注相同体积的P B S缓冲液两组小鼠在温度为、湿度为 的环境下饲养每天观察小鼠状态,保证饲料与水充足每周更换垫料,并清洗饲养笼及饮水瓶 d后处死小鼠,摘取小鼠肺组织用于后续实验 肺脏组织学观察取完整肺脏置于P B S缓冲溶液中冲洗,洗掉表面血液用甲醛溶液固定 h依次进行脱水、包埋、切片和HE染色在光学显微镜下观察组织的形态学 W e s t e r nB l o t实验检测N L R P 相关分子的表达将两组小鼠的肺组织分别置于加有磁珠的 m L离心管中,加入 m L裂解液,置于液氮低温粉碎机破碎至无明显组织残留于,r/m i n离心分离 m i n,收集上层清液通过B C A检测试剂盒测定蛋白的浓度,然后定量加入缓冲液,置于沸水浴中m i n,在 下保存备用 g蛋白经S D S P AG E电泳,湿转至P V D F膜上,用含脱脂奶粉的T B S试剂于室温封闭h,再用T B S试剂洗涤遍 过夜孵育提前稀释好的 a c t i n,N L R P,A S C,C a s p a s e,C a s p a s e 一 抗,分 别 用T B S T,T B S洗涤遍;室温孵育二抗h,分别用T B S T,T B S洗涤遍加入化学发光液(E C L),通过化学发光检测仪(G E)检测并记录蛋白条带 q R T P C R实验检测N L R P 相关分子的转录T r i z o l法提取小鼠肺组织中mR NA,按照逆转录试剂盒说明书将mR NA逆转录为c D NA再按照q R T P C R试剂盒说明书加入引物、B u f f e r缓冲液、无核酸酶水及c D NA混匀后进行P C R扩增反应,通过 c t法对扩增结果进行分析所用引物为自主设计(表)表q R T P C R实验所用引物基因引物序列()产物长度/b p a c t i nF:G T G C T A T G T T G C T C T A G A C T T C GR:A T G C C A C A G G A T T C C A T A C C N L R P F:G C C C T C T A C G T C T T C T T C C T T T C CR:C A T C C G C A G C C A G T G A A C A G A G A S CF:C A C T C A T T G C C A G G G T C A C A G A A GR:C T C A T C T T G T C T T G G C T G G T G G T C C a s p a s e F:A T A C A A C C A C T C G T A C A C G T C T T G CR:T C C T C C A G C A G C A A C T T C A T T T C T C C a s p a s e F:G A C T T A G G C T A C G A T G T G G T G G T GR:A T G T G C T G T C T G A T G T C T G G T G T T C 数据分析数据均进行次独立实验验证,使用G r a p h P a dP r i s m 进行数据分析 结果 B C G感染后肺组织的病理学改变收集小鼠肺组织HE染色切片(图)与对照组相比,B C G感染组的肺组织明显充血,并伴有肺泡间隔消失,有类上皮细胞增生和炎性细胞浸润出现,表明B C G感染引起小鼠肺组织炎症病理损伤图 B C G感染后肺组织病理学的变化(H E染色,放大 倍)B C G感染后N L R P 等蛋白表达水平W e s t e r nB l o t实验检测结果表明(图):B C G感染组中的N L R P 炎性小体成分(N L R P,A S C,C a s p a s e ),与C a s p a s e 蛋白的表达水平较对照组上调,为差异极显著(P )B C G感染后N L R P 等转录水平的变化q R T P C R实验结果显示(图):与对照组相比,B C G感染组中的N L R P,A S C,C a s p a s e ,C a s p a s e 的m R N A转录水平均显著增高(P )宁夏大学学报(自然科学版)第 卷a NLRP300.20.40.6BCG44 EGc Caspase1BCG4400.20.40.60.8 EGb ASCBCG4400.20.40.6 EGd Caspase11BCG4400.20.40.6 EG图B C G感染后N L R P 等蛋白的表达水平a NLRP3c Caspase1d Caspase11b ASC01234 EBCG44 E012345BCG44 E02468BCG44 E0246BCG44图B C G感染后N L R P 等的m R N A转录水平变化 讨论目前,卡介苗是世界卫生组织(WHO)唯一批准使用且可有效预防结核病的疫苗由于卡介苗的防预效果并不十分理想,并且随着人口流动增加、人类免疫缺陷病毒(h u m a ni mm u n o d e f i c i e n c yv i r u s,H I V)与结核杆菌伴发感染以及结核杆菌多重耐药性菌株的出现,全球结核病疫情回升,特别是新冠感染大流行对结核病的防治有很大的影响因此,对有效的结核病疫苗和新型检测手段的需求越来越迫切目前,结核病疫苗的研发主要致力于对B C G进行改造及开发新型疫苗,如亚单位疫苗、D NA疫苗、活载体疫苗等通过基因工程技术等手段改造B C G可产生不同的B C G突变株,这是一种十分有效的方式,目前研发的r B C G(m b t),r B C G(p a n C D),r B C G等已取得很大进展对于新型疫苗的研发,重点是寻找更安全、有效的抗原和新的靶点无论从何种角度考虑,都需对结核病的免疫机制有更多的了解,但目前对于B C G引起的机体免疫机制研究还没有系统的报道肺泡巨噬细胞作为结核分枝杆菌入侵机体肺组织的主要宿主细胞,也是机体免疫系统的重要组成部分在结核分枝杆菌感染的起始阶段,巨噬细胞可吞噬并抑制结核分枝杆菌的生长当成功抵抗巨噬细胞的攻击后,结核菌在未活化的巨噬细胞内大量增殖,逐渐使巨噬细胞分化、聚集待组织出现干酪样坏死时,被侵染的巨噬细胞被机体免疫机制杀灭,释放出大量的结核菌在引发炎性因子释放的同时,结核菌入侵其他组织细胞(如纤维细胞、淋巴细胞和上皮样细胞等)这一系列变化使组织病理不断加重、病变范围扩大,最终形成组织空洞该研究中经气管滴注B C G的方法感染小鼠,造成小鼠肺组织的免疫病理损伤梁粟等使B C G感染C B L小鼠,造成小鼠肺组织出现单核淋巴细胞浸润并呈现灶性分布、局灶上皮脱失、肺泡间隔弥散增宽及肺泡毛细血管扩张淤血等病理变化,这与本文的研究结果一致HE染色实验的结果显示,B C G感染与结核分枝杆菌感染的结果相同 W e s t e r nB l o t实验结果显示,B C G感染组中的N L R P 炎性小体相关蛋白表达量增加 q R T P C R实验也验证了这一结果对于结核菌感染后N L R P 炎性小体活化的确切机制问题,目前还没有定论,主要有种观点:一是与结核菌的E S X 系统有关 E S X 系统在结核菌抵抗机体清除功能的免疫逃逸机制中发挥关键作用 但作为减毒株的B C G,与结核菌相比,其显著特点是基因组中缺失了R D 区,而E S X 相关基因就位于R D 区 二是破损组织的细胞内容物释放到细胞质中引起N L R P 炎性小体活化三是由线粒体活性氧引起的该实验结果显示,在B C G感染后,小鼠肺组织中C a s p a s e 的表达上调 T L R/T R I F/I R F通路也是炎症介质的典型通路,研究表明,T L R/T R I F/I R F通路能激活C a s p a s e 并进一步激活N L R P 炎性小体 NO D,R I P 通过对R O S的调节来激活C a s p a s e ,随后进一步引起N L R P 炎性小体活化 研究显示 ,C a s p a s e 激活后会破坏细胞膜的结构造成钾离子外流,引起N L R P 炎性小体活化,这与结核菌E S X 系统激活N L R P 炎性小体的原理相似 当机体出现炎症时,激活的信号通路不止条,且各信号通路间都相互交联,这也是结核病研究的难点之一 B C G感染后,C a s p a s e 与N L R P 炎性小体究竟如何激活及其两者之间的联系,还有待进一步的深入研究 结论B C G感染C B L小鼠,引起与结核分枝杆菌感染相似的免疫病理损伤,并诱导N L R P 炎性小体 的 表 达 量 增 加同 时,N L R P 炎 性 小 体 与C a s p a s e 蛋白之间可能存在交联应答的关系第期苗申奥等:B C G感染对小鼠肺组织中N L R P 炎性小体相关分子表达的影响参考文献:卢春容,房宏霞,陆普选,等 WHO 年全球结核病报告:全球与中国关键数据分析J新发传染病电子杂志,():刘丽婷,吴利先,王国富炎症小体在结核分枝杆菌感染中的作用研究进展J中国病原生物学杂志,():杨斯迪,邓奇峰,黄瑞,等炎性小体激活与细胞焦亡的研究进展J微生物与感染,():W I NAUF,WE B E RS,S A DS,e t a l A p o p t o t i cv e s i c l e sc r o s s p r i m eC D Tc e l l sa n dp r o t e c ta g a i n s tt u b e r c u l o s i sJ I mm u n i t y,():王巧智,龚德华结核病疫情现状和控制策略J实用预防医学,():姜秀云,方诗文,姚宇,等结核病疫苗及其在动物应用中的研究进展J经济动物学报,():TU L L I U SM V,HA R TH G,MA S L E S A GA L I CS,e t a l AR e p l i c a t i o n L i m i t e dr e c o m b i n a n tm y c o b a c t e r i u mb o v i sB C Gv a c c i n e a g a i n s t t u b e r c u l o s i sd e s i g n e d f o rh u m a n i mm u n o d e f i c i e n c yv i r u s p o s i t i v ep e r s o n s i s s a f e ra n d m o r ee f f i c a c i o u st h a n B C GJ I n f e c tI mm u n,():N I E UWE NHU I Z E NNE,KU L KA R N IPS,S HA L I G R AM U,e ta l T h er e c o m b i n a n tb a c i l l eC a l m e t t e G u r i nv a c c i n eV PM :R e a d yf o rc l i n i c a le f f i c a c yt e s t i n gJ F r o n t I mm u n o l,:岳华山,谢松梅,于毅,等肺结核的保护性免疫和免疫病理机制进展J黑龙江医学,():梁粟,吴芳,程青虹,等新型结核病疫苗菌株在小鼠体内的毒性及安全性研究J中国病原生物学杂志,():王健宏,徐兆坤,李武炎性小体的激活机制及其在机体抗结核分枝杆菌中的作用研究进展J畜牧兽医学报,():唐晓萌,王大成结核分枝杆菌E S X 分泌蛋白E s p B结构和功能分析J生物化学与生物物理进展,():孟凡爽分枝杆菌R D 区部分基因重组卡介苗的构建及 其 免 疫 活 性 的 研 究 D长 春:吉 林 农 业 大学,CAS ECL,KOHLERLJ,L I MAJB,e ta l C a s p a s e s t i m u l a t e sr a p i df l a g e l l i n i n d e p e n d e n tp y r o p t o s i si nr e s p o n s et oL e g i o n e l l ap n e u m o p h i l aJP r o cN a t lA c a dS c iU S A,():LUP F E RCR,ANANDPK,L I UZ h i p i n g,e t a l R e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sr e g u l a t ec a s p a s e e x p r e s s i o na n da c t i v a t i o no ft h en o n c a n o n i c a lN L R P i n f l a mm a s o m ed u r i n ge n t e r i cp a t h o g e ni n f e c t i o nJP L o SP a t h o g,():e MA THU R A,HA YW A R DJA,MA NS i m i n g M o l e c u l a rm e c h a n i s m so f i n f l a m m a s o m es i g n a l i n gJ J o u r n a lo fL e u k o c y t eB i o l o g y:A nO f f i c i a lP u b l i c a t i o no ft h eR e t i c u l o e n d o t h e l i a lS o c i e t y,():RHLS,B R O ZP C a s p a s e a c t i v a t e sa c a n o n i c a lN L R P i n f l a mm a s o m eb yp r o m o t i n g K()e f f l u xJ E u rJ I mm u n o l,():WA S S E RMANNR,G U L E N MF,S A L AC,e t a l M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i sd i f f e r e n t i a l l y a c t i v a t e sc GA S a n d i n f l a mm a s o m e d e p e n d e n t i n t r a c e l l u l a r i m m u n er e s p o n s e st h r o u g h E S X J C e l l H o s t M i c r o b e,():E f f e c t o fB C GI n f e c t i o no nE x p r e s s i o no fN L R P I n f l a mm a s o m e a s s o c i a t e dM o l e c u l e s i nL u n gT i s s u eo fM i c eM i a oS h e na o,N i eX u e y i,M aB o l i,X uJ i n r u i,Y a n gY i(S c h o o l o fL i f eS c i e n c e,N i n g x i aU n i v e r s i t y,Y i n c h u a n ,C h i n a)A b s t r a c t:T h e e x p r e s s i o no fNO D l i k e r e c e p t o rp y r o nd o m a i nc o n t a i n i n g(N L R P)i n f l a mm a s o m e r e l a t e dm o l e c u l e si nt h el u n gt i s s u eo fC B Lf e m a l em i c ei n f e c t e dw i t hB a c i l l u sC a l m e t t eG u e r i n(B C G)w a si n v e s t i g a t e d T h eB C Gi n f e c t i o ng r o u pa n d t h e c o n t r o l g r o u pw e r e s e tu p A f t e r t h eB C Gg r o u pm i c ew e r ei n s t i l l e dw i t hB C Gb a c t e r i a l s o l u t i o nb yt r a c h e a l i n s t i l l a t i o na n dt h ec o n t r o l g r o u pm i c ew e r e i n s t i l l e dw i t hP B S,b o t hw e r e f e dt o g e t h e rn o r m a l l y T h em i c ew e r ek i l l e d d a y sa f t e rB C Gi n f e c t i o na n d l u n gt i s s u e sw e r er e m o v e d T h ed e g r e eo fl u n gd a m a g ew a so b s e r v e da n di d e n t i f i e db y HEs t a i n i n ga n ds e c t i o n i n ge x p e r i m e n t s W e s t e r nb l o t t i n ga n dq R T P C Rw e r eu s e dt od e t e c t t h ee x p r e s s i o no fN L R P i n f l a mm a s o m er e l a t e dm o l e c u l e s T h er e s u l t ss h o wt h a t i n f l a mm a t o r yc e l l i n f i l t r a t i o no c c u r r e d i nt h e l u n gt i s s u eo fm i c ei n f e c t e dw i t hB C G,a n dt h ee x p r e s s i o no fp r o t e i na n dmR NAo fN L R P,A S C,C a s p a s e a n dC a s p a s e w e r eu p r e g u l a t e d,w i t hs i g n i f i c a n td i f f e r e n c e(P )B C Gi n f e c t i o nc a ni n d u c e l u n gi n f l a mm a t i o ni nm i c e,a n du p r e g u l a t e t h ee x p r e s s i o no fN L R P i n f l a mm a s o m er e l a t e dm o l e c u l e sa t t h em o l e c u l a r l e v e l K e yw o r d s:B a c i l l u sC a l m e t t e G u r i n;N L R P;C B Lm i c e(责任编辑高继红)