5种致泻大肠埃希氏菌不同浓度下的国标法检出率分析.pdf

Oct.2023 CHINA FOOD SAFETY 95分析检测5 种致泻大肠埃希氏菌不同浓度下的 国标法检出率分析胡春红，陆其聪*（四川省轻工业研究设计院有限公司，四川成都 610081）摘要：目的：研究 5 种致泻大肠埃希氏菌使用 GB 4789.62016 法检测时，不同初始浓度下，二次增菌取不同接种体积的检出率。方法：不同初始浓度下（1 3 CFUmL-1，10 30 CFUmL-1，100 300 CFUmL-1）的 5 种致泻大肠埃希氏菌加入营养肉汤增菌后，取不同体积（10 L、50 L、100 L、500 L、1 000 L）的预增菌液接种于肠道增菌肉汤管中，培养后划线于伊红美蓝琼脂（Eosin-Methylene Blue，EMB）和麦康凯琼脂（MacConkey Agar，MAC）平板，观察并记录平板中菌落生长情况，计算检出率。结果：5 种致泻大肠埃希氏菌接种量在 10 CFU 及以上时，二次增菌时取 10 L 预增菌液至肠道增菌肉汤中，均能检出。5 种致泻大肠埃希氏菌接种量在 1 3 CFU 时，二次增菌时取 10 L 和 50 L 预增菌液至肠道增菌肉汤中，平均检出率均不能达到 100%；二次增菌时接种体积增加到 100 L 时，肠道集聚性大肠埃希菌EAEC（CICC24186）、肠出血性大肠埃希菌 EHEC（CICC24187）、产肠毒素大肠埃希菌 ETEC（CICC24190）的检出率能达到 100%，而肠道侵袭性大肠埃希菌 EIEC（CICC24188）、肠道致病性大肠埃希菌 EPEC（CICC24189）的检出率仍不能达到 100%。结论：在实际检测工作中，在所检样品中致泻大肠埃希氏菌含量较低时，可以考虑增加二次增菌的接种量，减少漏检可能。关键词：致泻大肠埃希氏菌；国家标准方法；检出率Analysis of the Detection Rate of 5 Kinds of Diarrheagenic Escherichia Coli at Different Concentrations by National Standard MethodHU Chunhong,LU Qicong*(Sichuan Light Industry Research and Design Institute Co.,Ltd.,Chengdu 610081,China)Abstract:Objective:To study the detection rates of 5 types of diarrhea causing Escherichia coli using the GB 4789.62016 method at different initial concentrations and different inoculation volumes for secondary enrichment.Method:Five types of diarrhea causing Escherichia coli at different initial concentrations(1 3 CFUmL-1,10 30 CFUmL-1,100 300 CFUmL-1)were added to nutrient broth for enrichment,and different volumes(10 L,50 L,100 L,500 L,1 000 L)inoculate the pre enrichment solution into the intestinal enrichment broth tube,and after cultivation,line it on eosin methylene blue(EMB)and macconkey agar(MAC)plates.Observe and record the bacterial colony growth in the plates,and calculate the detection rate.Result:When the inoculation amount of 5 types of diarrhea causing Escherichia coli was 10 CFU or above,10 L of pre enriched liquid was taken into the intestinal enrichment broth during the second enrichment,and all of them could be detected.When the inoculation amount of 5 types of diarrhea causing Escherichia coli is 1 3 CFU,10 L and 50 L of pre enriched liquid are taken during the second enrichment into the intestinal enrichment broth,and the average detection 作者简介：胡春红（1991），女，四川内江人，本科，助理工程师。研究方向：食品微生物检验检测。通信作者：陆其聪（1987），女，四川内江人，硕士，工程师。研究方向：食品微生物检验检测。E-mail:。96 食品安全导刊 2023年10月（上）分析检测rate cannot reach 100%;when the inoculation volume increases to 100 L during the second enrichment,the detection rates of E.coli EAEC(CICC24186),E.coli EHEC(CICC24187),and E.coli ETEC(CICC24190)can reach 100%,while the detection rates of invasive E.coli EIEC(CICC24188)and pathogenic E.coli EPEC(CICC24189)cannot reach 100%.Conclusion:In practical testing work,when the content of Escherichia coli causing diarrhea in the tested samples is low,it can be considered to increase the inoculation amount of secondary enrichment to reduce the possibility of missed detection.Keywords:diarrheagenic Escherichia coli;national standard law;detection rate致泻大肠埃希氏菌是一类重要的食源性病原体，是引起肠道疾病相关的食源性疾病的主要病原菌，可导致人或动物腹泻、腹痛甚至出血性腹泻1-2。常见的引起人类发病的致泻大肠埃希氏菌有 5 种，包括肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌（或称为肠出血性大肠埃希氏菌）与肠道聚集性大肠埃希氏菌3-4。致泻大肠埃希氏菌存在于人和动物的肠道中，人群普遍易感，会引起急性胃炎、急性菌痢、出血性肠炎等多种疾病，传播方式多种多样，包括饮用水、食物、日常生活用品、蚊蝇昆虫传播等5。食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量（GB 299212021）6规定肉制品（仅适用于牛肉制品、即食生肉制品、发酵肉制品类）、即食果蔬制品（仅适用于去皮或预切的水果及上述类别混合食品）中，致泻大肠埃希氏菌不得检出。此类食品易受食品从业人员和食材本身的微生物污染，且一旦污染，微生物繁殖速度较快。在对食品从业人员和公共场所从业人员进行卫生检测时，致泻大肠埃希氏菌的检出率明显高于沙门氏菌和志贺氏菌7。近年来，致泻性大肠埃希氏菌在急性腹泻粪标本中的检出率有所增加8-9。致泻性大肠埃希氏菌引起的食品安全问题对人类健康和社会经济造成了严重的影响10。食品中致泻大肠埃希氏菌的检测是预防和控制由该菌引起的食源性疾病的关键11。近年来，大多学者致力于研究致泻大肠埃希氏菌的致病机制和分子生物技术，而对标准中样品前处理方法的研究较少，有文献中写明当进行阳性对照时，染菌量应控制在每 25 g 样品中含 10 100 CFU 活菌，但对选择此浓度的原因没有提及12。本次实验主要研究采用食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验（GB 4789.62016）（以下简称国标法）检测时染菌量的范围，以及在较低染菌量时是否能检出病原菌。1材料与方法1.1材料与试剂标 准 菌 株：产 肠 毒 素 大 肠 埃 希 菌 ETEC（CICC24190）、肠 道 侵 袭 性 大 肠 埃 希 菌 EIEC（CICC24188）、肠 道 致 病 性 大 肠 埃 希 菌 EPEC（CICC24189）、肠 道 集 聚 性 大 肠 埃 希 菌 EAEC（CICC24186）、肠 出 血 性 大 肠 埃 希 菌 EHEC（CICC24187），均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；脑心浸出液肉汤（Brain Heart Infusion，BHI）、营养肉汤、肠道增菌肉汤、麦康凯琼脂（MacConkey Agar，MAC）、伊 红 美 蓝 琼 脂（Eosin-Methylene Blue，EMB），均购于广东环凯微生物科技有限公司。1.2仪器与设备恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Bio-II-Advance4 生物安全柜，Telstar；微量移液枪（10 100 L、100 1 000 L），eppendorf。1.3实验方法1.3.1前增菌将 5 种致泻大肠埃希氏菌标准菌株分别接种于 BHI，（361）培养 18 h。用无菌磷酸盐缓冲液将 5 种致泻大肠埃希氏菌的菌液浓度稀释至 1 3 CFUmL-1、10 30 CFUmL-1、100 300 CFUmL-1，视为样品原液。分别取上述 3 种浓度的样品原液 1 mL 加于 250 mL 营养肉汤中，于（361）培养 6 h 后，取预增菌液接种于 30 mL肠道增菌肉汤管中，接种体积为 10 L、50 L、100 L、500 L、1 000 L，每个体积接种 10 管，于（421）培养 18 h。1.3.2分离培养将增菌液分别划线于 EMB 和 MAC 平板，于（361）培养 24 h，观察并记录平板上的菌落生长情况。在 MAC 琼脂平板上，分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色，不分解乳糖的菌落为无色或淡粉Oct.2023 CHINA FOOD SAFETY 97分析检测色；在 EMB 琼脂平板上，分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽，不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色，有典型菌落生长即视为检出。因本次实验中只加入标准菌株，所用耗材、培养基均按规定要求灭菌处理，没有杂菌干扰，故不再进行后续生化鉴定和 PCR 确证实验。实验重复 1 次。2结果与分析两次实验结果中 5 种致泻大肠埃希氏菌接种量为10 30 CFU 和 100 300 CFU 时，二次增菌的接种体积在 10 L、50 L、100 L、500 L、1 000 L 时均能检出。因此，当其接种量大于 10 CFU 时，按国标法二次增菌取 10 L 的接种量均能检出。5 种致泻大肠埃希氏菌接种量为 1 3 CFU 时，二次增菌时的接种体积只在 500 L、1 000 L 时能全部检出，检出率为 100%。5 种致泻大肠埃希氏菌接种量为 1 3 CFU，接种体积为 10 L、50 L、100 L 的检出结果见表 1，二次增菌时取 10 L 或 50 L 预增菌液至肠道增菌肉汤中，其平均检出率均不能达到 100%；二次增菌接种体积增加到100 L时，EAEC（CICC24186）、EHEC（CICC24187）、ETEC（CICC24190）的检出率能达到100%，而EIEC（CICC24188）、EPEC（CICC24189）的检出率仍不能达到 100%。由此，当所检样品中致泻大肠埃希氏菌含量较低时，采用国标中规定的取 10 L预增菌液接种于肠道增菌肉汤中进行二次增菌，漏检可能性较大。3结论与讨论国标中预增菌培养基营养肉汤（用于一般细菌培养、转种、复壮、增菌等）无选择性，其预增菌时间6 h 较短，有利于目标菌的筛选，二次增菌培养基为肠道增菌肉汤（用于肠道菌的增菌培养，可以抑制非肠杆菌科细菌的生长），增菌时间 18 h 较长，可以修复有损伤的目标菌，但也可能导致杂菌过多，不利于目标菌检出13。二次增菌取样量只取 10 L 也可能是基于为增加目标菌检出率的考虑，但当检测样品中致泻大肠埃希氏菌的含量比较低时，二次增菌取 10 L 的接种体积存在漏检可能。此次实验中只考虑了接种标准菌株时的检出率，而实际样品中可表 15 种致泻大肠埃希氏菌不同接种体积下的检出率菌种编号菌液浓度/（CFUmL-1）接种 体积/L实验 管数/管12检出管数/管检出率/%检出管数/管检出率/%EAEC（CICC24186）1 31010660660501010100880100101010010100EHEC（CICC24187）1 31010440220501010100770100101010010100EIEC（CICC24188）1 31010110110501055066010010880990EPEC（CICC24189）1 310100011050106605501001077010100ETEC（CICC24190）1 31010770660501010100880100101010010100能包含若干种其他微生物，各种微生物在检测过程中都会繁衍增殖，其实际检出率受其他微生物影响可能会更低。因此，在实际检测工作中，在所检样品中微生物含量较低时，可考虑增加二次增菌的接种量，减少漏检可能。在实际检测工作中，由于样品中多种微生物的干扰，还需要进行后续生化鉴定和 PCR 确证实验才能判定。参考文献1AIJUKA M,BUYS E M.Persistence of foodborne diarrheagenic Escherichia coli in the agricultural and food production environment:implications for food safety and public（下转第 104 页）104 食品安全导刊 2023年10月（上）分析检测2 李美玲,刘娅,张乾.提高食品安全监督抽检有效性的路径研究 J.现代食品,2023,29(1):126-128.3 于平,顾宝东.食品安全与食品技术壁垒 J.中国对外贸易,2004(11):86-87.4 张秀玲.中国农产品农药残留成因与影响研究 D.无锡:江南大学,2013.5KEIKOTLHAILE B M,SPANOGHE P,STEURBAUT W.Effects of food processing on pesticide residues in fruits and vegetables:a meta-analysis approachJ.Food and Chemical Toxicology,2010,48(1):1-6.6 中华人民共和国农业部.蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定:NY/T 7612008S.北京:农业出版社,2008.7 中华人民共和国国家卫生健康委员会,农业农村部,国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 植物源性食品中 9 种氨基甲酸酯类农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱-柱后衍生法:GB 23200.1122018S.北京:中国农业出版社,2018.8 中华人民共和国国家卫生健康委员会,农业农村部,国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 植物源性食品中 208 种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法:GB 23200.1132018S.北京:中国标准出版社,2018.9 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,农业部,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 水果和蔬菜中 500 种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法:GB 23200.82016S.北京:中国农业出版社,2016.10 中华人民共和国国家卫生健康委员会,农业农村部,国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 植物源性食品中 331 种农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱质谱联用法:GB 23200.1212021S.北京:中国标准出版社,2021.11 李俊霞,马丽雅,林河通,等.果蔬中农药残留检测分析研究进展 J.江苏农业科学,2021,49(6):1-9.12 禹长海,杨燕,林治钰,等.2019 年度山东省食品安全监督抽检数据统计分析 J.食品安全质量检测学报,2020,11(21):8131-8140.13 易锡斌.蔬菜中五种主要农药残留检测方法及降解规律研究 D.泰安:山东农业大学,2015.healthJ.Food Microbiology,2019,82:363-370.2 张彩文,李金霞,陈怡文,等.致泻大肠埃希氏菌检验用标准菌株的研究 J.食品与发酵工业,2020,46(23):68-73.3JESSER K J,LEVY K.Updates on defining and detecting diarrheagenic Escherichia coli pathotypesJ.Current Opinion in Infectious Diseases,2020,33(5):372-380.4 国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验:GB 4789.62016S.北京:中国标准出版社,2016.5 王利,洪颖,陈谨,等.安徽省马鞍山市 20142018 年腹泻患者中致泻性大肠埃希菌病原学及流行特征分析 J.疾病监测,2019,34(11):1010-1016.6 中华人民共和国国家卫生健康委员会,国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量:GB 299212021S.北京:中国标准出版社,2021.7 邓艳华.食品和公共场所从业人员致泻性大肠埃希菌携带情况分析 J.实验与检验医学,2015,33(2):161-162.8ROBINSBROWNE R M,HARTLAND E L.Escherichia coli as a cause of diarrheaJ.J Gastroenterol Hepatol,2002,17(4):467-475.9 王蒋丽,刘淑晨,马合金,等.食品中致泻性大肠埃希氏菌污染状况及耐药分析 J.医学动物防制,2018,34(3):228-230.10 黄昭鸿,黄运红,黄艳梅,等.分型检测致泻性大肠埃希菌 PCR 技术研究进展 J.中国生物工程杂志,2020,40(7):82-90.11 刘莉,魏海燕,王紫薇,等.3 种方法检测食品中致泻大肠埃希氏菌检测能力验证结果分析 J.食品安全质量检测学报,2020,11(17):6086-6092.12 库文娟,程强,王洁.致泻大肠埃希氏菌检验操作要点及质量控制研究 J.现代食品,2022,28(19):23-25.13 孟静,钟立霞,郭颖慧,等.国内外致泻大肠埃希氏菌 O157:H7 的检测标准比较及建议 J.中国乳业,2023(4):76-81.（上接第 97 页）